Introdução dos métodos sorológicos

Prévia do material em texto

PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
Metodologia baseada na ligação antígeno-
anticorpo-SORO 
 
 
Detecção de infecções virais 
 PCR (tempo real) – não são testes 
sorológicos. 
 Sorologias 
 
O que são métodos sorológicos 
 Todo ensaio laboratorial que envolve 
reação imunoquímica formando complexos 
antígeno-anticorpo (imunocomplexos) 
 Complexo antígeno-anticorpo 
 
 
 É feito a detecção da resposta humoral do 
corpo (IgG, IgM) 
 A sorologia coleta sangue sem 
anticoagulante, após a centrifugação 
 Tubo sem anticoagulante: soro 
 Tubo com anticoagulante: plasma 
(parte acelular) 
Relembrando definições: 
 Amostra biológica ou amostra do 
paciente: porção de fluido corporal, 
Métodos sorológicos 
PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
células ou tecido retirada de um indivíduo 
para exame, estudo ou análise. 
 Geralmente sangue! 
 Anticorpo: proteína (imunoglobulina) 
produzida por linfócitos B, que se liga 
especificamente a uma sustância 
reconhecida como estranha pelo 
organismo. 
 São resultados de uma resposta 
imunológica contra algum antígeno 
(corpo-estranho) 
 Antígeno: quaisquer substâncias ou material 
que possa estimular a produção de anticorpos 
em um organismo 
 Complexo antígeno-anticorpo: é o que deve 
ser determinado 
 É o resultado de reagente (Ag-Ac) ou 
não reagente 
 
Anticorpos – Perfis de níveis séricos: 
 
 Inicialmente, após uma infecção (ex: viral), a 
partir de alguns dias o patógeno é replicado e 
presente na amostra do indivíduo 
 Na fase II o corpo começa montar uma 
resposta (IgM) 
 Na fase III o corpo começa montar uma 
resposta mais específica (IgG) 
 Pode permanecer no sangue do 
indivíduo durante anos. 
 
 Bebê tem IgG oriundo da mãe (g de gestação) 
 
Anticorpos: 
 Expressão de Ig durante a maturação do 
linfócito B 
 
 No IgG tem cadeias leves, pesadas, porção que 
se liga ao antígeno e porção constante 
 Porção constante define se existe o 
anticorpo 
 
 
PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
Mapa mental inicial 
 os métodos sorológicos buscam antígeno-anticorpo 
 esses métodos apresentam em diferentes formas, com diferentes sensibilidades, 
especificidade 
Especificidade e Sensibilidade: 
 Especificidade clínica ou especificidade 
diagnóstica: capacidade de um ensaio de 
apresentar resultado negativo ou não 
reagente quando os indivíduos não apresentam 
uma desordem clínica ou doença 
 Sensibilidade clínica ou sensibilidade 
diagnóstica: refere-se à capacidade de um 
ensaio de apresentar resultado positivo ou 
reagente quando o indivíduo apresenta uma 
desordem clínica ou doença. 
Cálculo de sensibilidade e especificidade: 
 
 VP = amostra verdadeiro positivo 
 VN = amostra verdadeiro negativo 
 FP = amostras falso-positivas 
 FN= amostras falso-negativas 
 Teste de triagem → procura-se maior 
sensibilidade possível. 
 Teste confirmatório → procura-se maior 
especificidade possível 
 
 
 
 
 
 
 
 Os anticorpos podem não apresentar 
especificidade absoluta 
 Reatividade cruzada 
Não existem testes laboratoriais que 
apresentem 100% de sensibilidade e 100% 
de especificidade. Resultados falso-
negativos, falso-positivos, indeterminados 
ou discrepantes entre distintos testes 
podem ocorrer, na rotina do diagnóstico 
PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
 Os antígenos podem não ser exclusivos de 
um só micro-organismo 
 Microrganismo relacionados ou não: 
estão na mesma família etc. 
 Consequentemente → presença de 
anticorpos nem sempre significa doença. 
“Falso negativo” vs. “Falso positivo” 
 Falso-não reagente: resultado não 
reagente em um teste para uma doença ou 
condição de interesse quando a doença ou 
condição estão presentes → falso positivo 
 Falso-reagente: resultado reagente em 
um teste para uma doença ou condição de 
interesse quando a doença ou condição 
estão ausentes → falso negativo 
 Reagente: em que há reação; reativo. 
Determina a presença do elemento 
pesquisado 
Limites de detecção 
 Limites de detecção: menor [ ] ou 
quantidade em um método pode detectar 
com certeza para um dado procedimento 
analítico. Depende da amplitude da leitura 
do branco e da precisão dessa medida. 
 
