Captulo_-_ELISA (2)

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VAZ, Adelaide José al.. Ciências Farmacêuticas - Imunoensaios-Fundamentos e 
Aplicações, 2ª edição. Guanabara Koogan, 07/2018. 
 
ELISA 
O imunoensaio enzimático (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) foi desenvolvido 
nos anos de 1970 e muito difundido comercialmente a partir de 1985, com o ensaio para 
anticorpos anti-HIV (à época, chamado de anti-HTLV III). 
É o ensaio mais comumente empregado nos laboratórios e baseia-se na imobilização de um 
dos componentes, antígeno ou anticorpo, em fase sólida, e na utilização de um conjugado, que 
também pode ser antígeno ou imunoglobulina, ligado a uma enzima, com a preservação da 
atividade enzimática e imunológica. Como o substrato forma um produto colorido, a alteração 
de cor é monitorada visualmente ou por meio de espectrofotômetro, que determina a relação 
entre a intensidade da cor e a quantidade do que está sendo analisado na amostra. O ELISA 
apresenta: 
•Elevadas sensibilidade e especificidade 
•Rapidez e custo baixo 
•Objetividade de leitura 
•Possibilidade de adaptação a diferentes graus de automação. 
O teste é empregado para detectar antígenos ou anticorpo em um grande número de 
sistemas. Sua eficiência depende da padronização adequada de cada uma das etapas e reagentes 
como concentração ideal de cada um dos componentes, tempo de incubação, concentração 
iônica, proteica e pH do meio. A simples modificação do lote de um sal utilizado em algum dos 
diluentes pode requerer a revalidação de todas as etapas do ensaio, para garantir a 
reprodutibilidade do teste. 
 
FASE SÓLIDA OU SUPORTE 
A fase sólida nos testes imunoenzimáticos pode ser constituída por partículas de agarose, 
poliacrilamida, dextrana, poliestireno. Vários desses materiais existem com diferentes 
características químicas, especialmente o poliestireno, que pode ser tratado para maior ou menor 
poder de adsorção de proteínas e até unido a acopladores (linkers) para facilitar ligações mais 
específicas com resíduos de açúcares, por exemplo. 
Fases sólidas de plásticos podem ser tratadas com produtos químicos, expondo sítios 
reativos (amino-, carboxi-, hidroxi-, tiol-), que facilitam a ligação de diferentes grupos 
químicos. Há várias fases sólidas tratadas disponíveis comercialmente. 
O polímero de estireno (poliestireno) possui sítios apolares hidrofóbicos, que facilitam 
adsorção de proteínas, e sítios polares hidrofílicos, que garantem a manutenção da conformação 
proteica. Os sítios polares formam-se durante a moldagem na presença de oxigênio, e as placas 
submetidas à esterilização por radiação gama, quando abertas e expostas ao ar, aumentam a 
quantidade desses sítios reativos. 
Os suportes (fase sólida) também se apresentam na forma de tubos, microplacas, 
partículas, tiras, entre outros. No formato de micropartículas, a etapa de lavagens deverá ser 
feita por decantação, centrifugação ou adsorção em fibra de vidro. Também podem se 
apresentar no formato de micropartículas magnetizadas, revestidas de poliestireno ou celulose 
(fase sólida) e no interior contendo óxido ferroso (magneto). Assim, as lavagens podem ser 
feitas pela captura das micropartículas na parede do tubo, pela ação de ímãs. 
Placas de poliestireno ou polivinil são amplamente utilizadas e permitem a realização de 
ensaios múltiplos em um único suporte, podendo ser sensibilizadas com antígeno ou anticorpo. 
A lavagem também é facilitada. Como desvantagem, a área onde ocorre o imunoensaio é menor 
do que no formato pérola ou micropartícula e, por esse motivo, raramente a placa é usada para 
ensaios de determinação de moléculas em baixa concentração, como hormônios e marcadores 
tumorais. 
Quando membrana de nitrocelulose é empregada como suporte, o teste é 
denominado immunodot ou dot-ELISA, apresentando leitura diferenciada, uma vez que o 
substrato cromogênico, na presença da enzima, forma um produto colorido insolúvel, na forma 
de uma mancha, no local onde o conjugado enzimático está fixado. Para o immunodot também 
podem ser usadas membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF), náilon ou celulose. 
A ligação do antígeno ou imunoglobulina à fase sólida deve ser estável e suportar as etapas 
e condições do ensaio. Soluções ligantes (coating solution) incluem íons, pH alcalino para 
poliestireno e alguns componentes protegidos por propriedade industrial. 
Nos ensaios in house, é suficiente o uso de solução tamponada carbonato-bicarbonato 0,5 
M, pH 8,6, mas a estabilidade da placa sensibilizada será reduzida em relação à validade comum 
de kits comerciais. 
 
