Diagnóstico laboratorial do coronavírus (SARS-Cov-2)

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Diagnóstico laboratorial do coronavírus (SARS-CoV-2)
Eduardo da Silveira
Jessikelly Santos
José Otávio
Laís Ferreira
Leidiana Sampaio
Lucas Mendes
Agente infeccioso diminuto, desprovido de metabolismo independente, que se replica somente no interior de células vivas hospedeiras.
 VÍRUS 
SARS-CoV-2
Coronaviridae compreende uma grande família, sendo que pelo menos sete dentre os coronavírus são bastante conhecidos por causarem doenças respiratórias em humanos.
SARS-CoV-2 é o terceiro coronavírus zoonótico a transpor a barreira entre espécies e se tornar capaz de infectar humanos, nas duas últimas décadas.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – SARS-CoV-2
DEFINIÇÃO:
Figura: Representação ilustrativa do SARS-Cov-2
Fonte:cdn.pixabay.com/photo/2020/03/14/09/39/virus-4930122_960_720.png
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O SARS-CoV-2, causador da COVID-19, é um novo betacoronavírus pertencente à grande família viral dos coronaviridae.
VÍRUS 
SARS-CoV-2
Cidade de Wuhan, China, em dezembro de 2019. 
Os coronavírus são responsáveis por infecções respiratórias em seres humanos e em alguns animais. 
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – SARS-CoV-2
Fonte: cdn.pixabay.com
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O Sars-CoV-2, causador da Covid-19, é chamado de “novo” coronavírus porque ele faz parte de uma família maior, que possui membros já conhecidos pelos cientistas. Alguns desses familiares provocaram doenças em seres humanos – chegando a gerar surtos. Porém, não se disseminaram a ponto de resultar em uma pandemia como a que estamos vivendo agora. 
Identificado pela primeira vez em um surto de casos de pneumonia na cidade de Wuhan, província de Hubei, China, em dezembro de 2019.
Caracteristicamente, os coronavírus são responsáveis por infecções respiratórias em seres humanos e em alguns animais. 
coronaviridae 
SARS
VÍRUS 
SARS-CoV-2
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – SARS-CoV-2
DENOMINAÇÃO:
SARS-CoV-2
Síndrome Respiratória Aguda Grave 
Fonte: cdn.pixabay.com
Fonte: cdn.pixabay.com
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SARS é uma sigla em inglês para síndrome respiratória aguda grave 
o COV do nome é relativo a família 
No passado já tivemos outro SARS em 2002 na China (Espalhou-se pelo mundo em alguns meses, embora tenha sido rapidamente contida)
 VÍRUS 
SARS-CoV-2
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – SARS-CoV-2
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1- Proteína Spike (S)
2- Hemaglutinina esterase (HE)
3- Proteína de membrana (M)
4- Envelope
5- RNA e proteína N
ESTRUTURA:
Figura: Representação estrutural do SARS-Cov-2
Fonte:cdn.pixabay.com/photo/2020/04/25/02/03/coronavirus-structure-5089224_960_720.png
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O SARS-CoV-2 é um vírus RNA de fita simples com capacidade de sintetizar cerca de 29 diferentes proteínas, esse tipo de vírus sofre mutações genéticas com maior frequência do que os vírus DNA por terem menor capacidade de correção dos eventuais erros de transcrição.
Trata-se de um vírus envelopado (membrana lipoprotéica), possuindo proteínas de membrana. essas proteínas estão presentes na superfície do vírus e atuam como facilitadores do seu ingresso nas células hospedeiras, outras, aparentemente, estão relacionadas com a sua patogenia.
* RNA de fita positiva (confere uma replicação mais rápida)
Mecanismo de Invasão do Vírus SARS-CoV-2
O SARS-CoV-2 liga-se à célula do hospedeiro humano por meio do receptor ACE2, e seu mecanismo de entrada depende da atuação sequencial da enzima serina protease TMPRSS2. 
