Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

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Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
É utilizada na amplificação do DNA por inteiro ou mesmo para a amplificação de uma
única região de interesse. A PCR baseia-se na estrutura do DNA, que é formado por
uma dupla-hélice estabilizada internamente por pontes de hidrogênio, as quais se
rompem facilmente com a elevação da temperatura até certo ponto, deixando
expostas as bases nitrogenadas. Essa técnica permite a amplificação em até 1 bilhão
de vezes do fragmento que se queira amplificar. Assim, quando se dispõe de
amostras em pequenas quantidades essa técnica revela-se de extrema importância.
Reconhecida com o Prêmio Nobel de Química em 1994, a técnica de Reação em
Cadeia de Polimerase (PCR) proporcionou avanços na pesquisa científica,
principalmente em biologia molecular. A técnica trouxe benefícios que
impulsionaram o sequenciamento genético para testes de paternidade e
investigações forenses, expressão gênica em sistemas recombinantes, além do
diagnóstico de doenças e testes de novos medicamentos.
PCR Convencional
Consiste na replicação de sequências específicas de DNA utilizando equipamentos
termocicladores. Para realizar a reação acrescentam-se às amostras de material
genético sequências iniciadoras complementares (também conhecidas como primers),
desoxirribonucleotídeos e DNA-polimerase termo resistente.
Através da variação cíclica de temperaturas realizada pelo termociclador ocorre a
desnaturação das fitas complementares de DNA, o anelamento de primers com suas
regiões específicas de cada fita e a replicação do fragmento pela enzima DNA-
polimerase. Após realizar um determinado número de ciclos, obtém-se milhares de
cópias da sequência gênica de interesse.
T-PCR
Na Polimerase por Transcriptase Reversa (RT-PCR) as moléculas de RNA são
convertidas em DNA complementar (cDNA) através da atividade da enzima
transcriptase reversa. Em seguida, os cDNAs recém-sintetizados são amplificados
através dos mesmos procedimentos descritos na PCR convencional.
qPCR
A técnica de PCR quantitativa (qPCR) utiliza os princípios básicos da PCR com o
diferencial que permite a quantificação do material amplificado em tempo real.
Termocicladores especializados são capazes de fornecer condições ideias de
temperatura para a amplificação, bem como de detectar os sinais emitidos por
reagentes específicos à medida que o DNA é amplificado.
A grande vantagem dessa aplicação é a rapidez na obtenção dos resultados. Além
disso, é amplamente utilizada em associação à RT-PCR (qRT-PCR ou RT-qPCR),
principalmente na área diagnóstica.
Como as técnicas de PCR demandam o uso de altas temperaturas, a realização
dessas reações requer atenção especial na seleção dos materiais que são utilizados.
Esses cuidados devem envolver desde a seleção dos reagentes (enzimas
polimerases, primers e nucleotídeos), até consumíveis plásticos utilizados como
tubos, placas, tampas e selos.
O uso de materiais impróprios pode interferir liberando inibidores ou contaminantes
na reação. Por isso, é sempre importante utilizar materiais confeccionados em
plástico homogêneo e com paredes finas para a melhor transferência térmica, com
certificação de esterilidade e livres de contaminantes como DNases, RNases e
materiais genéticos.