AMOSTRA 
A amostra, preferencialmente soro ou plasma, deve ser processada na diluição em que uma 
pequena variação resulte em grande aumento da densidade óptica. A amostra ideal deve ser 
límpida, sem hemólise e não lipêmica, conservada por até 7 dias entre 2 e 8°C ou congelada a –
20°C, desde que evitados processos de congelamento e descongelamento frequentes. 
 
BLOQUEIO 
Após a adsorção da molécula (antígeno ou imunoglobulina) à fase sólida, é necessário bloquear 
os sítios reativos remanescentes na fase sólida, usando proteína bloqueadora que não tenha 
relação com o sistema antígeno-anticorpo em estudo. São muito utilizadas soluções de leite 
desnatado, caseína, gelatina e albumina. Em alguns ensaios que usam anticorpos monoclonais, a 
imunoglobulina de camundongo pode ajudar a reduzir a inespecificidade por anticorpo humano 
antimurino (HAMA, human anti-mouse antibodies). 
 
DILUENTE DA AMOSTRA 
Deve conter componentes que reduzam a adsorção inespecífica de componentes da amostra ao 
suporte sólido. Os componentes comumente empregados são o Tween 20, detergente não 
iônico, e proteínas, como leite desnatado, gelatina, albumina bovina e caseína, ou seja, proteínas 
que foram usadas no bloqueio, mas em menor concentração. 
 
SOLUÇÃO DE LAVAGEM 
São usadas soluções isotônicas, pH 6,8 a 7,5, contendo pequena concentração de detergente não 
iônico. Solução salina tamponada com fosfatos pH 7,2 (PBS, phosphate buffered saline) 
contendo 0,01 a 0,05% de Tween 20 é bastante usual. Sais de fosfato ficam insolúveis a baixa 
temperatura e cristalizam na solução mantida sob refrigeração. Por isso, o pré-aquecimento da 
solução de lavagem até 22 a 25°C é recomendado. Geralmente é empregada a repetição do 
processo de lavagem por 3 a 5 vezes, bem como um tempo de molho (soaking time) de cerca de 
30 a 60 s entre as lavagens, especialmente após incubação com o conjugado. 
 
CONJUGADOS 
Podem ser definidos como moléculas de antígenos ou anticorpos ligados covalentemente à 
enzima, de modo a conservar as duas funções das duas moléculas conjugadas: atividade 
enzimática da enzima e antigenicidade do antígeno ou especificidade da imunoglobulina. 
Contudo, é preciso considerar que a definição de conjugado é mais ampla: duas moléculas 
covalentemente ligadas e que preservam suas funções originais. Exemplos de conjugados: 
•Proteína A conjugada com peroxidase. A proteína A é derivada de parede bacteriana 
(Staphylococcus aureus) e apresenta elevada afinidade pela região Fc da IgG 
humana. Assim, o conjugado irá se ligar à IgG com atividade de peroxidase para 
formar produto colorido a partir do substrato cromogênico 
•Streptavidina-peroxidase. A streptavidina tem afinidade por biotina e irá se ligar a 
um outro conjugado, por exemplo, hCG-biotina. Ou seja, dois conjugados diferentes 
são usados no sistema 
•Anti-IgG conjugado a corante coloidal. Os corantes coloidais são insolúveis em 
meio aquoso e formam manchas coloridas (formado de linhas) na fase sólida onde 
são capturados. 
O desempenho do conjugado é influenciado pelo método de conjugação, diluentes 
empregados e condições de armazenamento. A quantidade ideal do conjugado no teste deve ser 
determinada para cada lote e cada sistema de ensaio. 
 
