1 - aula pratica 1_ Extração, padronização e identificação de fármacos por CCD

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EXTRAÇÃO, PADRONIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS POR CCD 
 
I. INTRODUÇÃO 
A cromatografia é um dos métodos de análise que tem grande utilização devido a sua facilidade 
em efetuar a separação; identificação e quantificação das espécies químicas por si mesma ou em 
conjunto com outras técnicas instrumentais de análise; assim como fácil execução em breve espaço 
de tempo e baixo custo. É uma técnica que separa os componentes por diferença de peso molecular; 
carga iônica e afinidade. 
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura 
realizada através da distribuição destes entre duas fases; uma permanece estacionária (fase 
estacionária); enquanto que a outra se move através da placa (fase móvel). Durante a passagem da 
fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases 
de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, de acordo 
com sua afinidade, resultando em migrações diferenciais desses componentes. 
A cromatografia de camada delgada (CCD, cromatografia em coluna) fundamenta-se em 
processos físicos de adsorção. Utiliza-se uma fase estacionária sólida; sílica (finamente dividida, 
empregada na separação de compostos lipofílicos, como por exemplo, os aminoácidos) ou alumina, e 
uma fase móvel liquida ou gasosa, como por exemplo, o fenol. A adsorção do soluto ocorre na 
interface entre o sólido e a fase móvel, devido à presença de grupos ativos nas suas superfícies. O 
equilíbrio entre a fase estacionaria e a fase móvel justifica a separação dos diferentes solutos. 
A cromatografia de camada delgada é uma técnica rápida, barata e simples; e das mais 
utilizadas rotineiramente. Sua desvantagem é a baixa precisão na quantificação. 
Sob condições bem estabelecidas, um dado composto percorre sempre uma distancia fixa em 
relação a distância percorrida pela fase móvel. Esta relação é denominada de valor do Rf (Fator de 
retenção) fundamentada na razão da distância percorrida pela substancia (ds) pela distância percorrida 
pela fase móvel (dm), conforme mostra a Figura 2 abaixo: 
 
 
 
Instituto de Ciências da Saúde 
Disciplina: Análises Toxicológicas 
Curso: Farmácia e Biomedicina 
Profa: Fernanda M.P.G.Ernandes 
 
 
AULA PRÁTICA 
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II. OBJETIVO 
Avaliar o emprego da cromatografia em camada delgada como método analítico qualitativo 
para o diagnóstico laboratorial rápido das intoxicações causadas pela exposição do organismo a 
fármacos ou drogas de abuso 
 
III. A - MATERIAIS PARA A AULA 
▪ Padrão: ácido salicílico 0,5% 
▪ Urina: pura e urina contaminada com ácido salicílico. 
▪ Agente cromogênico: Solução de cloreto férrico (FeCl3) 5% 
▪ Solvente orgânico: Éter:clorofórmio (1:3) 
▪ Sistema solvente: Cuba ácida: clorofórmio:acetona (9:1) 
 
IV - EQUIPAMENTOS 
▪ Funil de separação (125 mL) 
▪ Bastão de vidro 
▪ Funil de vidro capacidade 100 mL 
▪ Béquer 100 mL 
▪ Cálice 25 mL 
▪ Papel Universal pH 
▪ placas cromatográficas de sílica gel (0,25 mm de espessura) 
▪ Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 
▪ Cubas de vidro 
▪ Nebulizadores 
 
V . PROCEDIMENTO 
 
A. PADRONIZAÇÃO DO ÁCIDO SALICÍLICO (0,5%) 
1. Em balão volumétrico de 25 mL, preparar a amostra padrão de ácido salicílico 0,5%. 
(PROCEDIMENTO JÁ REALIZADO PELO LABORATÓRIO) 
 
B. EXTRAÇÃO DE ÁCIDO SALÍCILICO EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS (URINA) 
 
1. Observar o frasco/coletor contendo a amostra identificada como Urina 1 
 
• O laboratório deixará um frasco com urina + AAS (contaminar a urina) em cada bancada (9 
frascos no total). 
• O laboratório deixará um frasco com urina sem AAS (padrão) para o professor (1 frasco no 
total) 
 
2. Ler o pH da amostra 
 
3. Ajustar o pH entre 4,0 e 5,0 por meio de solução de H2SO4 1% (SOLUÇÃO JÁ FEITA PELO 
LABORATÓRIO) 
. 
 
4. Medir 10 mL da amostra em um cálice e colocá-la em funil de separação (125 mL), já fixado em 
suporte universal e identificado como o nome da amostra. 
 
