Aula 05 replicação do DNA

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Lindomar Pena 
DVM, PhD 
Principal Investigator at Fiocruz/PE 
lindomar.pena@cpqam.fiocruz.br 
 
 ® Todos os direitos reservados. Material de uso exclusivo dos alunos matriculados na disciplina 
Biologia Molecular. Proibida a reprodução total ou parcial deste material sem a autorização por 
escrito do professor. 
Programa de Pós-Graduação em 
Biociências e Biotecnologia em Saúde 
Disciplina:Biologia Molecular (BioMol) 
Tópico 5 
 
Replicação do DNA 
• Capítulo 5 de ZAHA, A. et al. Biologia Molecular Básica. 3ª ed. 
Porto Alegre, Editora Mercado Aberto, 2003. 
• Capítulo 5 de ALBERTS B., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., 
ROBERTS K., WALTER P. Biologia Molecular da Célula. 5a 
Edição, ARTMED, Porto Alegre. 2010. 
• Capítulo 11 de COX M; DOUDNA J; O’DONNELL M. Biologia 
Molecular- Princípios e Técnicas. 1ª ed. Artmed. 2012. 
• Capítulo 20 e 21 de WEAVER R. Molecular Biology, 5ª ed. 
McGraw-Hill Education, 2011. 
 
 
http://highered.mheducation.com/sites/0072995246/student_view0/chapter20/action_of_dna_gyrase.html 
http://highered.mheducation.com/sites/0072995246/student_view0/chapter21/telomerase_function.html 
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/007337797x/student_view0/chapter12/animation_quiz_-
_meselson_and_stahl_experiment.html 
http://www.youtube.com/watch?v=27TxKoFU2Nw 
https://highered.mcgraw-hill.com/sites/dl/free/0072835125/126997/animation19.html 
Animações 
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/007337797x/student_view0/chapter12/animation_quiz_-_meselson_and_stahl_experiment.html
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/007337797x/student_view0/chapter12/animation_quiz_-_meselson_and_stahl_experiment.html
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http://www.youtube.com/watch?v=27TxKoFU2Nw
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Por que devo me importar com esta aula? 
• Essencial à vida e à evolução; sem isso, não haveria 
transferência de informação entre as gerações. 
 
• Altamente regulada em resposta ao ambiente. A replicac ̧ão 
deve ocorrer apenas quando as células possuem recursos 
suficientes para se dividirem e formarem novas células. 
 
• Perda de controle: câncer 
 
• A acuidade da replicação é particularmente crucial. 
 
 
Replicação do DNA 
Transações do DNA durante a replicação 
• Em todos os organismos, a replicac ̧ão inicia-se em locais 
específicos do cromossomo, onde as DNA-polimerases 
são recrutadas, e então percorre o DNA 
bidirecionalmente até que o cromossomo inteiro seja 
copiado. 
• A replicação do DNA é semiconservativa: cada DNA 
duplex-filho conserva somente uma fita do DNA de 
origem; a outra fita é completamente nova. 
 
• Watson & Crick (1953): “Não escapou à nossa atenção 
que o pareamento específico que postulamos sugere 
imediatamente um possível mecanismo de cópia para o 
material genético”. 
Experimento de 
Meselson & Stahl 
provou que a 
replicação do DNA 
é semiconservativa 
Condições: 
• Nativa, em que as duas fitas de um duplex de DNA permanecem 
juntas 
• Alcalina, na qual o duplex se separa em duas fitas únicas de DNA 
M. Meselson e F.W.Stahl, Proc. 
Natl. Acad. Sci. USA 44:6671-682, 
1958. Fig. 11.1.Cox et al., 2012 
Animação: 
http://highered.mcgraw-
hill.com/sites/007337797x/student_view0/ch
apter12/animation_quiz_-
_meselson_and_stahl_experiment.html 
 
http://highered.mheducation.com/sites/0072
995246/student_view0/chapter20/meselson_
and_stahl_experiment.html 
 