 
 
SUBSTRATOS CROMOGÊNICOS 
Sob ação enzimática, originam produtos coloridos, solúveis ou insolúveis, cuja 
quantificação é feita pelamedida da densidade óptica da solução em espectrofotômetro, ou pela 
intensidade de cor visual, ou comparada a algum padrão de referência. O substrato utilizado 
para a enzima peroxidase é o H2O2, que pode ser empregado com diversos cromógenos ou 
doadores de hidrogênio. O cromógeno frequentemente empregado é o ortofenilenodiamina 
(OPD) ou tetrametilbenzidina (TMB) para obter coloração solúvel (ELISA), e diaminobenzidina 
(DAB) ou 4-cloro-1-naftol quando o sistema requer cor insolúvel (dot-ELISA, immunoblot). A 
concentração de H2O2 é uma variável crítica do teste, devido à estabilidade limitada. Por outro 
lado, a peroxidase é inibida na presença de excesso de H2O2. 
Para a enzima fosfatase alcalina, o substrato cromogênico solúvel é o p-nitrofenilfosfato 
(NPP), e para obtenção de produto insolúvel é utilizado 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fostafo 
(BCIP) e nitroblue tetrazólio (NBT). 
 
SUBSTRATOS FLUORIGÊNICOS 
Alguns testes imunoenzimáticos utilizam substratos que, após ação da enzima, formam 
compostos que emitem luz fluorescente. Para a enzima fosfatase alcalina, é muito utilizada a 
solução de 4-metilumbelilferil-fosfato, que após clivagem enzimática forma 4-
metilumbeliferona, absorvendo luz a 365 nm e emitindo a 448 nm. O produto formado é 
chamado de fluoróforo e a luz emitida é detectada por um fluorômetro. 
 
SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE 
Para ensaios imunoenzimáticos que necessitem de amplificação do sinal (determinação de 
hormônios, marcadores tumorais), uma opção é o uso de quimiluminescência sistema de 
revelação. Por exemplo, a enzima fosfatase alcalina age sobre o substrato adamantildioexietano-
fosfato, formando o ânion adamantildioxietano, que é instável, emite brilho (glow) prolongado 
de luz e pode ser mensurado por um luminômetro. 
 
ANTÍGENOS 
Conjugados ou não à enzima, podem ser naturais, extratos brutos ou fracionados e purificados, 
peptídios sintéticos ou recombinantes (ver Capítulos 2 e 3). O grau de pureza e a acessibilidade 
dos epítopos são fatores determinantes na eficiência do teste. 
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter02.html
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter03.html
ANTICORPOS 
Conjugados à enzima ou não, podem ser policlonais ou monoclonais, totais ou purificados. 
Também podem ser empregados fragmentos ou frações de imunoglobulinas. A marcação da 
imunoglobulina com enzima é facilitada pela presença de resíduos de açúcar na fração Fc de 
imunoglobulinas (ver Capítulo 2). 
 
RESULTADOS 
Independentemente do método escolhido, é necessário determinar o limite de reatividade 
ou cut off que permite diferenciar amostras positivas daquelas negativas. Os métodos 
frequentemente empregados para expressar os resultados são os proporcionais, que empregam a 
razão entre os valores da amostra e um valor médio de um grupo de amostras de indivíduos não 
doentes (grupo-controle), e a curva de unidade padrão, na qual os valores são transformados em 
unidades que fornecem uma escala contínua proporcional à quantidade de anticorpo ou antígeno 
presente na amostra. A escolha do limiar de reatividade dependerá também dos resultados de 
validação do ensaio (ver Capítulos 4 e 10). 
 
