Princípios Diagnósticos na Microbiologia

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Gabriela Lacerda 
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Princípios Diagnósticos 
Microscopia 
A microbiologia clínica é fundamental 
para o diagnóstico de doenças, bem como 
identificação de parasitas, bactérias e vírus, 
com o intuito de gerar uma terapêutica mais 
adequada para o paciente. 
 
A microscopia tem duas funções básicas 
na microbiologia: 
1. Detectar 
2. Identificar preliminar ou definitiva-
mente microorganismos. 
 
Características morfológicas são muito 
utilizadas para a identificação preliminar da 
maioria das bactérias, e para a identificação 
definitiva de fungos e parasitas. No entanto, 
pode ser usado para detectar também inclu-
sões virais presentes em células infectadas. 
 
Há cinco métodos gerais de microscopia: 
1. Microscopia de Campo Claro: 
É utilizada uma fonte de luz, que ilumina o 
material analisado; um condensador, que 
concentra a luminosidade sobre o material; e 
um conjunto de lentes – lente objetiva e lente 
ocular – que amplia a imagem das estruturas. 
 
2. Microscopia de Campo Escuro: 
A diferença desta para a microscopia de 
campo claro é que, na microscopia de 
campo escuro, o condensador impede que 
a luz ilumine diretamente o local. Apenas 
uma luz oblíqua e dispersa atinge o material 
a ser visualizado, passando pelo sistema de 
lentes, fazendo com que o material fique ilu-
minado contra um fundo preto. Sua vanta-
gem é o poder de resolução substancial-
mente aumentado em relação à microsco-
piade camplo claro, possibilitando visualizar 
bactérias delgadas. Sua desvantagem é a 
má visualização das estruturas internas do mi-
crorganismo, já que a luz ilumina mais o seu 
entorno. 
 
3. Microscopia de Fluorescência: 
Os microrganismos e amostras com fluorófo-
ros aparecem brilhantes, em contraste com o 
fundo, e esse contraste é suficiente para que 
a amostra seja localizada rapidamente em 
 
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menor aumento e, então, examinada em 
menor aumento. 
 
4. Microscopia de Contraste de Fase: 
Permite uma melhor visualização das estrutu-
ras internas do microrganismo, na medida em 
que os feixes paralelos de luz são desviados 
ao passar através de objetos com diferentes 
densidades. 
 
5. Microscopia Eletrônica: 
São utilizadas espirais magnéticas no lugar de 
lentes. A ampliação e resolução são drasti-
camente melhores na microscopia eletrô-
nica. As amostras são geralmente coradas ou 
revestidas com íons metálicos para criar con-
traste. Há dois tipos de microscópio eletrôni-
cos de transmissão: os de transmissão e os de 
varredura. 
 
Tipos de amostras 
Diversas amostras podem ser utilizadas 
para o diagnóstico microbiológico e a solici-
tação de uma determinada amostra de-
pende do raciocínio clínico e hipótese diag-
nóstica do médico que a solicitou. Como 
exemplos mais comuns de amostra tem-se: 
sangue, urina, fezes, amostras provenientes 
do aparelho reprodutor, amostras provenien-
tes do sistema respiratório, exsudato cutâneo 
e líquidos corporais, como bílis, líquor e líquido 
articular. 
 
Meio de cultura 
Os meios de cultura são fundamentais 
para a identificação de microrganismos, prin-
cipalmente de bactérias, visto que permitem 
a multiplicação do patógeno sob condições 
controladas no laboratório. Eles podem se di-
vidir fundamentalmente em três categorias: 
1. Não seletivos: Meio que contém nutri-
entes que favorecem o crescimento 
da maioria dos microrganismos. 
 
2. Seletivos: Possui um ou mais agentes 
que inibem todos os microrganismos 
com exceção daqueles que se deseja 
obter. 
 
3. Diferenciais: Utilizado principalmente 
para bactérias, uma vez que permite 
a diferenciação delas, pois possui fa-
tores que permitem que as colônias 
bacterianas demonstrem certas ca-
racterísticas. 
 
 
 
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Métodos de Coloração 
1. Exame Direto: 
São os métodos mais simples de separação 
de amostras para visualização microscópica. 
A amostra pode ser suspensa em água ou 
soro fisiológico (exame a fresco), misturada a 
uma substância alcalina para claficação do 
material (método do hidróxido de potássio – 
KOH), ou misturada a uma substância alca-
lina e um corante de contraste. 
 
2. Coloração Diferente: 
Uma variedade de colorações diferentes são 
utilizadas para corar organismos específicos 
ou componentes de material celular. A mais 
conhecida de todas é a coloração de Gram, 
que serve de base para a classificação das 
bactérias. 
 