Esses dados sugerem vários possíveis alvos terapêuticos, incluindo o eixo interleucina (IL)-6-STAT3, associado à síndrome de liberação de citocinas
Figura: Proteína Spike se ligando ao receptor ACE2 e sendo ativada pela proteína TMPRSS2, presente nas células pulmonares, para iniciar processos de fusão e infecção, liberando assim seu material genético dentro da célula. 
Fonte: http://proec.ufabc.edu.br/epufabc/como-detectar-o-novo-coronavirus/
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ACE2 - Enzima conversora de angiotensina 2
Mecanismo de Invasão do Vírus SARS-CoV-2
Outra proteína estrutural do vírus teria a habilidade de deslocar o ferro presente na hemoglobina, reduzindo a capacidade de transporte de oxigênio e proporcionando a baixa saturação observada em alguns dos pacientes que evoluem mal. 
Adicionalmente, a liberação de íons ferro em quantidades elevadas causaria danos oxidativo, desencadeando um processo inflamatório intenso que resultar na: Tempestade de Citocinas
Além dos pulmões, afetam fortemente o fígado, os rins e o coração
Figura: "tempestade de citocinas" da Covid-19.
Fonte: https://revistagalileu.globo.com/Ciencia/Saude/
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Ainda que o pulmão seja um dos órgãos alvo, o mecanismo de hipóxia é sistêmico e outros órgãos passam a sofrer tanto a falta de oxigênio quando a desregulação dos mecanismos de controle da inflamação. Outros dois órgãos fortemente afetados são o fígado e os rins. 
Manifestação Clínica do Vírus SARS-CoV-2
Os sintomas podem se desenvolver entre 2 a 14 dias após a exposição ao vírus, com um período médio de incubação de 5,1 dias. Daí o período recomendado de quarentena ser, habitualmente, de 14 dias. 
Figura: Sintomas da Covid-19
Fonte: https://www.mpse.mp.br/index.php/coronavirus-covid-19/
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As manifestações clínicas de COVID-19 podem ser desde totalmente assintomáticas (em até 89% dos infectados) ou caracterizar-se por sintomas discretos até críticos e fatais. 
Manifestação Clínica do Vírus SARS-CoV-2
O curso da doença pode girar desde cerca de 16 dias após um curto período de incubação em casos leves a moderados ou até 10 semanas, caso haja um período de incubação mais prolongado e desfecho grave ou fatal. 
o Período de incubação de 2 a 14 dias (média de 5 a 6 dias) após a infecção
o Casos leves : duas semanas 
o Casos graves e recuperados – três a seis semanas 
Figura: Sintomas da Covid-19
Fonte: http://www.mpce.mp.br/coronavirus/o-que-e-sintomas-e-contagio/
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Uma pessoa pode ser transmissora mesmo antes de surgirem os sintomas até o desaparecimento deles, com pico cerca de cinco dias após o início dos sintomas. 
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Baseada na reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa com reação de amplificação em tempo real; 
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
Melhor se aplica para a detecção do vírus SARS-CoV-2;
 Identificação do RNA Viral;
Os genes considerados para a identificação incluem: N, E, S e RdRP; 
rRT-PCR
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Figura: Máquina usada no RT-PCR
Fonte: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4376600/
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É gerada uma fita de DNA complementar (cDNA) pela transcriptase reversa; 
Com uma sonda complementar, observa-se o conteúdo molecular correspondente ao do agente infeccioso alvo; 
IDENTIFICAÇÃO
São inseridos dois primers, que promovem a amplificação do(s) alvo(s) genético(s); 
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
rRT-PCR
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – SARS-CoV-2
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A recomendação para confirmação laboratorial dos casos é a detecção de dois marcadores genéticos diferentes; 
O Ministério da Saúde brasileiro recomenda que o gene alvo seja o gene E, pela sua maior sensibilidade;
Considerando a elevada taxa de circulação do vírus, atualmente, a confirmação pode ser pela detecção de um único marcador genético. 