TIPOS DE ELISA 
O ELISA pode ser utilizado para pesquisa de antígenos: competitivo com antígeno 
marcado; competitivo com anticorpo marcado; e captura de antígeno ou sanduíche, além de 
também poder ser empregado para pesquisa de anticorpos indireto e captura de imunoglobulina 
classe-específica. 
Na Figura 7.6 são apresentados os esquemas para cada um dos tipos de testes. Seu 
princípio tem semelhança com os tipos de RIE (ver Figura 7.4), mas nos testes ELISA, após a 
adição do conjugado enzimático, é necessária mais uma etapa de lavagem e a revelação final da 
presença do conjugado pela adição do substrato cromogênico. Como a ação enzimática é 
contínua, após o tempo de incubação é necessário interromper a reação colorimétrica pela 
inativação da enzima com soluções ácidas ou alcalinas. Nos ensaios immunodot (dot-ELISA) 
e immunoblot, essa última etapa consiste em lavar o excesso de substrato cromogênico da fase 
sólida. 
 
COMPETITIVOS 
É o método empregado na detecção quantitativa de antígenos. O método de competição 
com antígeno marcado utiliza reagentes em quantidades limitadas. O anticorpo utilizado deve 
ligar com a mesma avidez ao antígeno da amostra e ao antígeno marcado. O resultado positivo 
resulta no desenvolvimento mínimo ou na ausência de coloração, pois a quantidade de antígeno 
conjugado com a enzima que se ligou ao anticorpo da fase sólida é inversamente proporcional à 
quantidade de antígeno na amostra (ver Figura 7.6 A). Esse tipo de teste é ideal para a medida 
de moléculas como alguns hormônios e marcadores tumorais e alguns antígenos de patógenos. 
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter02.html
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter04.html
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter10.html
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter07.html?create=true#fig7-6
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter07.html?create=true#fig7-4
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter07.html?create=true#fig7-6
Os ensaios competitivos, geralmente, apresentam maior especificidade e menor sensibilidade 
que os métodos não competitivos, mas ainda devem ser levadas em consideração a afinidade e a 
pureza dos reagentes empregados. 
Esse tipo de ensaio competitivo não é adequado para moléculas muito pequenas como os 
haptenos, substâncias psicoativas e peptídios, que quando conjugados a enzimas perdem sua 
antigenicidade por impedimento estérico, ou seja, perdem a acessibilidade, porque a molécula 
enzimática é grande. 
 
 
Figura 7.6 Teste imunoenzimático para quantificação de antígenos em amostras: competitivo com 
antígeno (A) e anticorpo marcados (B). Teste imunoenzimático para detecção de anticorpos: indireto (C), 
captura de IgM com antígeno marcado (D) e captura de IgM com anticorpo marcado (E). Representação 
de resultado de um teste ELISA (F). 
 