 [ ] de marcadores no plasma x semanas de 
infecção 
 Após a infecção (ex: HIV), há um tempo de 
nada detectável 
 Após 1 ou 2 semanas o paciente apresenta 
RNA viral circulante → detectável 
 A partir de 2,5 semanas, o organismo 
apresenta antígenos virais 
 A partir de 1 mês, ocorre a presença de 
anticorpos 
 IgG total → ocorre a partir de 5 semanas 
Dinâmica dos marcadores da infecção pelo 
HIV 
 
Janela imunológica e Janela Diagnóstica 
 Janela imunológica: duração do período 
entre a infecção pelo HIV até a primeira 
detecção de anticorpos anti-HIV 
 Janela diagnóstica: conceito mais amplo 
que o de janela imunológica ou sorológica. 
O período de janela diagnóstica é o tempo 
decorrido entre a infecção e o 
aparecimento ou detecção de um marcador 
da infecção, seja ele RNA viral, DNA pró-
viral, antígeno p24 ou anticorpo. A duração 
desse período depende do tipo do teste, 
da sensibilidade do teste e do método 
utilizado para detectar o marcador 
 É quando qualquer marcador já é 
visível para os testes 
 
Métodos sorológicos 
 Podem ser: 
 Reagentes não-marcados 
 Reagentes marcados 
Reagentes não-marcados 
 Os reagentes utilizados não são marcados, 
ou seja, a reação para ser visualizada 
necessita apenas da formação do 
PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
imunocomplexo, que passível de 
visualização sem uma marcação adicional. 
 Teste em uma etapa única 
 Exemplo: aglutinação (tipagem sanguínea), 
hemaglutinação, floculação, precipitação 
 Hemaglutinação direta (sistema ABO) 
 Sem aglutinação: não há reação 
 Aglutinação: há reação (antígeno-
anticorpo) 
 
 
 Floculação 
 
 Hemaglutinação indireta (HAI) 
 Soro-hemácias (com antígeno) 
▪ Hemácias de carneiro 
 Sem resposta: com o tempo, as 
hemácias ficam juntinhas, 
parecendo um botão → NÃO 
REAGENTE 
 Com reação: o anticorpo não deixa 
as hemácias sedimentar (ficam 
como nuvem) → REAGENTE 
 Titulação do soro: diluição do soro 
 Indireto → procuro o anticorpo, não 
o patógeno. 
 
 Usa-se: partículas de látex ou hemácias de 
carneiro 
Reagentes marcados: 
 Os reagentes utilizados são marcados, ou 
seja, a reação para ser visualizada 
necessita de alguma marcação que 
capacite o analista a “enxergar” a 
formação do imunocomplexo. 
 Artimanhas laboratoriais que 
produzem cores → sinais 
 Teste com, no mínimo, duas etapas 
 Exemplos: reação de Imunofluorescência 
Indireta (RIFI), Ensaio Imune enzimático 
(ELISA), Quimiluminescência 
 Direta: 
 
 Indireta: 
 O anticorpo primário não tem como 
ser manipulado com luz (é do 
paciente) 
 Eu pego um anticorpo secundário 
marcado (conjugado) que reconhece 
PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
a porção constante das 
imunoglobulinas humana → nela eu 
faço uma artimanha laboratorial 
 
 Elisa 
 Sólido: lâmina, poço de Elisa etc. 
 
 
Avaliação Laboratorial de Hormônios 
Correspondem aos principais métodos 
laboratoriais para detecção de hormônios 
sexuais. São eles: 
 Quimiluminescência/ CLIA 
 Imunocromatografia de fluxo lateral 
(Teste Rápido) 
 De gravidez (β-HCG) 
Quimiluminescência/ CLIA 
 
 Há vendas de kits específicos com os 
reagentes para detecção de cada 
hormônio. 
 Analito: é o hormônio (que busca na 
amostra de soro)/antígeno 
 Fase sólida: é um anticorpo 
 É um poço de uma microplaca → 
simulação de 96 tubos de ensaio, 
que estão em uma placa para 
automatizar a análise 
 Na fase sólida de cada poço tem um 
anticorpo Quando adiciona a amostra do 
paciente, o analito 
(hormônio/antígeno) se liga no 
anticorpo (específico para cada 
hormônio) 
 Depois, lava-se para retirar o 
excesso e ligações inespecíficas 
 Na 2ª etapa temos um anticorpo de 
detecção que é marcado com enzima 
→ sanduiche 
 