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/007337797x/student_view0/chapter12/animation_quiz_-_meselson_and_stahl_experiment.html
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/007337797x/student_view0/chapter12/animation_quiz_-_meselson_and_stahl_experiment.html
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http://highered.mcgraw-hill.com/sites/007337797x/student_view0/chapter12/animation_quiz_-_meselson_and_stahl_experiment.htmlhttp://highered.mcgraw-hill.com/sites/007337797x/student_view0/chapter12/animation_quiz_-_meselson_and_stahl_experiment.html
http://highered.mheducation.com/sites/0072995246/student_view0/chapter20/meselson_and_stahl_experiment.html
http://highered.mheducation.com/sites/0072995246/student_view0/chapter20/meselson_and_stahl_experiment.html
http://highered.mheducation.com/sites/0072995246/student_view0/chapter20/meselson_and_stahl_experiment.html
A replicação é iniciada em origens e ocorre 
bidirecionalmente 
Fig. 11.2 Cox et al., 2012 
forma de 
replicação 
teta (θ) 
Origem de Replicação: 
• Região do DNA que contém pequenas 
sequências de DNA que atraem as 
proteínas iniciadoras e segmentos de 
DNA especialmente fáceis de 
separar. 
 - Procariotos: regiões ricas em A-T, 
com centenas de bp; 
 - Eucariotos: menos definidas, com 
milhares de bp. 
 
• Número de origens: 
 - Procariotos: Uma 
 - Eucariotos: Múltiplas 
Forquilhas de replicação eucarióticas 
 Forquilhas de replicação eucarióticas 
deslocam-se a uma velocidade em torno de 1/10 
da velocidade das forquilhas de replicação 
bacterianas, possivelmente devido a ̀ complexa 
compactação dos cromossomos eucarióticos. 
Fig. 11.3 Cox et al., 2012 
A atividade 
específica determina 
a concentração de 
átomos excitados 
numa substância 
radioativa. 
Determina-se a 
atividade específica 
de um certo elemento 
dividindo a sua 
atividade por sua 
massa. 
A replicação é contínua em uma fita e 
semidescontínua na outra 
Fig. 11.4 Cox et al., 2012 
A forquilha de replicação de 
DNA é assimétrica 
Todas as DNA-polimerases 
funcionam na direção 5'→3', 
ligando o α-5‘ fosfato de um novo 
dNTP à posição 3' do resíduo de 
nucleotídeo à porção final (i. e., 
ao final 3') da cadeia. 
Primer: 10 a 13 
ribonucleotídeos 
Fragmentos de Okazaki: 
• 1000 a 2000 nucleotídeos em bacte ́rias 
• 100 a 200 nucleotídeos em eucariotos 
A química das DNA-polimerases 
• E. coli possui 5 DNA-polimerases diferentes, envolvidas 
em uma variedade de processos celulares. Na verdade, Pol 
I funciona sobretudo no reparo do DNA danificado, em 
vez de atuar na replicação cromossômica. Pol I é a mais 
estudada. 
 
• DNA-polimerases estendem o DNA na direção 5’→3’. 
 
• Todas necessitam de uma fita-molde de DNA. 
 
• Todas necessitam de uma extremidade 3' livre do primer 
(iniciador), onde os nucleotídeos serão adicionados. 
 
• O primer é uma molécula de RNA. O primer da PCR 
(reação in vitro) é feito de DNA. 
 
A reação da DNA-polimerase 
Fig. 11.5 Cox et al., 2012 
O grupamento 3'-hidroxila da fita 
iniciadora, é ativado para atacar o 
fósforo α do dNTP , formando a 
ligação fosfodiéster. 
Ataque nucleofílico 
Por que não utilizar dNDP como o nucleotídeo 
precursor, que produziria o mesmo produto de DNA e 
somente um fosfato inorgânico (Pi) em vez de PPi, que é 
posteriormente separado em duas moléculas de Pi? 
A desvantagem seria que a reação reversa é facilmente iniciada 
apenas com Pi, um produto comum em células vivas. A utilização 
de precursores trifosfatados em vez de difosfatados garante que a 
reação reversa não ocorrerá, pois o PPi é eliminado pela 
pirofosfatase – tornando a reação da DNA-polimerase 
irreversível. Este é o provável motivo pelo qual todas as DNA-
polimerases conhecidas utilizam precursores trifosfatados. A 
mesma estratégia também ocorre para RNA-polimerases, que 
usam NTPs e liberam PPi durante a síntese de RNA. 
dADP=dAMP+Pi 
Figure 5-8 (part 1 of 2) 
Isomeria : fenômeno caracterizado pela existência de duas ou mais 
substâncias que apresentam fórmulas moleculares idênticas, mas 
que diferem em suas fórmulas estruturais. 
Tautomeria é o caso particular de isomeria funcional em que os dois 
isômeros ficam em equilíbrio químico dinâmico. 
pareamento correto é mais favorável energeticamente! 
A alta fidelidade da replicação do DNA requer 
vários mecanismos de correção 
A maioria das DNA-
polimerases contém 
atividade de exonuclease 
Figure 5-9 Molecular Biology of the Cell 
•sítios catalíticos para as reações de 
exonuclease (E) e polimerização (P) 
Fig. 11.6 Cox et al., 2012 
Table 5-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
•Uma taxa de erros de aproximadamente 1 em cada 104 é encontrada 
tanto na síntese de RNA como em um processo separado de tradução 
de sequências de RNA mensageiro (mRNA) em sequências proteicas, 
uma taxa 100 mil (109 /104= 109-4 =105) vezes maior. 
 
