TESTES SOROLÓGICOS

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AULA 3 E 4– TESTES SOROLÓGICOS 
DANIELA F RANCO 
O objetivo dos testes sorológicos é detectar 
imunoglobulinas. Queremos ver as ligações de antígeno e 
anticorpo para ver se está (IgM) ou já teve (IgG) 
determinada doença. Se ela já teve precisamos saber quais 
são as imunoglobulinas. 
Podemos procurar os antígenos ou os anticorpos. 
▪ Se vou fazer busca de antígeno precisamos de qual tipo de 
fluido biológico? Precisamos procurar um pedaço do vírus 
como por exemplo dengue, o fluido usado é o sangue, e o 
fluido biológico para procurarmos o anticorpo podemos 
usar o plasma que veio do sangue. 
▪ Quando pensamos em imunocomplexo precisamos 
lembrar que temos a resposta imune inata que não é 
específica e algumas fazem a apresentação dos antígenos 
para os linfócitos como TCD4 (direciona a galera). Ele 
apresenta o problema para o TCD8 e o linfócito B, e o B vira 
plasmócito e ele vai secretar as imunoglobulinas. Elas 
fazem a opsonização, neutralização e ativa complemento. 
Na expansão clonal temos vários anticorpos (policlonais, 
IgM e IgG) sendo produzidos específica para o antígeno. 
Para cada ponto do antígeno ele produz um anticorpo para 
poder destruir. Então ele faz a expansão clonal poli clonal 
(para vários pontos). Meu organismo reconhece qual ponto 
específico que ataca as células e começa a ter anticorpo de 
memória específica. Se a chave que faz mal ele produz um 
específico para a chave, então é um anticorpo de memória 
específica então ele faz um anticorpo monoclonal 
específico para o problema. 
DIAG NÓS TICO S OR OLÓG ICO DAS INF ECÇÕES 
Se a pessoa já teve contato com a doença podemos 
verificar a presença de IgG. 
Detecção de anticorpos: Importância Diagnóstica 
Imunoglobulinas – Produzidas em resposta a estímulos 
antigênicos. Moléculas funcionais e heterogêneas que se 
ligam aos antígenos para ação efetora. 5 classes: IgM, IgG, 
IgA, IgD e IgE 
Detecção de IgM: Infecção recente (infecção aguda) 
Detecção de IgG: Infecções anteriores; Pacientes vacinados 
No lab. clínico determinamos o estado imunológico ou as 
vezes conseguimos saber se ela já teve contato com as 
doenças. O IgM é o primeiro a subir, o IgG demora mais. 
IgM demora mais em torno de 7 dias. 
 
 
 
 
Características dos 
anticorpos: O anticorpo 
IgM tem 5 ligados (penta). Tem a porção FAB vai se lidar ao 
antígeno, é a porção variável, é onde é específico para cada 
antígeno. A porção FC é não variável, se liga nas nossas 
células, (realiza a ação) tem opsonização, ativação de 
sistema complemente, etc. 
Epítopo é a região do microrganismo onde o anticorpo se 
liga. Quando tem poli clonal tem vários anticorpos se 
ligando a vários epítopos. Monoclonal sabe exatamente 
onde se ligar, é um epítopo só. São ligações não covalente e 
reversíveis, são ligações fracas, mas que juntas ficam fortes, 
porém liga e desliga. 
O linfócito B produz um tipo de anticorpo só, policlonal é 
quando vários linfócitos produzem vários diferentes 
anticorpos para vários epítopos, depois de um tempo o 
corpo produz um anticorpo monoclonal (escolhe qual é o 
melhor epítopo para combater), específico para um 
epítopo. Os linfócitos que produziu os anticorpos se 
multiplicam (fazem expansão clonal) para deter os 
microrganismos. 
Afinidade entre o anticorpo e o epítopo, melhor afinidade, 
mais específico será. 
Especificidade: (da ligação) quando melhor o encaixe 
melhor a afinidade e mais específico a interação, que 
interfere nos cálculos. Quando mais específico, menos 
sensível. 
A reação cruzada, existem epítopos muito semelhantes aí 
não consegue distinguir os subtipos. Pode achar que está 
com dengue e ter Zika, por que o epítopo é muito parecido. 
Tem um falso positivo. 
 