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
rRT-PCR
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – SARS-CoV-2
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Coleta de material do trato respiratório superior ou do trato respiratório inferior e na detecção de ácido nucleico viral específico. 
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
Detecta diretamente a presença de componentes específicos do genoma do vírus.
	Deve ser usado no diagnóstico da doença nas fases assintomática, pré-sintomática ou sintomática, nos 12 primeiros dias desde o início dos sintomas;
rRT-PCR
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Figura: Teste RT-PCR
Fonte: https://www.ubatuba.sp.gov.br/noticias/testagemampliada/
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trato respiratório superior (nasofaringe ou orofaringe)
GeneXpert (Cepheid)
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
rRT-PCR
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Teste rápido molecular para processamento em plataforma automatizada;
- O mesmo empregado na Rede de Teste Rápido da Tuberculose;
Detecçãoqualitativa in vitro de ácido nucleico do SARS-CoV-2, por PCR em tempo real, automatizado, tendo como alvos os genes E e N2;
Em amostras de swab nasofaríngeo ou aspirado/lavado nasal de indivíduos suspeitos da COVID-19;
Figura: Profissionais e GeneXpert que foi doado ao HU-UFScar
Fonte: https://www.acidadeon.com/saocarlos/cotidiano/coronavirus/
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Barreiras para o uso generalizado de rRT-PCR
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
rRT-PCR
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Quantidade insuficiente de testes;
Quantidade insuficiente de equipamentos;
Metodologia laborosa;
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Destaca-se o quantitativo insuficiente de testes e equipamentos disponíveis no país, além de ser essa uma metodologia laboriosa quando a extração e a realização do teste são manuais, ocasionando grande número de exames pendentes de realização, principalmente, mas não exclusivamente, na rede pública dos Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACENs )
Carga viral e Fase da Infecção 
Local da Coleta; 
Coleta, transporte e armazenamento da amostra;
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
rRT-PCR
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É bastante específico, porém, a sensibilidade pode variar em função de variáveis pré-analíticas como: 
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Fase da infecção e carga viral nas secreções e excreções, principalmente amostras de trato respiratório superior coletadas com menos de 3 e mais de 10 dias desde o início da contaminação; 
Local da coleta, sabe-se que os materiais do trato respiratório inferior (escarro, lavado broncoalveolar) tendem a apresentar maior positividade do que aqueles do trato respiratório superior (suabe combinado de naso e orofaringe); 
Técnica de coleta, transporte e armazenamento da amostra até a sua análise, para evitar a degradação do RNA contido no espécime. 
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
rRT-PCR
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É recomendado que o médico solicitante indique;
É fundamental que a solicitação médica seja clara e objetiva;
Material a ser coletado:
Secreção de orofaringe;
	 nasofaringe;
	 escarro;
Aspirado Traqueal;
Lavado broncoalveolar;
Exame a ser realizado:
RT-PCR para SARS-CoV-2;
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é fundamental que a solicitação médica seja clara e objetiva. É recomendado que o médico solicitante indique o material a ser coletado (por exemplo: secreção de orofaringe, de nasofaringe, de escarro, aspirado traqueal ou lavado broncoalveolar) e explicite o exame a ser realizado: RT-PCR para SARS-CoV-2. 
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É possível a detecção do vírus também em sangue, fezes, urina e saliva
Os estudos de detecção do vírus foram realizados apenas por meio de sua visualização por microscopia eletrônica e técnica de neutralização viral
Porém essas amostras ainda não estão desenvolvidas para diagnóstico de rotina
EXAMES MOLECULARES PARA SARS-CoV-2
rRT-PCR
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EXAMES IMUNOLÓGICOS
Como todas as demais infecções virais, o organismo reage à presença do vírus produzindo anticorpos.