NÃO COMPETITIVOS 
São as versões de métodos imunoenzimáticos mais empregadas, tanto na detecção de 
antígenos quanto de anticorpos. A pesquisa de antígenos utiliza diversos métodos, sendo o de 
captura de antígeno o mais utilizado para antígenos polivalentes. O princípio desse método foi 
descrito no ensaio de captura por radioimunoensaio (RIE). A pesquisa de anticorpos pode ser 
realizada pelo método indireto e de captura para imunoglobulina classe-específica, como IgM, a 
mais usual, IgA e IgE. 
O método indireto apresenta como vantagem a utilização do mesmo conjugado, anti-Ig 
marcada com enzima, em diferentes sistemas. O conjugado anti-IgG humana, por exemplo, 
pode ser usado para a pesquisa de IgG específica contra inúmeros microrganismos. A amostra é 
incubada com o suporte contendo o antígeno previamente fixado, permitindo a ligação dos 
anticorpos séricos presentes na amostra, específicos contra o antígeno. A especificidade do teste 
depende da escolha do antígeno. Após a lavagem para a retirada dos componentes não fixados, é 
adicionado o conjugado enzimático anti-IgG humana, que se fixa às IgG ligadas ao antígeno da 
fase sólida. Uma nova etapa de lavagem é realizada para a retirada do conjugado não ligado, 
seguida da adição do substrato cromogênico para o desenvolvimento de cor proporcional à 
quantidade de enzima presente na reação, a qual, por sua vez, é proporcional à quantidade de 
anticorpo presente na amostra. A reação enzimática é interrompida pelo acréscimo de solução 
ácida ou alcalina e a leitura é realizada em espectrofotômetro no comprimento de onda 
adequado para o cromógeno utilizado (ver Figura 7.6 C). 
O método de captura de imunoglobulinas classe-específicasapresenta elevada 
sensibilidade, impedindo a interferência da IgG específica, que está sempre presente em maior 
concentração que os demais isótipos de imunoglobulinas, reduzindo assim resultados falso-
negativos. Os resultados falso-positivos podem ocorrer devido à ligação do fator 
reumatioide (IgG/IgM/IgA/IgE anti-IgG) com o conjugado ou com a IgG específica e depois 
com o conjugado. Esse efeito pode ser minimizado utilizando antígeno, complexo antígeno-
anticorpo ou fragmentos F(ab’)2 marcados com enzima na sequência do teste. 
No teste para detecção de anticorpos específicos da classe IgM, a amostra é incubada com 
a fase sólida contendo anti-IgM humana previamente fixada, para captura dos anticorpos séricos 
IgM presentes na amostra. Após a lavagem para a retirada dos componentes não fixados, é 
adicionado o antígeno marcado com enzima para determinar especificidade da IgM da amostra 
(ver Figura 7.6 D). Também pode ser utilizada uma etapa a mais no teste, principalmente 
quando a marcação do antígeno com a enzima não é possível ou resulta em uma molécula não 
antigênica. Então se usa antígeno não marcado e um segundo anticorpo específico marcado com 
a enzima (Figura 7.6 E). Uma nova lavagem é realizada para a retirada do excesso de 
conjugado, seguido da adição do substrato cromogênico para o desenvolvimento de cor 
proporcional à quantidade de enzima presente na reação. A quantidade do conjugado enzimático 
presente, por sua vez, é proporcional à quantidade de anticorpo presente na amostra. A reação 
enzimática é parada pelo acréscimo de ácido e a leitura é realizada em espectrofotômetro no 
comprimento de onda determinado pelo cromógeno utilizado. Esse modelo de teste também é 
empregado para a dosagem de IgE total, sendo o anticorpo fixado ao suporte uma anti-IgE 
humana e o conjugado uma anti-IgE humana marcada com enzima. 
 
SISTEMA BIOTINA-AVIDINA 
Método de amplificação que pode ser utilizado para aumentar a sensibilidade dos testes, no 
qual a enzima presente no conjugado empregado é substituída pela biotina, e um segundo 
conjugado utilizado, a avidina, tem afinidade pela biotina e é marcada com a enzima. 
A biotina é uma vitamina hidrossolúvel de baixo peso molecular, 244 dáltons, com elevada 
afinidade, 1015 ℓ/mol, pela proteína avidina de clara de ovo. Em geral se usa a streptavidina de 
bactérias, que é mais inerte por não conter resíduos de carboidratos e assim reduz interações 
inespecíficas. Cada molécula de streptavidina possui quatro sítios de ligação para biotina. 
https://jigsaw.vitalsource.com/books/9788527734035/epub/OEBPS/Text/chapter07.html?create=true#fig7-6
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Por outro lado, a biotinilação de antígenos e imunoglobulinas é um processo de fácil 
execução e que não acarreta alterações nas proteínas. Além disso, como a biotina é muito menor 
que as enzimas usuais, geralmente há várias moléculas de biotina por molécula de conjugado. 
Desse modo, várias moléculas de avidina marcada poderão se ligar ao conjugado biotinilado, 
amplificando o sinal de leitura do teste. O segundo conjugado pode ser avidina-enzima, ou 
ainda, avidina marcada com outro ligante, como fluorocromos ou substâncias luminescentes. 
Esse método de amplificação do sinal pode ser aplicado a todos os métodos de imunoensaios. 
 
VAZ, Adelaide José al.. Ciências Farmacêuticas - Imunoensaios-Fundamentos e 
Aplicações, 2ª edição. Guanabara Koogan, 07/2018.