Determinação de lipideos e proteinas nos alimentos

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DETERMINAÇÃO DE LIPÍDEOS E PROTEÍNAS NOS ALIMENTOS
Lipídeos: Moléculas pouco solúveis ou insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos. Exemplos de solventes orgânicos: 
Como agem os solventes?
 Os solventes atraem a fração lipídica neutra (ácidos graxos livres, acilgliceróis) e frações mais polares (fosfolipídios, glicolipídios e esfingolipídios). Esteróis, ceras, pigmentos lipossolúveis e vitaminas são extraídos apenas parcialmente; 
Os métodos de extração com solventes fundamentam-se na determinação da massa de material extraído pelo solvente a partir de uma amostra de massa conhecida.
Métodos de extração com solventes:
· Extração com solvente a quente: 
Utiliza-se o Método de Soxhlet e Método de Goldfisch, Usados para amostras sólidas com baixo teor de umidade. Há degradação de componentes lipídicos pela ação do calor.
Extração com solvente a frio: Método de Bligh-Dyer e Método de Folch, Usados para amostras sólidas e líquidas. Não há degradação dos componentes lipídicos.
· Método de Folch: 
Agitação e sucessivas “lavagens” da amostra com mistura clorofórmio: metanol (2:1) para extração dos lipídios; Filtração do solvente contendo os lipídios; Adição de solução salina (KCl) e agitação para a separação de fases; Coleta da fase inferior (clorofórmio + lipídios); Evaporação do clorofórmio.
· Método de Bligh-Dyer: 
Agitação contínua da amostra com mistura clorfórmio- metanol-água; Separação das fases e coleta da fase inferior (clorofórmio+ lipídios); Evaporação do clorofórmio.
· Métodos de extração da gordura por hidrólise ácida ou alcalina
Hidrólise ácida: Método de Gerber (para análise da gordura do leite) e Método de Babcock 
Hidrólise alcalina: Método de Rose- Gottlieb e Mojonnier
Utilizados quando a fração lipídica de um alimento é muito aderida a outras moléculas, como proteínas e carboidratos, que precisam ser destruídas para a liberação da gordura.
Determinação da composição lipídica
Cromatografia: procedimento mais poderoso para analisar as propriedades lipídicas; envolve a passagem da mistura de moléculas através de uma coluna por onde são separadas; após a separação, a concentração de cada molécula é determinada por um detector. 
· Cromatógrafo a gás: 
Utilizado para se determinar o perfil de ácidos graxos presente no lipídio. 
· Proteínas – Métodos Utilizados na rotina de análise de alimentos: Micro-Kjeldahl (determinação de nitrogênio);
Outros: Biureto; Espectrometria UV; Hartree-Lowry-Folin-Ciocalteaul; Bradford.
Biureto :Íons Cu2+ interagem com pontes peptídicas em condições alcalinas produzindo uma cor violeta; utiliza-se o reagente de biureto (a base de CuSO4, tartarato de potássio é sódio e NaOH) que pode ser comprado pronto; é misturado à solução de proteínas; após 15 a 30 min é lida a absorbância da amostra a 550 nm 
• Vantagem: não há interferência de materiais que absorvem a luz em menores comprimentos de onda; Menor sensitividade comparada ao método UV 
Espectroscopia UV: Triptofano e tirosina absorvem fortemente luz ultravioleta a 280 nm; O teor destes aminoácidos é relativamente constante em muitas proteínas; Procedimento simples, não destrutivo, sem necessidade de reagentes especiais; útil para quantificar proteínas puras.
Desvantagem: pode ser facilmente distorcido; o espectro pode ser afetado se contaminantes que absorvem UV (ex. ácidos nucléicos) estiverem presentes mesmo em concentrações baixas, entre 10-4 e 10-5 M;
► Cálculo:  
Onde: 
► c é a concentração da proteína na diluição lida (g proteína/100ml da diluição) 
► Aλ é a absorbância lida 
► E1% é o coeficiente de absorção de massa da proteína a 280 nm 
► l = largura da cubeta (1 cm) 
► O valor de E1% varia com o tipo de proteína 
► Utiliza-se E1% = 10 para proteínas desconhecidas ou misturas de proteínas 
c = A λ lE %1 ×
Hartree-Lowry-Folin-Ciocalteau: Combina o método de biureto com o reagente fenólico de Folin-Ciocalteau; reage com resíduos de tirosina e triptofano rendendo cor azul; Leitura a 650 nm; em relação ao método de biureto, este método é mais sensível a menores concentrações de proteínas. 