 A presença de anticorpos específicos contra determinantes antigênicos do SARS-CoV-2 indica processo de infecção ou infecção pregressa.
Figura: Representação das Imunoglobulinas envolvidas no processo de infecção viral
Fonte: https://www.todamateria.com.br/anticorpos/
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IgA: Imunidade da mucosa
IgM: Receptor de antígeno de célula B imatura --- Representa a fase de infecção aguda
IgG: Opsonização e ativação do complemento --- Representa a fase de infecção crônica
Os anticorpos começam a ser detectados uma a duas semanas após a infecção; Ainda não se sabe se os anticorpos detectáveis pelos exames atuais são capazes de conferir imunidade duradoura (ou seja, se seriam anticorpos protetores) e por quanto tempo. • Os novos testes foram liberados de forma acelerada e ainda precisam ser cuidadosamente validados
EXAMES IMUNOLÓGICOS
Para a produção desses anticorpos, há necessidade de algum tempo, que em média é de 7 a 10 dias após o início dos sintomas.
Ou seja, antes mesmo de haver uma resposta humoral um indivíduo já pode contaminar outro!
Com o passar dos dias a concentração das Ig’s se elevam o que diminui a chance de resultados falso-negativos.
Fonte: http://www.osarrafo.com.br/v1/2014/08/04/paulo-souto-nao-e-o-adversario-do-pt/flecha-alvo/
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O tempo de produção mais demorado dos Anticorpos é mais uma dificuldade para as metodologias imunológicas, pois se levando em consideração que no início da infecção as taxas estão no limítrofe das metodologias estas podem dar um resultado negativo que não condiz com o quadro real do paciente. Assim com o passar dos dias a sua concentração vai se elevando e diminui a chance de resultados falso-negativos.
EXAMES IMUNOLÓGICOS
Existe ainda a possibilidade de um falso-positivo por reações cruzadas com outros coronavírus em circulação comunitária, o que pode comprometer a especificidade dos testes. 
Notável para locais que já passaram por surtos com vírus semelhantes.
Fonte: https://efetividade.net/2011/10/monotarefa-ou-multitarefa-preciso-escolher-so-um.html
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Existem vários alvos possíveis no exame, e a afinidade por eles existe, como ter certeza que acertamos o SARS-CoV-2?
EXAMES IMUNOLÓGICOS
Como visto os exames imunológicos avaliam, então, fatores derivados da resposta imune humoral.
Portanto se nota a exigência da coleta de amostras específicas para tal avaliação:
Sangue Total
Plasma
Soro
Sangue Capilar
Figura: Coleta de sangue capilar
Fonte: https://www.jove.com/t/52619?language=Portuguese
Figura: Representação de amostra de sangue total
Fonte: http://www.oswaldocruz.com/site/
Figura: Representação da amostra de Soro e Plasma sanguíneos
Fonte: https://biomedicinaglorios.wixsite.com/gloriosabiomedicina/single-post/2017/04/25/Soro-x-Plasma
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Fonte: http://www.oswaldocruz.com/site/noticias-em-geral/noticias/laboratorio-oswaldo-cruz-estende-o-intervalo-do-horario-para-a-coleta-do-exame-de-cortisol
EXAMES IMUNOLÓGICOS
ELISA
Utiliza-se de técnica análoga ao ELISA indireto. 
A análise pode ser tanto qualitativa como quantitativa.
Figura: Esquematização de ELISA indireto
Fonte: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/05/elisa.html
Feito por amostras de sangue total, soro, ou plasma.
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Existe a possibilidade de falsos-positivos justamente por conta de reação de Ig’s específicas para outros coronavírus com os antígenos do SARS-CoV-2 utilizados no teste. A realização de mais testes imunológicos com outros antígenos específicos do SARS-CoV-2 reduz essa possibilidade
EXAMES IMUNOLÓGICOS
Teste de Neutralização
Avalia o grau de atividade dos anticorpos contra a replicação viral.