PRODUZINDO ANTICORPOS 
Poli clonal: Usa 
animais para 
produzir 
anticorpos, injeta o 
antígeno e o animal 
vai produzir 
anticorpos, depois 
de um tempo o 
linfócito B teve a expansão e tem anticorpos poli clonais. 
Monoclonal; em vez de injetar problema no animal, pode 
fazer in vitro, faz a seleção e separa as células do linfócito B. 
Pega o mieloma (linhagem cancerígena) e forma um híbrido 
com linfócito B do 
animal (se 
diferenciando em 
plasmócito) e junta 
com células, e essa 
vai secretar 
imunoglobulina. 
Separa uma por 
uma; Cada célula 
produz um 
anticorpo que reconhece um epítopo, tem o monoclonal. 
MÉTODOS 
S OR OLÓG ICOS : 
Reagentes não marcados (A ligação do Ac altera o estado 
físico do Ag) ▪ Reação de aglutinação ▪ Reação de 
precipitação 
Reagentes marcados ▪ RIA ▪ ELISA ▪ IF, citometria de fluxo ▪ 
Western Blotting. 
IMUNOF LUOR ES CÊNCIA 
Tem uma substância no anticorpo ai se tiver antígeno 
quando coloca a luz da pra ver ai o teste é positivo. Baseia-
se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem 
covalentemente a fluoro cromos sem perder sua 
reatividade específica com o Ag. 
FLUOROCROMOS O resultado é analisado em microscópio 
de fluorescência. 
Técnicas de Imunofluorescência (IF) Combinam corantes 
fluorescentes (fluoresceína) com anticorpos e quando 
expostos à luz UV AC fluorescentes. 
Testes IF diretos: vai detectar antígeno, procura direto no 
tecido em dúvida. Se tem antígeno na amostra tem 
formação de imunocomplexo, anticorpo é marcado com 
florocromo. Na lâmina vem fluido biológico, supondo que 
tenha antígeno nessa amostra, o kit do laboratório tem 
anticorpo marcado com florocromo, se tem antígeno na 
amostra forma o imunocomplexo (eles se ligam), faz 
lavagem, que não é suficiente para desmanchar o complexo 
(mas se tiver só o antígeno ele desmancha e o reste da 
negativo pois não fica 
colorido). No microscópio 
de fluorescente vai emitir 
luz que estimula o 
florocromo a brilhar, aí 
brilho é positivo. 
 
Testes IF indiretos: busca anticorpo, busca no sangue 
(soro). No kit tem que ter 
antígeno, aí na amostra vai 
ter anticorpo e eles vão se 
ligar. O anticorpo aqui está 
sem florocromo, coloca 
anti-anticorpo que possui 
florocromo. 
 
 
 
EXEMPL O: SÍ FI L IS TESTE TREPONÊMI COS 
Imunofluore sc ê nc ia indire ta. Te m inte raç ão Ac 
e spe c ífic os do soro c om o Ag tre pononê mic os pré -
fixados e m lâmina de mic rosc opia. Re ve laç ão anti -
IgG/IgM humano marc ada c om isotioc ianato de 
fluore sc eína (florocromo). 
CITOMETRIA DE FL UXO 
É uma imunofluorescência modificada. Além da 
fluorescência tem contagem de células e tamanho por 
fluxo. É um aparelho que conta células e consegue 
diferenciar por tamanho, complexidade (pelo o que tem 
dentro da célula) e consegue identificar a marcação do 
florocromo. Utilizado para fazer hemograma. Fala quem é 
CD4 e CD8 e ele identifica. Mais sensível e mais específico. 
➢Separação de células marcadas por fluorescência 
➢ Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou 
Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) 
➢ Cada Ac é marcado 
com um fluorocromo 
diferente 
➢ Teste qualitativo 
(sim/não) e quantitativo 
(quantas) 
IMUNOHISTOQUÍMICA 
Em vez de brilho tem enzima, que sofre reação química e 
onde tem ligação antígeno e anticorpo fica marrom. 
➢ Detecção de células infectadas em cortes histológicos 
➢ As amostras são, então, incubadas com substratos 
enzimáticos (quando Ac está marcado com enzima), 
gerando uma coloração castanha ou vermelha, que reflete 
a distribuição do antígeno alvo no tecido/célula analisado. 
AUL A 4 
REAÇÕES DE AGL UTINAÇÃO 
Na aglutinação que ocorre no lab. não tem ação da 
coagulação porque só teremos dentro do tubo hemácia 
sensibilizada e o epítopo. Se aglutina tem ligação do 
antígeno com o anticorpo. 
AGLUTINAÇÃO DIRETA: detectam anticorpo contra 
quantidade relativamente grandes de antígenos celulares 
como hemácias, bactérias e fungos 
AGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVA: os anticorpos 
contra antígenos solúveis podem ser detectados por testes 
de aglutinação. Os antígenos são adsorvidos em partículas 
como bentonita ou mais frequentemente esferas de látex 
minúsculas. 
O aglutinado é ospontinhos, significa 
que antígeno e 
anticorpo se ligaram. 
 