•A DNA-polimerase atua como uma enzima de "autocorreção”. 
Mecanismos de correção que garantem a 
alta fidelidade da replicação do DNA 
Figure 2-68 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Orientação dos intermediários ativos nas reações 
de condensação sucessivas de polimerização 
que formam os polímeros biológicos 
Figure 5-10 Molecular Biology of the Cell 
 
Apenas a replicação do DNA na direção 5' -3' permite 
correção eficiente de erros 
A tradução de cadeias com quebras (nick translation) é a ação 
combinada de excisão 5‘-3' e polimerização do DNA 
A atividade exonuclease 5'→3' é 
u ́nica da Pol I e reflete o papel 
da enzima no reparo do DNA 
Fig. 11.7 Cox et al., 2012 
Depois de Pol I dissociar-se do DNA, 
o corte e ́ selado pela DNA-ligase 
Cinco DNA-polimerases de E. coli funcionam na 
replicação e no reparo do DNA 
• O grande excesso de Pol I intracelular atrasou a descoberta das outras DNA-
polimerases. 
 
• A baixa precisa ̃o de Pol IV e Pol V lhes permite inserir um nucleotídeo incorreto 
pareado a uma base danificada da estrutura-molde. Embora esse fato resulte 
em um erro, permite que a forquilha de replicaça ̃o movimente-se novamente. 
 
• A capacidade da forquilha de replicac ̧a ̃o de se mover sobre um local danificado 
e ́ uma questa ̃o de vida ou morte, e todas as células-tanto de bactérias quanto 
de arqueias e eucariotos – possuem as DNA-polimerases de “translesão” 
propensas a erros. 
E. coli - DNA Polimerase I 
# polipeptídeo de 928 aa, 
replicação e reparo de DNA 
DNA POLIMERASE I 
Applications 
•DNA sequencing by the Sanger dideoxy method 
(Past) 
•Fill-in of 5´ overhangs to form blunt ends 
•Removal of 3´ overhangs to form blunt ends 
•Second strand cDNA synthesis 
•Second strand synthesis in mutagenesis protocols 
A estrutura das DNA-polimerases revela a 
base para sua precisão 
Fig. 11.8 Cox et al., 2012 
Formas aberta e fechada de Pol I 
Somente quando a Pol I está completamente fechada, as 
metades catalíticas do sítio ativo alinham-se de modo 
apropriado para uma catálise rápida. 
Fig. 11.9 Cox et al., 2012 
Processividade: As DNA-polimerases com frequência apresentam alta 
processividade (milhares de bases), na qual muitos nucleoti ́deos sa ̃o adicionados a 
uma cadeia de DNA em um evento de ligaça ̃o da polimerase. Pol I, ao contrário, 
apresenta um número de processividade de 10 a 100 nucleotídeos. 
Pareamentos de bases incorretos não se encaixam no sítio 
Fig. 11.10 Cox et al., 2012 
Incorporação preferencial de um dNTP 
correto em relação a um dNTP incorreto 
Fig. 11.11 Cox et al., 2012 
A arquitetura da holoenzima Pol III de E. coli 
 Holoenzima Pol III: 
• 2 núcleos Pol III 
• 2 cintas deslizantes β, em 
formato de anel, que aumentam a 
processividade 
• 1 montador da cinta, que monta 
os grampos β sobre o DNA 
As cintas e o montador ajudam a manter o 
contato entre o núcleo Pol III e o DNA, fazendo 
a polimerase ter uma alta processividade (~100 
kb por evento de ligação) 
Cox et al., 2012 
Mecânica da forquilha de replicação do DNA 
Pol III é a responsável pela replicação do cromossomo de E. coli. 
 Holoenzima Pol III: 
• 2 núcleos Pol III 
• 2 cintas deslizantes β, em formato de anel, que aumentam a processividade 
• 1 montador da cinta, que monta os grampos β sobre o DNA 
Cox et al., 2012 
Processividade conferida pela cinta β 
Síntese distributiva:quando uma 
polimerase se dissocia e se reassocia a 
cada adic ̧ão de nucleotídeo. 
Síntese processiva: quando uma 
polimerase permanece ligada ao DNA 
durante múltiplos ciclos catalíticos 
Cox et al., 2012 
• DNA polimerase: processividade e correção de erro 
• DNA-primase: sintetiza o iniciador (primer) 
• DNA-helicase: promove a abertura da dupla-hélice 
• Proteínas ligadoras de fita simples de DNA 
(SSB, single strand DNA-binding): mantém as fitas 
separadas, estabilizando a conformação distorcida e de fita 
simples 
• Cinta deslizante: mantém a DNA polimerase firmemente 
associada ao DNA enquanto está em movimento 
• Montador da cinta: monta a cinta sobre o DNA 
• Topoisomerases: aliviam a torção na dupla-hélice. Em 
procariotos, estas topoisomerases são conhecidas como 
DNA girase. 
•Dna Ligase 
 
