Relatório da Aula Prática de bioagentes

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ - UECE
CENTRO DE CIÊNCIAS - CCS
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENFERMAGEM
DISCIPLINA DE BIOAGENTES PATOGÊNICOS
EMILLY VERAS
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA DA DISCIPLINA DE BIOAGENTES PATOGÊNICOS
FORTALEZA
2021
1. INTRODUÇÃO
A técnica de Gram, mundialmente conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta ou violeta de genciana, lugol, etanol-acetona (descorante) e fucsina. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho ou rósea são chamadas de Gram-negativas. 	Comment by Emilly Veras: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/coloracao_de_gram_620520_620521_620181_621000_620511_620511_621218_621219_620515.pdf
A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias.
O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o violeta de genciana, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo violeta-iodo é removido, descorando as células. 
A técnica de coloração Gram em análises clínicas é usada principalmente para identificar preliminarmente a morfologia das bactérias ou para estabelecer se há um número significativo de bactérias nas amostras clínicas.
2. OBJETIVO
Identificar e diferenciar bactérias gram-positivas e gram-negativas.
3. MATERIAL
	Material: Culturas bacterianas, água destilada, corante violeta cristal, corante fuccsina, lugol, etanol, bico de chama (lamparina), lâmina de vidro, alça de inoculação e microscópio ótico.
	Soluções em ordem de aplicação
	Reação do aspecto das bactérias Gram-positivas	Comment by Emilly Veras: https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/2843125/mod_resource/content/1/Colora%C3%A7%C3%B5es%20Gram%20e%20Ziehl.pdf
	Reação do aspecto das bactérias Gram-negativas
	Cristal violeta
	Coradas em violeta
	Coradas em violeta
	Solução de Iugol
	Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta
	Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta
	Álcool-acetona
	Desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade; o complexo CV-I não pode sair da célula, que permanece violeta
	Extração dos lipídeos da parede celular, aumento da porosidade; o complexo CV-I é removido da célula
	Fucsina ou safranina
	A célula não é afetada, permanece violeta
	A célula adquire o corante, tornando-se vermelha
4. MÉTODO E PROCEDIMENTO
1. Fazer o esfregaço da cultura bacteriana na lâmina de vidro e em seguida, a fixação da cultura usando a chama da lamparina.
2. Cobrir o esfregaço da cultura em estudo com o corante violeta de cristal (CV). Deixar atuar por 1 minuto. Nota: Após esta etapa, todas as células firam coradas com o CV, o corante primário.
3. Escorrer o CV e lavar a lâmina com água destilada. Secar com papel de filtro ou lenço de papel macio, sem esfregar.
4. Cobrir a preparação com o Lugol e deixar atuar durante 1 minuto.
5. Escorrer a solução de Lugol, lavar com água destilada e secar com papel. Nota: O iodo da solução de Lugol forma um complexo insolúvel com o corante primário. O complexo cristal de violeta-iodo (CV-I) formado apresenta uma cor mais intensa (violeta escuro) do que o CV livre e é mais difícil de remover das células.
6. Diferenciar pelo álcool a 95⁰GL, deixando cair gota a gota o álcool sobre a lâmina preparada até que não saia mais corante.
7. Lavar com água destilada, escorrer e secar com o papel.
8. Tornar a corar a lâmina preparada com a solução de Fucsina (conta-orante), durante 5 minutos.
9. Escorrer o corante, lavar com água destilada e secar com o papel.
10. Examinar a lâmina + amostra no Microscópio óptico com objetiva de 4 ou 10X. 
Os resultados após a coloração de Gram permitem classificar as bactérias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas.
Quando as estruturas celulares são cobertas pela coloração violeta ou cristal, todas as células ficam com a cor roxa ou violeta. Com a aplicação do Lugol, ocorre a formação do complexo iodo-CV, que tem como propriedade fixar o corante primário nas estruturas coradas.
Algumas estrturas perdem a cor violeta rapidamene, quando ocorre a lavagem com álcool etílico, enquanto outras perdem sua coloração mais devagar ou completamente. O corante fucsina (róseo) colore novamente as estruturas que foram descoradas. 
5. RESULTADO E DISCUSSÃO
Resultados da Coloração de Gram dos microrganismos analisados em aula prática
	Cultura Analisada
	Gram-Positiva
	Gram-Negativa
	Formato Celular
	Lactococcus
(LN-17 -BAL)
	X
	