Semi-quantitativo: é a titulação da concentração de 
anticorpo. 
 
➢ TIPAGEM SANGUÍNEA: 
 
No reagente tem 
anticorpo contra A ou 
B ai vê o que acontece. 
Se coloca anti-A e 
aglutina no A significa 
que tem antígeno A. 
No sangue tipo O não 
aglutina, pois não tem 
antígeno. 
 
 
➢ TESTE DE COOMBS: 
O fator Rh é um dos dois grupos de antígenos eritrocitários 
de importância clínica, envolvido nas reações transfusionais 
hemolíticas e na doença hemolítica do recém-nascido. 
Material analisado é o sangue hemaglutinação, quando 
reações de aglutinação envolvem a agregação de hemácias. 
O anticorpo precisa do soro. 
Teste de Coombs direto: detectar IgG ligados a hemácias 
de um indivíduo. Tem a mostra de sangue do paciente, 
coloca reagente com anticorpos e vê se reconhece o 
anticorpo presente na amostra. consiste em detectar a 
presença de IgG ligados às hemácias de um indivíduo > 
detecção da anemia hemolítica 
Teste de Coombs indireto: quero saber se tem anticorpo, 
ele não está ligado na hemácia, vai pegar o soro. Se o 
paciente tiver o anticorpo, o regente vem com hemácias e o 
anticorpo se liga, e ocorre ligação. Depois vem reagente de 
coombs que tem anticorpos que reconhecem anticorpo, e 
tem aglutinação. Significa que o paciente tem ANTI-D (a 
mãe nativa teve um feto + e desenvolve o anti-D, por isso 
que na hemácia dela não se liga, por isso precisa colocar 
outra). 
 
➢ VDRL 
Técnica para saber concentração de partículas do 
treponema. Quando mais treponema no soro e tiver 
aglutinação, maior o título da reação (prognóstico ruim). Se 
pensar em anticorpo é ao contrário (melhor pro 
organismo). 
Diluição seriada: pega o sangue, centrifuga e betem uma 
parte com soro. E faz diluição seriada com o soro para 
verificar a concentração de antígeno ou anticorpo para ter 
dimensão do problema. A diluição serve para diminuir a 
concentração de soluto, diluição em serie logarítmica na 
base 2, vai diluindo. 
½ significa que eu peguei uma porção de soro mais uma 
porção de solvente. 
¼ usa 1 de soro e 3 de solvente. 
 