• Quase todas essas enzimas hidrolisam ATP! 
Enzimologia da forquilha de replicação 
Muitas proteínas diferentes atuam na forquilha de replicação 
Cox et al., 2012 
A forquilha de replicação 
O complexo da holoenzima Pol III, 
da DnaB helicase e da primase forma 
o replissomo, o complexo de enzimas 
e proteínas necessários para a 
replicação. 
Cox et al., 2012 
O modelo trombone de funcionamento da forquilha de 
replicação 
Fig. 11-22. Cox et al., 2012 
 Como poderia a Pol III da fita descontínua sintetizar DNA na direção oposta ao movimento da forquilha de 
replicação e ainda assim permanecer fixa ao replissomo? 
Além da atividade exonuclease 5’-3’da Pol I, a 
célula também possui uma enzima de reserva, a 
RNaseH, que pode remover o RNA Cox et al., 2012 
Fragmentos de Okazaki exigem a remoção do 
RNA e a ligação do DNA mediada por ligase 
Figure 5-24. The Cell. 
As topoisomerases 
do tipo II dependem 
de ATP e são limitadas 
quase exclusivamente 
a células 
proliferativas, sendo 
por isso alvos comuns 
para fármacos 
anticâncer 
As DNA-topoisomerases evitam o emaranhamento 
do DNA durante a replicação 
http://www.youtube.com/watch?v=EYGrElVyHnU 
Animação 
http://www.youtube.com/watch?v=EYGrElVyHnU
As DNA-topoisomerases Tipo I e II 
A forquilha de replicação é mais complexa 
em eucariotos do que em bactérias 
Cox et al., 2012 
Muitas proteínas de replicação eucarióticas 
apresentam homólogos em bactérias, porém a 
maquinaria da forquilha de replicação de 
eucariotos inclui proteínas extras, além das 
utilizadas na maquinaria bacteriana. 
A primase eucariótica é um complexo de quatro 
subunidades denominado DNA-polimerase α 
(Pol α ) 
• PCNA: Cinta deslizante de DNA eucariótica 
• RFC: Montador da cinta eucariótico, fator de 
replicação C 
• Proteína A de replicação (RPA) heterotrimérica 
corresponde ao equivalente funcional da SSB 
 
Pierce, 2012 
Início da replicação do DNA 
• A extensão total do DNA replicado de uma origem é denominada replicon. 
mer=monomer 
A menor origem (oriC) de E. coli apresenta um tamanho de 245 pb e contém quatro 
cópias de uma sequência-consenso de nove nucleotídeos (9–mer) à qual a proteína 
iniciadora DnaA se liga. 
Início da replicação do DNA 
DnaA: Reconhece a 
origem e abre a 
dupla fita em sítios 
específicos 
- Metilação – DNA hemimetilado 
- Ligação física com a membrana 
- Garante que a origem será ativada uma vez por ciclo 
Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente 
metiladas podem iniciar a replicação 
Replicon: Unidade do DNA onde está 
ocorrendo um evento de replicação 
 
