Técnicas de Biologia Molecular - Alberts

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Técnicas de Biologia Molecular 
1 – Fases de extração de DNA e RNA 
A) Lise das membranas lipídicas: ocorre o rompimento da membrana celular e 
dos compartimentos membranosos provocada por uma solução detergente 
(solvente apolar). 
B) Degradação de Proteínas (detergentes, proteínase k -Rapidamente inativa as 
nucleases, que degradam o DNA e RNA); 
C) Purificação: remoção dos componentes celulares (proteínas, organelas etc) 
por: 
• Proteinase: desnaturação das proteínas. 
• Fenol: remove proteínas e outros contaminantes. 
• Clorofórmio: ajuda a desnaturar proteínas e remover o fenol 
residual. 
• NaCl: ajuda a manter as proteínas dissolvidas no liquido extraído, 
impedindo que elas precipitem com os ácidos nucleicos. O sal se 
dissocia em Na+ e se une ao fosfato do DNA, permitindo que se 
unam os fragmentos (DNA para de se repelir). 
D) Precipitação: ácidos nucleicos são insolúveis em álcool, usa-se o etanol para 
que estes se precipitem. Quanto mais gelado o etanol, menos solúvel o 
DNA/RNA. Retira-se o álcool para a formação do pallet. 
E) Reidratação: solubilizar o DNA novamente (após a retirada do álcool) com 
água pura. O solvente de reidratação servirá para o armazenamento do DNA 
extraído (deve ser livre de contaminantes e enzimas capazes de destruir o 
DNA ou RNA (DNAases ou RNAases). DNA deve ser armazenado a -20°C e 
o RNA a -70°C. 
Fenóis e sais de guanidina são agentes desnaturantes que efetuam a lise e 
a inativação das RNAases. 
2 - PCR: Reação em cadeia da Polimerase 
• Método de clonagem do DNA in vitro que permite a AMPLIFICAÇÃO de 
quantidades minúsculas de DNA alvo. 
• Faz a replicação de determinada sequência de nucleotídeos rapidamente e 
em grandes quantidades. 
• Utilizado para diagnósticos e na ciência forense. 
• Informações do DNA alvo são utilizadas para projetar 2 primers 
(oligonucleotídeos) que são específicos para cada sequência de DNA. 
• Para que os primers não se liguem a outras localidades do DNA, a 
extremidade 3’ de um primer não deve ser complementar a nenhuma outra 
região de outro primer na mesma reação. 
A) DNA é aquecido a uma temperatura suficiente para quebrar as pontes de 
hidrogênio que ligam as fitas complementares. Ocorre a desnaturação e a 
formação do DNA fita simples. 
B) Após o resfriamento, ocorre o anelamento (pareamento de bases dos 
primers sintéticos). 
C) DNA-polimerase purificada inicia a síntese de novas fitas (estende os 
primers). 
3 – PCR em tempo real ou quantitativo 
• Utilizada para QUANTIFICAR o DNA ou RNA (nesta, é utilizada a 
transcriptase reversa para originar fitas complementares de DNA). 
• Quantificação é feita automaticamente enquanto a reação ainda está 
ocorrendo. 
• Técnica muito utilizada para triagem da expressão gênica, para detectar 
transcritos que não foram amplificados. 
• Permite o rastreamento da EXPRESSÃO GÊNICA (vê quais estão ativos 
qualitativo e quantitativamente), possibilitando conclusão de alguns 
diagnósticos. 
4 – Eletroforese 
• Separa os fragmentos de DNA uns dos outros, após clivagem do DNA, com 
base no seu comprimento e densidade. 
1) A mistura de fragmentos de DNA é aplicada em uma das extremidades do 
gel de agarose que contém uma rede microscópica de poros. 
2) Uma voltagem é aplicada ao gel. 
3) DNA (que tem carga negativa) migra em direção ao eletrodo positivo. 
4) Fragmentos maiores de DNA migram mais lentamente pois são parcialmente 
impedidos pela matriz de agarose. Fragmentos menores de DNA ficam mais 
próximos ao eletrodo positivo. 
5 – Sequenciamento convencional 
• Descobrir onde está o gene. 
• Inserção de nucleotídeos modificados que impedem a replicação do DNA. 
• Tem como finalidade determinar a ordem das bases nitrogenadas. 
• Sequencia o DNA e prevê doenças. 
• Lê base à base, dando a sequência de DNA e compara ao banco do genoma 
para ver se está normal. 
6 – Sequenciamento de nova geração 
• Promove o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar 
informação sobre milhares de bases em uma única corrida. 
• Acelera e abaixa o custo do convencional – lê mais bases e mais 
rapidamente. 
• Analise mais abrangente do transcriptoma. 
7 – Microarray 
• Permitiu que os produtos de milhares de genes fossem monitorados de uma 
só vez. 
• Monitora o PRODUTO dos genes (utiliza RNA). 
• Facilita a análise da EXPRESSÃO GÊNICA. 
• Transcreve informações de vários genes para um chip computadorizado no 
intuito de avaliar a expressão desses genes, assim como seus estágios de 
desenvolvimento ou função dentro do contexto global do genoma. 
• Possibilita ver quais genes estão ativos ou inativos quando as células 
crescem, dividem ou respondem a hormônios/toxinas. 
• Identifica desde cânceres a controle de pragas, medindo os níveis de 
transcrito em larga escala. 
• Quantifica a fluorescência, mas não identifica mutação. 
8 – Imunohistoquímica 
• Uso de anticorpos para identificar proteínas e sua localização. 
• Anticorpo é utilizado para obter o padrão de expressão geral para uma 
proteína dentro de um tecido ou de uma estrutura multicelular. 
• Anticorpo (marcado por fluorescência) se liga a proteína alvo. A ligação 
garante dados sobre a expressão de uma proteína dentro do tecido onde os 
anticorpos agiram, já que essa interação muda a cor histológica do tecido. 
9 – Western blotting 
• Detecção de proteínas (não sabe a localização). 
• Anticorpos são marcados em extratos livres (macerados) onde as proteínas 
são dissolvidas em uma solução salina SDS. 
1) A solução SDS é capaz de quebrar a maioria das proteínas nativas. 
2) As proteínas são separadas de acordo com o tamanho por eletroforese em 
gel de poliacramida. 
3) Essas proteínas fracionadas são transferidas (bloting) para uma membrana 
de nicrocelulose e, então, expostas aos anticorpos. 
10 – Citometria de Fluxo 
• É utilizada para contagem, classificação e análise de partículas 
microscópicas que se encontram em um meio aquoso e em fluxo. 
11 – RNA-seq 
• É usado para representar a transcriptona (conjunto de transcritos – RNAm, 
RNAt, RNAr, e microRNAs) revelada por sequenciamento de DNAc por NGS 
(sequenciamento de 2ª geração). 
• Permite a quantificação da expressão gênica (devido a sua alta 
sensibilidade capta até os menores níveis). 
• Útil para descobrir novas transcrições, identificação de mutações, splicing 
alternativo. 
• Pode vir a substituir o microarray.