Figura: Esquematização de um teste de neutralização
Fonte: https://www.businesswire.com/news/home/20200413005181/en/%C2%A0Celltrion-Completes-Neutralisation-Test-Candidate-Monoclonal-Antibodies
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Distribuição das células VeroE6 na placa de poços
Infecção dos poços com o vírus mais a adição de diluições determinadas dos anticorpos
Coração das células que ainda estão vivas e análise dos dados
Não é tão indicada para diagnóstico, serve mais como uma avaliação da condição do paciente frente a infecção ou para a pesquisa científica
EXAMES IMUNOLÓGICOS
TDR
Fáceis e rápidos de usar.
Requerem poucos materiais para serem utilizados.
Baseado na técnica Imuno-cromatográfica.
Realizado comumente com amostra de sangue capilar.
Figura: Representação de um TDR para COVID-19
Fonte: https://www.accubiotech.com/product-covid-19-igg-igm-rapid-test-cassette-(whole-blood-serum-plasma).html
Sensitividade e especificidade na casa dos 90%.
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Teste de Diagnóstico Rápido: Envolve uma placa e uma solução cromatográfica específicas para o diagnóstico da COVID-19
C - Controle
S - Amostra(Sample)
B - Buffer(Tampão de Cromatografia)
As células do Sistema Imunológico liberam citocinasquando o organismo é agredido por agentes infecciosos
Essas moléculas recrutam diferentes células do sistema imune para atuarem em conjunto
As citocinas atuam na modulação da resposta inflamatória.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL DA TEMPESTADE INFLAMATÓRIA
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – SARS-CoV-2
Quando liberadas em quantidades excessiva, elas desencadeiam condição denominada “tempestade de citocinas”.
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AVALIAÇÃO LABORATORIAL DA TEMPESTADE INFLAMATÓRIA
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Figura: Liberação de citocinas por células do Sistema Imune. Fonte: revistagalileu.globo.com
Tempestade de Citocinas: hiperinflamação e geração de um microambiente nocivo ao próprio organismo.
Essa desregulação da resposta inflamatória é considerada um fator de risco a vida.
Apresenta elevada taxa de mortalidade por Insuficiência Respiratória Aguda.
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Em algumas doenças não infecciosas, como a esclerose múltipla, também pode ser observada a tempestade de citocinas. A tempestade de citocinas foi descrita em várias doenças respiratórias causadas por vírus da família dos coronavírus. A principal causa de morte da COVID19 é a insuficiência respiratória causada pela SRAG (Síndrome Respiratória Aguda)
Outra síndrome relacionada à resposta imune é a linfo-histiocitose hemofagocítica secundária,
 É descrita em cerca de 3,7% a 4,3% dos casos de sepse.
Caracterizada por hipercitocinemia fulminante que evolui rapidamente para insuficiência de múltiplos órgãos.
AVALIAÇÃO LABORATORIAL DA TEMPESTADE INFLAMATÓRIA
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Figura: representação da sepse. Fonte: croms.com.br
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AVALIAÇÃO LABORATORIAL DA TEMPESTADE INFLAMATÓRIA
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Características Clínicas da sídrome: 
Febre constante, citopenias e elevado nível de ferritina, das interleucinas (IL) e outros fatores.
Cerca de 50% apresenta Síndrome Respiratória Aguda.
Figura: representação da Síndrome Respiratória Aguda. Fonte: coronavirus.saude.mg.gov.br
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Citopenia é uma condição caracterizada por uma deficiência de um tipo de células sanguíneas (de um ou mais tipos).