Bradford: Corante Comassie (azul brilhante G250) liga-se a moléculas de proteínas em pH ácido e é usado no ensaio; A mudança de cor produzida resulta na medida da proteína total; utiliza-se uma curva padrão de BSA a 595 nm como referência.
· Biureto, Hartree, Bradford – Cálculo
Utiliza-se uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA) como referência; O cálculo é baseado na equação da reta da curva padrão. Ex. de equação da reta: y = 1,235x; y = absorbância da diluição lida a 550 nm; x = concentração de proteínas/ml de diluição.
· Método de Kjeldahl: 
Várias adaptações ao longo dos anos; Micro-Kjeldahl: usado atualmente; determina o nitrogênio total da amostra (proteico +orgânico) Sempre realizado um branco em paralelo.
Três etapas: Digestão, Destilação (neutralização), Titulação. 
Digestão: A amostra é pesada em um tubo de digestão, Adição de mistura de catalisadores (K2SO4 e CuSO4), K2SO4: eleva o ponto de ebulição do ácido sulfúrico, que aumenta a velocidade de decomposição da amostra, CuSO4: catalisador, aumenta a velocidade da reação, Adição de H2SO4: agente oxidante que digere a amostra, Aquecimento.
O ácido é consumido gradualmente durante a digestão, A razão de sal no material digerido aumenta gradativamente, todo nitrogênio (exceto nitrito e nitrato) é convertido em amônia e o restante da matéria orgânica em CO2 e H2O, O gás de amônia não é liberado na solução ácida, A amônia fica na forma NH4+ que se liga ao íon SO42-, É o (NH4)4SO4 que permanece em solução.
Destilação: Após a digestão e resfriamento, adicionar ácido bórico e 4 gotas do indicador misto (vermelho de metila + verde de bromocresol ou vermelho de metila + azul de metileno) no frasco Erlenmeyer coletor, conecta-se o frasco no equipamento destilador, adicionar fenolftaleína no tubo de Kjeldahl (opcional), conecta-se o tubo no equipamento destilador, Adicionar NaOH no tubo de Kjeldahl, Proceder à destilação, A solução no tubo é alcalinizada: o sulfato de amônio é convertido em gás NH3.
A amônia formada é liberada da solução e move-se do tubo para o frasco Erlenmeyer coletor. A amônia é coletada no ácido bórico e estes são convertidos em íon amônio e íon borato, respectivamente, recolher cerca de 50 ml de destilado (a extremidade do destilador deve ficar mergulhada na solução de ácido bórico + indicador misto durante todo o processo); O indicador misto tornará a solução verde quando em contato com os íons amônio e borato; Destilação (reação no frasco Erlenmeyer): NH3 + H3BO3 → NH4+ + H2BO3-
Titulação: O teor de nitrogênio é estimado por titulação do borato de amônio com HCl padronizado (0,01 ou 0,02 moles/L) para determinar o ponto final da reação (mudança da cor verde para cor roxa ao usar vermelho de metila + azul de metileno ou da cor verde para a cor laranja ao usar vermelho de metila + verde de bromocresol): H2BO3- + H+ → H3BO3
A concentração de H+ (em moles) necessária para alcançar o ponto final é equivalente à concentração de N que existia no alimento original. 
Desvantagens: Não mede a proteína verdadeira (utiliza fator de conversão para relacionar o teor de nitrogênio com o teor proteico da amostra); nem todo o N do alimento é proveniente da proteína; diferentes proteínas possuem fatores de conversão diferentes devido às diferentes sequências de aminoácidos; implica em certo grau de perigo por usar ácido sulfúrico concentrado; Requer bastante tempo para realizá-la.
Fatores de conversão são usados para se obter o teor de proteína a partir do teor de nitrogênio total da amostra.