	Cocos
	Lactococcus lactis ssp cremoris
(LN-21 -BAL)
	X
	
	Cocos
	Lactococcus
(LN-29 -BAL)
	X
	
	Cocos
	Escherichia coli
	
	X
	Bacilos
	Staphylococcus aureus
	X
	
	Cocos
Observa-se a predominância de Gram-Positiva de formato celular, em sua maioria, do tipo Cocos.
Sabe-se que os microrganismos respondem diferentemente a este método. Isso ocorre, porque existe diferenças estruturais em suas paredes celulares, assim afeta a retenção ou a liberação de uma combinação de cristal violeta e iodo, denominada de complexo cristal violeta-iodo (CV-I). Entre outras dissemelhança, as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular de peptideoglicano mais espessa (dissacarídeo e aminoácidos), enquanto as gram-negativas contém uma camada de lipopolissacarídeos (lipídeos e polissacarídeos) como parte de sua parede celular.
Diante do exposto, após a aplicação do corante violeta de cristal, juntamente com o Lugol, apresentando iodo na sua composição, tanto nas bactérias gram-positivas como nas gram-negativas, há uma fácil penetração dessas substâncias nas células. Dentro das mesmas, a formação do complexo CV-I pela união do cristal de violeta e do iodo, devido ao seu tamanho, não pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das células gram-positivas pelo álcool a 95% GL. Com isso, as células gram-positivas retêm a cor do corante violeta de cristal.
Nas células gram-negativas, contudo, a lavagem com o álcool a 95% GL rompe a camada externa de lipopolissacarídeo, e o complexo CV-I é removido, por meio da camada delgada de peptideoglicano. 
Como resultado, as células gram-negativas permanecem incolores até serem contracoradas com a Fucsina, quando adquirem a cor rosa.
Em resumo, as células gram-positivas retêm o corante violeta de cristal, permanecendo com a coloração púrpura. Enquanto, as células gram-negativas não retêm o corante violeta de cristal, tornando-se incolores até serem contracoradas com a Fucsina.
A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bacterianas. Essa técnica é empregada com elevada significação taxonômica. Assim, são os gram-positivos quase todos os bacilos esporulados, móveis por flagelos peritríquios e a quase a totalidade dos cocos. Enquanto que os gram-negativos são a quase totalidade dos bacilos não esporulados, móveis por flagelos peritríquios ou polares, e todasas espiroquetas, apenas para exemplificação.
Ademais, a reação de Gram tem enorme importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são observadas e caracterizadas como gram-negativas, na maioria dos casos, ou gram-positivas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Fornece também informações valiosas para o tratamento da doença. As gram-positivas tendem a ser mortas facilmente com antibióticos por penicilina e cefalosporinas. Já, as gram-negativas geralmente mais resistentes, porque os antibióticos não podem penetrar a camada de lipopolissacarídeos.
Gram-Negativa				 Gram-Positiva
Escherichia coli 		 Lactoccocus ssp cremosis (LN-21)
Visão microscópica (100X)		 Visão microscópica (100X)
 
Gram-Positiva Gram-Positiva
Lactoccocus (LN-29)	 Staphyloccocus aureus
Visão microscópica (100X)	 Visão microscópica (100X)	
 
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As dissemelhanças entre as bactérias gram-positivas e gram-negativas encontram-se na estrutura da parede celular, assim reagem de maneira distinta a essa técnica de coloração. Já que as gram-positivas permanecem azuis ou violetas (púrpura) e as gram-negativas tornam-se vermelhas ou róseas. A partir disso, pode caracterizar a taxonomia das bactérias, além de serem alvos farmacológicos distintos.
Ademais, para os estudantes do Centro de Ciências da Saúde, particularmente do curso de enfermagem, a aula prática de coloração de Gram é de fundamental
importância não só pelo alto nível de aproveitamento, mas também pela aplicação clínica. Pois, a conduta tanto do cuidar como da escolha do antimicrobiano, deve-se pela classificação de gram-positiva ou gram-negativa, devido à composição química da parede celular bacteriana, sendo obtida pelo método de Gram discutido anteriormente.
7. REFERÊNCIAS
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia: 10.ed.Porto Alegre: Artmed, 2012.
SOARES, Juarez B.; CASIMIRO, Antônio R. S.; ALBUQUERQUE, Laurênia M. B. Microbiologia Básica: 2.ed. Fortaleza: Editora UFC, 1991.
MORETTI, Paulo E. Microbiologia, fundamentos e aplicações: métodos em
microbiologia: Coloração de Gram. Americana, 2007.
VIEIRA, Darlene A. de P.; FERNANDES, Nayara C. de A. Q.; Microbiologia Geral: Inhumas: IFG; Santa Maria: Universidade Federal de Santa Maria: Rede e-Tec, 2012