TESTES DE TOXICIDADE

Prévia do material em texto

× toxicidade × in vitro, in silico e in vivo
IN VITRO - realizado fora de um organismo, 
fora do corpo, realizado em placas de 
cultura → não é testado em um corpo 
completo;
IN VIVO - são testes usados em modelos 
animais (camundongos, hamsters, 
cachorros, coelhos, chimpanzés...) em um 
corpo completo;
IN SILICO - são testes realizados em 
modelos computacionais.
 TESTES DE
FORNECER DADOS QUE POSSAM SER UTILIZADOS PARA A AVALIAÇÃO DE 
RISCO DO USO DE SUBSTÂNCIAS E ESTABELECER LIMITES DE SEGURANÇA
três R’s
Os três R’s → uma prática constante dentro 
do laboratório. Trata-se de um método 
estabelecido por Russel e Burch.
● replace: substituição do uso de animais 
por métodos alternativos
 in vitro, in silico;
● reduce: redução do número de pesquisas 
realizadas em modelos animais, mais 
qualidade de tratamento estático;
● refine: refinamento técnico. minimizar a 
dor e sofrimento dos animais 
analgesia → pré, trans e pós-operatório
células transformadas proliferação anormal ou diferente das células 
saudáveis ー mais núcleos, quantidades de divisões...
Segundo a RESOLUÇÃO 1/78 (D.O. 
17/10/78), do Conselho Nacional de Saúde, 
estabelece 5 tipos de testes:
 AGUDA → triagem
 ↓ intervalo de tempo
 SUBCRÔNICA - pode levar dias,
 semanas, meses....
 CRÔNICA - recebe informações da
 etapa dois. Dentro dessa fase, há 
duas divisões:
embriotoxicidade ー análise se há mal 
desenvolvimento embrionário;
especias ー análise comportamental, 
carcinogenicidade e outros.
1
2
3
Testes validados pelo Conselho Nacional 
de Experimentação Animal:
- Avaliação do Potencial de irritação e 
corrosão cutânea;
- Avaliação do Potencial de irritação e 
corrosão oftalmológica;
- Avaliação do Potencial de fototoxicidade;
- Avaliação de Absorção cutânea;
- Avaliação do Potencial de sensibilização 
cutânea;
- Avaliação de Toxicidade aguda;
- Avaliação de Genotoxicidade.
Deve-se definir objetivos legítimos das 
pesquisas com animais, limitando a dor e o 
sofrimento, garantir um tratamento 
humanitário avaliado pelo Comitê 
Independente. Fiscalizar as instalações, 
procedimentos e responsabilidades 
públicas.
 Este estudo é caracterizado pela administração/exposição
 da substância químicas numa dose única ou múltipla 
(exposições múltiplas justificam que, para que haja uma intoxicação, deve haver múltiplas 
exposições ao toxicante).
● A DL50 (ou CL50)
 a prova mais comum de toxicidade aguda
objetivos
- Avaliar a toxicidade intrínseca do agente tóxico/substância química;
- Avaliar a susceptibilidade das espécies
- Identificar órgãos alvos;
- Promover informações para o delineamen-
to e seleção dos níveis de dose para estu-
dos prolongados.
 pode haver toxicidade
pode conter: hemorragia, necrose e alterações fisiológicas
toxicidadeaguda
 10 animais (camundongos)
 são sacrificados
5 saem do neutro e 5 morrem
 não reaproveitados
 obtém-se informações para as próximas 
etapas de testes.
EX.:
Este teste possui 3 grupos, cada grupo recebe uma dose
mínima, intermediária e máxima ー três grupos experimen-
tais diferentes → não busca letalidade.
→ Não pode causar a letalidade de mais de 10%, caso morra mais que o permitido, o 
estudo é interrompido e cancelado.
Dentro deste teste, há três grupos que recebem a droga e o grupo controle que recebe 
apenas placebo → se a substância a ser estudada é diluída em soro fisiológico, o grupo 
controle receberá apenas soro fisiológico
O animais do grupo controle são comparados com os animais dos outros grupos testados, 
todos os grupos são comparados para que se possa ver os órgãos alvos ou mais 
suscetíveis das substâncias testadas
→ O teste de toxicidade subcrônica normalmente recebe informações do teste de toxicidade 
aguda e auxilia nos testes de toxicidade crônica.
 grupo 1 ー dose mínima
 grupo 2 ー dose intermediária
 grupo 3 ー dose máxima
 grupo 4 ー nenhuma dose, somente soro ou solução.
toxicidade
24-48 horas
subcrônica
EXEMPLO
1 a 3 meses
 Este teste simula o homem exposto durante toda sua vida
 e não busca a letalidade.
Os testes crônicos costumam durar toda a vida do animal ー camundongos (2 anos), 
cachorros (+/- 10 anos).
Semelhante ao teste subcrônico, utiliza-se três doses em três grupos + o grupo controle. 