1. Origem + Término 
2. Durante um ciclo celular, a origem de replicação pode 
ser ativada mais de uma vez em procariotos e uma 
vez em eucariotos 
3. O cromossomo de uma célula procariótica constitue 
um único replicon 
4. Cada cromossomo eucariótico constitue vários 
replicons 
Início da replicação do DNA 
“O ciclo de replicação e 
início da formação do septo 
ocorrem bem antes do 
processo de divisão” 
Replicação do DNA x Ciclo Celular 
Origens eucarióticas são ativadas somente 
uma vez por ciclo celular 
Figure 17-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
G0 (G zero): 
estado de repouso 
especializado 
Ex.: condições 
extracelulares são 
desfavoráveis 
• Fases: 
- G1 – síntese de proteínas 
- S – duplicação do DNA 
- G2 – síntese de proteínas e DNA duplicado 
A replicação é controlada em múltiplas etapas 
Figure 17-14 Molecular Biology of the Cell 
O sistema de controle do 
ciclo celular governa a 
progressão do ciclo 
celular 
câncer 
 A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 10X menor que 
em E. coli 
 
O genoma eucariótico constitui vários replicons 
Número de Origens e 
Modos de Replicação 
 30,000–50,000 in humans 
Replicação Teta 
Replicação Teta 
• Replicação comum na bactéria E.coli e outras bactérias 
• Os produtos da replicação teta são duas moléculas circulares 
de DNA. 
 
Pierce, 2012 
• Ocorre em alguns vírus (HPV, parvovirus) e no fator F (pequeno círculo 
de DNA extracromossômico que controla a reprodução). 
 
• Resultado: Os produtos da replicação circular são várias moléculas de 
DNA circular. 
 
Replicação Círculo Rolante 
Pierce, 2012 
Replicação Linear em Eucariotos 
• Replicação que ocorre nos animais, nas células eucarióticas em geral. 
• Resultado: Os produtos da replicação eucariótica são duas moléculas 
de DNA linear. 
 
Pierce, 2012 
Replicação Linear em Eucariotos 
Pierce, 2012 
Formação das forquilhas de replicação eucario ́ticas 
O iniciador eucario ́tico é um 
hetero-hexâmero denominado 
complexo de reconhecimento 
da origem (ORC, do inglês 
origin recognition complex). 
Término da replicação do DNA 
A proteína monomérica Tus (do inglês 
Termination Utilization Substance, 
que corresponde à substância para 
uso na terminação) liga-se 
fortemente ao sítio Ter e bloqueia o 
avanço da forquilha de replicação pela 
pausa da DnaB helicase. 
Weaver, 2012 
Fig. 21-22 
Cox, 2012 
Como é sintetizada a 
extremidade de um 
cromossomo linear? 
Esse problema de replicação 
da extremidade terminal não 
ocorre no DNA circular 
(maioria das bactérias), que 
não apresenta porções 
finais. 
Pierce, 2012 
A telomerase resolve o problema de replicação da 
extremidade terminal em eucariotos 
Pierce, 2012 
As alças t (alças do telômero) 
As alças t (alças do telômero) 
• As alças t geram uma estrutura característica nas extremidades 
cromossômicas normais que as protege de enzimas de degradação e 
claramente as distingue das extremidades de moléculas de DNA 
quebradas, que devem ser rapidamente reparadas pela célula. 
Proteínas também se ligam aos telômeros para 
proteger as porções terminais dos 
cromossomos. São conhecidas com shelterinas 
(TRF1, TRF2, POT1, TIN2) 
Shelter: abrigo em inglês 
Weaver, 2012 
• Nossas células somáticas nascem com um suprimento completo de 
repetições teloméricas. Telomerase é expressa em células-tronco e da 
linhagem germinativa e praticamente não é expressa em células somáticas 
diferenciadas. 
 
• Em vários outros tipos celulares, o nível da telomerase é reduzido de tal 
modo que a enzima não pode mais acompanhar a duplicação cromossômica= 
senescência celular replicativa. 
 
• Parcialmente responsável pelo envelhecimento dos animais. 
 
• Nem todas as células que começam a perder as extremidades dos 
cromossomos irão parar de se dividir. Algumas aparentemente tomam-se 
geneticamente instáveis, mas continuam a se dividir e geram variantes 
celulares que podem levar ao câncer. 
O comprimento dos telômeros é regulado 
pelas células e pelos organismos 
 
Sinais de envelhecimento prematuro e uma tendência 
pronunciada ao desenvolvimento de tumores 
. 
Camundongos transgênicos sem 
nenhuma telomerase 
Sem Telomerase Com Telomerase 
Fim