5. Com uma proveta, medir 20 mL do solvente orgânico composto pela mistura clorofórmio:éter (3:1), 
agitando vigorosamente o funil por 1 minuto. (PROCEDIMENTO JÁ REALIZADO PELO 
LABORATÓRIO) 
 
▪ Verter a mistura no funil de separação, já contendo a amostra (urina) a ser analisada. 
▪ Agitar vigorosamente o funil por 1 minuto. Para isso inverter o funil de separação e abrir sua 
torneira para sair o gás formado durante o momento da agitação. 
 
6. Colocar o funil de separação em suporte universal e deixá-lo em repouso por 2 minutos para a 
separação das fases. 
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7. Filtrar a camada orgânica: 
▪ Colocar algodão em funil de vidro. 
Umedecer o algodão com 12 mL da mistura clorofórmio: éter (3:1). (JÁ REALIZADO PELO 
LABORATÓRIO) 
▪ Com auxílio de pipeta medir o volume desejado e colocá-lo em um cálice. 
Posteriormente umedecer o algodão com 10 mL de Na2SO4 1% anidro (JÁ REALIZADO PELO 
LABORATÓRIO) , contido em um cálice. 
▪ Recolher a camada orgânica (extrato) em béquer e identificá-lo com o nome da amostra. 
 
8. Desprezar o remanescente aquoso que ficou no funil de separação. 
 
9. Repetir os itens 5 e 6 
▪ (5) Extrair com 20 mL do solvente orgânico composto pela mistura clorofórmio:éter (3:1) (15 mL 
de clorofórmio e 5 mL de éter), agitando vigorosamente o funil por 1 minuto. 
▪ (6) Colocar o funil em suporte universal e deixá-lo em repouso por 2 minutos para a separação 
das fases. 
 
10. Recolher a camada orgânica (extrato) no mesmo béquer identificado com o nome da amostra. 
 
11. Desprezar o remanescente aquoso que ficou no funil de separação. 
 
12. Evaporar o solvente à secura até que se obtenha o resíduo (Ra= ácido). 
 
13. Adicionar 15 gotas de clorofórmio no resíduo ácido e seguir o procedimento C (Identificação). 
 
 
C. IDENTIFICAÇÃO DE ÁCIDO SALICÍLICO POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA 
(CCD) 
1. Escrever na parte superior de cada placa cromatográfica (cromatoplaca) o nome da amostra 
(amostra padrão, resíduos ácidos obtidos na urina) que será identificada por Cromatografia em Calada 
Delgada (CCD). 
 
2. Na parte inferior de cada cromatoplaca, já identificada, aplicar a amostra por capilaridade (amostra 
padrão, urina). 
 
3. Colocar as cromatoplacas na cuba de desenvolvimento previamente saturada contendo o sistema 
solvente clorofórmio - acetona (9:1), composto por 90 mL de clorofórmio e 10 ml de acetona. (JÁ 
REALIZADO PELO LABORATÓRIO) 
 
4. Após o desenvolvimento das cromatoplacas (10 cm), retirá-las da cuba e deixá-las à temperatura 
ambiente para a completa evaporação do solvente. 
 
5. A seguir revelar em nebulizador as cromatoplacas com o agente cromogênico (solução de cloreto 
férrico (FeCl3) 5%). (JÁ REALIZADO PELO LABORATÓRIO) 
 
VI. RESULDADOS 
1. Expressar os resultados segundo a forma da mancha, cor da mancha e Rf. 
 
2. A CCD mostrou ser uma técnica adequada para identificar o fármaco presente nas amostras 
biológicas? Justifique sua resposta: 
 
 
VIII. CONCLUSÃO