No laboratório fazemos isso dividindo em vários tubos. 
Pegamos 12 tubos ex, cada um tem 200 mcl. Adicionamos 
no primeiro 200 (200/400à ½), pegamos 200 do primeiro 
frasco e colocamos no segundo (1/2/2à 1/4), ai pegamos no 
segundo frasco e passamos para o terceiro (1/4/2à 1/8). 
Diluindo em escala logarítmica dilui ½ e aglutinou, 
pesquisando anticorpo, só que outro dilui até o 1/128 
então o título desse de anticorpo é maior porque ele está 
bem mais diluído e ainda assim encontra os anticorpos. Se 
fosse antígeno quem estaria com mais antígeno é o que 
está mais diluído. 
Se em ½ aglutina e ¼ não aglutina mais, tem menos 
anticorpo, se no 1/254 aglutina significa que tem mais 
anticorpo, ele ta melhor que o 1/4. Se fosse antígeno o do 
1/254 é pior. 
TESTE IMUNOENZIMÁTICO - ELISA 
Se gue a me sma ide ia da imunofluorescê nc ia s ó q u e 
e m ve z de fluoroc romo c oloc a um substrato 
dife re nte. 
EL I SA DI RETO : Procura antígeno, na plaquinha vai ter já 
ligado um anticorpo que reconhece o problema que está 
pesquisando. A amostra do paciente vai ter antígeno, 
digamos que seja positivo, vai ligar antígeno anticorpo. Se 
for negativa não acontece nada. O anticorpo é conjugado 
com uma enzima, se for positivo tem reação 
imunoenzimática que fica colorido na plaquinha. Joga 
substrato e vê tem alteração de cor. Só muda de cor se 
ocorrer a formação de imunocomplexo. 
EL I SA I NDI RETO : Nessa estamos procurando o anticorpo. 
Na placa teremos o antígeno, e o fluido biológico usado 
usamos o soro do paciente. O anticorpo (do paciente, 
amostra) reconhece o anti anticorpo (a gente adicionou) e 
ele tem enzima ligada a ele, quando joga o substrato o 
ambiente muda de cor. 
Se o resultado der bem no cut off: limiar de detecção. Será 
que é positivo ou negativo? Para isso precisamos fazer um 
outro tipo de ensaio mais específico. Mais sensível e mais 
especifico que o Elisa. (Western Blottng) 
 
WESTERN BL OTTING 
Vai detectar proteína de partícula viral. Tem um marcador 
de peso molecular, e esse me fala o tamanho das proteínas, 
compara com o tamanho das proteínas do vírus. E coloca 
anticorpos específicos para as proteínas virais detectadas, e 
depois visualiza por quimiofluorescencia, e conseguimos 
visualizar as proteínas virais. 
 
Se aparecer nessa fita é positivo, tem certeza que a 
proteína do vírus está lá. 
O Elisa é bom para triagem porem esse é mais sensível e 
mais específico. 
IMUNOCROMATO GRAFIA DE FL UXO L ATERAL – 
TESTE RÁ PIDO 
 
Se for anticorpo o fluido biológico é sangue. Tem 3 áreas, 
coloca no fluido biológico no começo, tem a linha teste a e 
a linha controle. Na região que não aparece nada tem 
anticorpo, na linha teste tem anticorpo também, e na linha 
controle tem anticorpo também. Se for covid, eu tenho 
anticorpo marcado com ouro coloidal (deixa rosa) e esse 
fica na região onde não enxergamos nada, o anticorpo 
reconhece esse negócio. Pinga (soro) no começo e vai 
andando se o paciente for positivo o antígeno liga com o 
anticorpo (contra a covid por exemplo) e vai andando 
levando os anticorpos ligados na covid, e na linha teste tem 
anticorpo contra covid, liga tudo. Na linha controle 
reconhece o anticorpo do início por isso sempre da positivo 
nessa linha, é um anti – anticorpo da primeira área. 
 
 
Resultados: IgG e IgM da pra ver. Quando não tem linha 
controle o teste está inválido. 
 
Se for de antígeno pega nasofaringe em vez de soro, mas o 
mecanismo é o mesmo só inverte se tem anticorpo ou anti-
anticorpo. 
ENSAIO DE NEUTRAL IZAÇÃO 
Consegue detectar quanto de anticorpo tem naquela 
diluição seriada. O anticorpo faz neutralização (não deixa 
vírus entrar nas células) e faz isso pra ver a resposta imune 
do paciente (imunidade humoral). 
Pega soro do paciente (mede anticorpo) para saber se é 
neutralizante ou não, preciso de partículas virais, para ver 
se o anticorpo se liga e neutraliza o vírus. Faz a diluição 
seriada na base 10, e junto com o soro do paciente coloca 
concentração que eu conheço de vírus, por exemplo, 100 
partículas virais junto cm soro do paciente, pois quando eu 
colocar na células vai ter 100 placas de lise, e contamos pra 
ver se o anticorpo está fazendo neutralização.