3. Coloração Acidorresistentes: 
Essas colorações exploram o fato de alguns 
microrganismos reterem sua coloração pri-
mária mesmo ao serem expostos a fortes 
agentes descolorantes, como álcoois e áci-
dos. A coloração de Ziehl-Neelsen é o mais 
antigo desses métodos, mas requer aqueci-
mento da amostra durante o processo. Já 
existem métodos empregados de coloração 
a frio, como o método de Kinyoun, ou por co-
loração fluorescente, como o método da au-
ramina-rodamina. 
 
4. Coloração Fluorescente: 
Dentre os exemplos principais, temos a colo-
ração laranja de acridina, coloração com 
cálcofluor branco e coloração direta com 
anticorpo fluorescente. 
 
Cultura in vitro 
 In vitro: cultivo em laboratório. 
O sucesso dos métodos de cultura de-
pende de algumas variáveis: 
• Biologia do organismo; 
• Local de infecção; 
• Resposta imune do paciente à 
infecção; 
• Qualidade do meio de cultura. 
 
Os meios de cultura podem ser dividi-
dos em: 
• Meios enriquecidos não seleti-
vos; 
• Meios seletivos; 
• Meios diferenciais; 
• Meios especializados. 
 
 
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Detecção do material genético microbiano 
Sondas Genéticas: Sondas de DNA po-
dem ser usadas para detectar, localizar e 
quantificar sequências específicas de ácido 
nucleico. Espécies ou cepas individuais de 
um agente infeccioso podem ser detecta-
das, mesmo que não estejam crescendo ou 
se replicando. 
 
Diagnóstico Molecular 
Durante uma infecção, os microrganis-
mos costumam deixar resíduos no hospe-
deiro, sejam estes fragmentos de DNA, prote-
ínas, entre outros. Diante disso, o diagnóstico 
molecular é feito por meio dessas moléculas 
e permite a identificação de diferenças ge-
notípicas, ajudando em casos de resistência 
farmacológica, por exemplo. 
Existem diversos tipos de métodos para 
realização do diagnóstico molecular. A seguir 
veremos os dois mais comuns: 
Eletroforese: método habitualmente 
usado para separar e purificar macromolé-
culas, principalmente ácidos nucleicos e pro-
teínas. Essas macromoléculas são submetidas 
a um campo elétrico, na qual migram com 
velocidades distintas para um polo positivo 
ou negativo de acordo com a sua carga, e 
consequentemente, permitem a sua separa-
ção. 
Reação em Cadeia de Polimerase 
(PCR): amplifica poucas cópias de DNA viral 
um milhões de vezes e é uma das técnicas 
mais recentes de análise genética. Nessa 
técnica, uma amostra é incubada com pri-
mers, uma DNA polimerase termoestável, nu-
cleotídeos e tampões. 
 
Diagnósticos Sorológicos 
O diagnóstico sorológico é feito por 
meio da imunologia, com a avaliação da 
resposta de antígenos e de anticorpos em 
uma amostra, o que permite identificar o pa-
tógeno. As sorologias podem possuir resulta-
dos quantitativos ou qualitativos, sendo o pri-
meiro relacionado aos títulos de antígenos e 
anticorpos, enquanto o segundo está relaci-
onado com a presença ou ausência deles. 
 
Existem alguns métodos de detecção, 
dentre eles destacam-se: 
1. Imunofluorescência direta: 
Ocorre com a ligação de uma molécula flu-
orescente diretamente ao anticorpo por 
meio de uma ligação covalente. 
 
2. Imunofluorescência indireta: 
Ocorre quando uma molécula fluorescente é 
ligada a um anticorpo secundário, sendo 
 
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que este se liga a outro anticorpo relacio-
nado a um antígeno específico. 
 
3. Imunofluorescência enzimático: 
É realizado por meio de uma enzima que se 
conjuga a um determinado anticorpo,cau-
sando uma reação química que resulta na 
liberação de luz fluorescente. 
 
4. ELISA: 
 Ocorre por meio da captura e separação 
de um anticorpo específico relacionado a 
um antígeno específico, permitindo a quan-
tificação do mesmo por meio de um espec-
trofotômetro. 
 
5. Técnica de Western-blot: 
É uma variação do ELISA em que é feita a 
separação de proteínas virais por meio de 
eletroforese. É utilizada principalmente para 
a identificação de HIV. 
 
6. Sorologia: 
É o método mais utilizado. Permite a identifi-
cação de agentes infecciosos por meio de 
imunoglobulinas. O maior destaque é para as 
imunoglobulinas IgG e IgM, que permitem di-
ferenciar as infecções em agudas, crônicas, 
recentes ou prévia. 
Como exemplo: 
Paciente com IgG positivo e IgM negativo → 
pode ser indicativo de uma infecção prévia. 
Paciente com IgG negativo e IgM positivo → 
é indicativo de uma infecção aguda. 
Paciente com IgG positivo e IgM positivo → 
pode ser indicativo de uma doença crônica 
que agudizou ou de uma reinfecção.