 Quimiluminescência: é a forma com que 
você faz o complexo todo ficar visível 
 Forma luz 
Base química: 
 Quimiluminescência: reação química que 
produz luz. 
Métodos 
sorológicos 
PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
 É possível reproduzir em laboratório 
reações químicas iguais às dos vagalumes. 
 Substâncias (Ex: Luminol: C8H7N3O2) 
podem ser facilmente oxidados em 
ambiente básico com água oxigenada (com 
ação da peroxidase), obtendo emissão de 
luz azul-claro 
 Luminol, em determinadas 
condições do meio (peróxido, meio 
alcalino), gera uma tautomerização 
a molécula que, ao final, gera uma 
substância com estado químico 
excitado que quando volta para o 
estado normal gera luz (modelo 
atômico de Bohr) 
 Quanto maior a quantidade de luz 
gerada, maior será a [ ] de hormônio 
 
 
 
 É um método amplamente usado: 
 Dosagens hormonais, marcadores 
tumorais, dosagem de anticorpos 
etc. 
 Vantagens: 
 Elevada sensibilidade 
 Utilizada pequena quantidade de 
reagentes 
 Técnica automatizada 
 Na fase sólido há um anticorpo primário 
(anti-hormônio) 
 O antígeno a ser detectado é o hormônio 
 É necessário anticorpo secundário 
marcado com a peroxidase 
 A peroxidase + luminol gera uma reação 
luminosa 
 Desvantagens: 
 Demanda técnica 
 Custo inicial elevado 
 
Imunocromatografia de fluxo lateral 
(Teste Rápido) 
 
 Busca o analito (HCG) 
 No aparato tem anticorpos anti-HCG 
 Se houver ligação: forma as duas 
linhas 
 Se não houver HCG: forma só uma 
linha (controle do teste) 
Base teórica 
Eixo Hipotálamo-Hipófise-Gônada 
Hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) 
é sintetizado pelas células neuro secretoras 
PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
do hipotálamo e é transportado pelo sistema 
porta-hipofisário até a hipófise anterior. 
 O desenvolvimento puberal normal é 
dependente da secreção e da ação 
adequada de GnRH 
 Produzido por um pequeno nº de neurônios 
secretores de GnRH (hipotálamo 
ventromedial) 
 Controla a secreção hipofisária das 
gonadotrofinas FSH e LH 
 O eixo hipotálamo-hipófise gonadal é ativo 
durante o período neonatal, seguido por 
um período de relativa quiescência 
durante toda a infância. 
 A reemergência dos pulsos secretores de 
GnRH ocorre no final da infância com o 
início do período puberal. 
FSH E LH 
 Estimula a esteroidogênese e a gametogênese 
nas gônadas 
 Desenvolvimento dos caracteres sexuais 
secundários e aquisição de capacidade 
reprodutiva. 
Sistema hormonal feminino → 3 hierarquias de 
hormônios 
 1. Hormônio de liberação de gonadotrofina 
(GnRH): liberação hipotalâmica 
 2. Hormônio folículo estimulante (FSH) e 
hormônio luteinizante (LH); hormônios 
sexuais liberados pela hipófise anterior em 
reposta ao GnRH 
 3. Estrogênio e Progesterona: hormônios 
ovarianos secretados em resposta aos 
hormônios hipofisários (FSH e LH) 
 
Avaliação hormonal: 
 
 
PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO PUBERDADE 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
 
 Os valores de referenciais hormonais 
dependem da fase do ciclo sexual feminino 
 FSH e LH tem aumentos transientes → 
ATENÇÃO 
Atenção às deficiências primárias e 
secundárias: 
 
 Deficiências primárias são da produção 
hormonal pela gônada 
 menopausa 
 Deficiências secundárias são da produção das 
gonadotropinas 
 Tem todo o eixo desligado (níveis 
abaixo do valor de referência) 
Avaliação Hormonal na Gravidez: 
 O HCG será produzido pelo sinciotrofoblasto 
do corion, após a implantação do blastócito no 
endométrio. 
 Impede a involução do corpo lúteo (estimula o 
aumento da secreção de progesterona e 
estrógeno) 
 
 Elevação exponencial → limite de detecção no 
soro e depois na urina 
 Limite de detecção 25ml/ml 
 Urina da manhã → mais concentrada 
 
 
 HCG pode ser avaliado por Elisa