AVALIAÇÃO LABORATORIAL DA TEMPESTADE INFLAMATÓRIA
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Diferenças laboratoriais entre sobreviventes e não sobreviventes do COVID-19 associado à Síndrome Respiratória Aguda: 
Contagens de leucócitos, valores absolutos de linfócitos e de plaquetas, concentração de albumina, bilirrubina total, ureia, creatinina, mioglobina, troponina cardíaca, proteína C reativa (PCR) e interleucina-6 (IL-6) séricas. 
Em pacientes com COVID-19, os níveis de ferritina e de IL-6 se mostraram serem bons preditores de fatalidade.
Figura: paciente com Síndrome Respiratória Aguda. Fonte: domtotal.com
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As diferenças são de grupos de pacientes com a Síndrome Respiratória Aguda associada ao novo coronavírus, os resultados laboratoriais mostram diferenças significativas entre sobreviventes e não sobreviventes. 
OUTROS PARÂMETROS LABORATORIAIS
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COVID-19 é uma infecção sistêmica com impacto significativo sobre o sistema hematopoiético e a hemostasia.
As razões neutrófilo/linfócito e plaquetas/linfócitos no pico podem ajudar a avaliar a gravidade dos casos.
A linfopenia pode ser considerada um sinal laboratorial cardinal, com potencial prognóstico.
Procalcitonina e a Ferritina também estão sendo considerados fatores que indicam pior prognóstico.
A hipercoagulabilidade é frequente em pacientes hospitalizados por COVID-19. Níveis elevados de dímero-D, indicação de piora do quadro
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Pacientes com COVID-19, tanto hospitalizados como ambulatoriais, apresentam risco elevado de tromboembolismo venoso e sendo recomendada a tromboprofilaxia farmacológica precoce e prolongada com heparina de baixo peso molecular.
OUTROS PARÂMETROS LABORATORIAIS
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Com a instalação de pneumonia e consequente hipóxia.
Elevam-se as transaminases, indicando sofrimento hepatocelular significativo.
A elevação das atividades das enzimas hepáticas é um indicador importante de gravidade do quadro.
Ao se atingir o estágio mais grave, de hiperinflamação, acompanhada de coagulopatia, os marcadores de inflamação como PCR, ferritina, troponina e peptídeo natriurético cerebral estarão muito elevados, caracterizando a tempestade inflamatória
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PCR, proteína C reativa
REFERÊNCIAS 
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL – SARS-CoV-2
ANDRIOLO, Adagmar. et al. COVID-19 – Diagnóstico laboratorial para os clínicos/COVID-19 – Laboratory Diagnosis for Clinicians. São Paulo, 2020. Disponível em: < file:///C:/Users/W7/Downloads/COVID-19-Adagmar-Andriolo-et-al%20(1).pdf >. Acesso em: 12 de setembro de 2020
ANVISA. Acurácia dos testes diagnósticos registrados na ANVISA para a COVID-19. Brasília, 2020. Disponível em: < file:///C:/Users/W7/Downloads/AcuraciaDiagnostico-COVID19-atualizacaoC.pdf >. Acesso em: 12 de setembro de 2020
BRASIL. Manual para Diagnóstico Laboratorial da COVID-19 e Avaliação da Exposição ao SARS-CoV-2. Brasília, 2020. Disponível em: < file:///C:/Users/W7/Downloads/manual-covid-19-revista-db-1591217123.pdf >. Acesso em: 12 de setembro de 2020
REFERÊNCIAS 
Li, G , Fan, Y , Lai, Y , et al. Infecções por coronavírus e respostas imunológicas. J Med Virol . 2020 ; 92 : 424 - 432 . Disponível em< https://doi.org/10.1002/jmv.25685>. Acesso em 14 setembro 2020.
SINHA, N.; BALAYLA, G.; Sequential battery of COVID-19 testing to maximize negative predictive value before surgeries. Rev. Col. Bras. Cir. vol.47 Rio de Janeiro 2020 Epub Julho 10, 2020. Disponível em<https://doi.org/10.1590/0100-6991e-20202634>. Acesso em 14 de setembro de 2020
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