Observa-se alterações específicas neste estudo e outros parâmetros específicos 
(bioquímicos) que permitem uma melhor avaliação dos órgãos e funções (principalmente 
renal e hepática ー onde ocorre o metabolismo).
★ ANIMAIS QUE NÃO APRESENTAM NENHUMA ALTERAÇÃO PODEM SER DOADOS
objetivos
- Verificar as concentrações/doses máximas das substâncias (sem produzir doença) e os 
efeitos tóxicos que não são resultados da exposição subcrônica;
- Determinar o mecanismo de ação.
toxicidadecrônica
Busca danos no DNA (usa-se fêmur de 
roedores). Há uma triagem in vitro para a 
cultura dos microrganismos, injeta-se nos 
roedores e determinado o tempo, faz-se a 
retirada do fêmur.
 Substância com potencial
 tóxico em culturas de sal-
 monela (cepa TA98 e na
TA100) → estas cepas não conseguem 
produzir histidina (aminoácido), não 
formando colônias.
 histidina+alteração
 genômica → mu-
 tação → forma co-
 lônias.
Controle +/- 3 dias
A quantidade de cultura deve ser igual.
O testes AMES aponta apenas se a 
substância é mutagênica, não aponta 
gravidade. 
*S.F.= soro fisiológico, *Sml= salmonella sp.
genotoxicidade
2 anos ou +
cometa
testeames
S.F.
+ Sml
Subs.
+ Sml
CULTURA DE MICRORGANISMOS, TECIDOS OU CÉLULAS
Determina se houve danos no DNA ー 
produtos químicos ou radiação UV.
O ensaio pode ser aplicado nas pilhas 
eucarióticas.
Este teste é usado na oncologia para 
selecionar a genotoxicidade e definir a 
eficácia de agentes especifícos para a 
progressão do câncer humano.
No processo do teste, o dano no DNA é 
identificado quando, durante a aplicação 
de carga sobre a fita, uma quantidade de 
DNA sai do núcleo (indicando dano). 
O DNA danificado possui carga negativa 
e na 2a fase (eletroforese), o DNA começa 
a mover-se positivamente para fora do 
núcleo → criando, em sua viagem, caudas 
como de um cometa!
eLETROFORESE DO GEL DA PILHA (srre)
- sensível
- específico
 NÃO TESTADO EM HUMANOS!!!!!
 → Desenvolvimento embrionário
 → Obrigatório após o incidente com Talidomida
1ª FASE: FERTILIDADE E DESEMPENHO REPRODUTIVO → machos e fêmeas são 
expostos à substância por pelo menos 60 dias antes do acasalamento ー exposição diária. 
Machos e fêmeas ficam em salas separadas para que não haja estresse, pois as fêmeas 
têm ciclos menstruais 1x por semana.
acasalamento ー um casal por caixa, ficando uma caixa por sala. Ocorre durante o período 
escuro (12h). Passado o acasalamento, machos são sacrificados.
2ª FASE: ORGANOGENÊSE/DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO → fêmeas permanecem 
sendo expostas. As fêmeas que não ficaram grávidas são sacrificadas. O CICLO GESTACI-
ONAL tem duração de 10 dias. 50% das fêmeas grávidas são sacrificadas no 5º dia de 
gestaçãopara análise do desenvolvimento embrionário.
3ª FASE: PROLE/FILHOTES/PARTO → observa-se peso, tamanho, quantidade, 
anormalidades. Os filhotes não são expostos e as mães são sacrificadas após o 
aleitamento. A prole é sacrificada após o término da fase filhote. Nesta ª fase também 
avalia-se o desenvolvimento somático, neuromotor, sensorial e comportamental.
teratogenicidade
carcinogenicidadeTestado epidemiologicamente e experimen-
talmente em roedores (camundongos e hamsters),
com no mínimo 50 animais. Faz-se a busca de alterações que facilitam a formação/desen-
volvimento de cânceres.
Busca-se a DMT (Dose Máxima Tolerada), não pode haver a morte dos animais testados, 
nem sinais clínicos de toxicidade. A perda de peso após a DMT não pode ser superior a 
10%.
*dose mínima tolerada: 50% da DMT ー a administração das doses pode ser funcional (10↓, 
10 ↑, 10 ↓…)
dose ↓: 50 animais totalizando 150 animais (100+50 do grupo controle), todos são
dose ↑: 50 animais submetidos à necropsia completa.
Este estudo tem duração máxima de 130 semanas → se os efeitos aparecerem antes do 
término, pode começar a necropsia. *Surgimento de tumor não indica neoplasia → 
deve-se provar a origem do tumor.
Categoria dos testes: detectar lesão no DNA; formação de ligações entre DNA e produtos 
ativos. • Evidenciar alteração dos produtos gênicos ou funções celulares; avaliação de 
alterações cromossômicas.
avalia o potencial cancerígeno