Microscópio e Corantes

Prévia do material em texto

Introduçã�
BIOLOGIA CELULAR é a análise das moléculas e dos componentes com os quais se
constroem todas as formas de vida.
CÉLULAS são pequenas unidades limitadas por membranas e preenchidas com
uma solução aquosa concentrada de compostos e dotadas de uma capacidade de
criar cópias delas mesmas.
Temos mais de 32 trilhões de células no corpo, e a cada hora, 1 bilhão de células
novas.
- HOMEOSTASE: processo de equilíbrio fisiológico do nosso corpo.
Grande variedade de formas e tamanhos.
- MORFOLOGIA: forma sempre relacionado a sua função.
Variáveis vistas de fora, mas semelhantes por dentro; são compostas do mesmo
tipo de moléculas que participam nos mesmos tipos de reações químicas.
DOMÍNIOS: Archaea, Bacteria, Eukarya
Nívei� d� Organ�açã� Celular
1- Nível Químico ou Molecular
1 molécula ou macromolécula =
formam organelas
2- Celular
Onde se encontram as organelas
3- Tecidual
Junção de células
4- Orgânico
Grupo de tecidos que desempenham
uma função, formam órgão
5- Sistêmico
Junção de órgãos
6- Organismo
Junção de sistemas.
Métod� d� Estud� e� Histologi�
HISTOLOGIA é o estudo das células e dos tecidos do corpo e de como essas
estruturas se organizam para constituir os órgãos, realizado com ajuda de
microscópios.
Micr�cópi�
História: Zacharias e Janssen desenvolveram o 1º ótico; Robert Hooke desenvolveu
o 1º ótico composto e usou o termo célula pela primeira vez.
O que é: Sistema de lentes combinadas que são colocadas de forma a ampliar a
imagem do objeto.
Unidade de Medidas:
> Micrômetro (µm)
> Nanômetro (nm)
> Agstrom (Å)
1mm = 10 ^ -3 m
1µm = 10 ^-3 mm = 10 ^ -6 m
1nm = 10 ^ -3 µm
1 Å = 10 ^ -4 µm
Fotografia de células: MICROFOTOGRAFIAS ou FOTOMICROGRAFIA
RESOLUÇÃO: Qualidade da imagem aumentada, quantidade de detalhes.
AUMENTO: Capacidade de fazer um objeto parecer maior
PODER DE RESOLUÇÃO X LIMITE DE RESOLUÇÃO
Capacidade de uma lente de formar
detalhes
Menor distância de 2 partículas ou
linhas, que possibilita que sejam vistas
como obj. separados.
Micr�cópi� Óptic�
Ocular: Amplia e projeta a imagem na
retina, tela ou câmera
Objetiva: Recebe a luz que atravessou o
espécime e projeta a imagem aumentada
Condensador: Concentra os raios
luminosos e projeta o feixe sobre a
espécime.
Diafragma do condensador: Controla a
quantidade de luz
Platina: Movimentada pelo charriot
Charriot: “Parafusos” que movem a
platina
Aumento final = determinado pela capacidade de aumento da objetiva e da ocular.
Permite aumento de 500x em relação ao olho humano.
TIPOS DE MICROSCÓPIO ÓPTICO
> Microscópio de Luz/Campo Claro
Permite a utilização do microscópio para ver células vivas e
tecidos fixados e corados, e ver seu comportamento normal.
Como a maioria é transparente, se faz necessário o uso de
coloração artificial.
A fonte de luz emite um raio que passa pelo condensador,
objetiva e oculares até o olho. A lente condensadora forma
um cone de luz que passa pelo objeto que está na lâmina e
chega até a lâmina objetiva e projeta a imagem aumentada
no plano focal das lentes oculares, que ampliam a imagem
para nosso olho.
> Microscopia de Contraste de Fase
Usa truques óticos para realçar o contraste das células
quase transparentes ou a Microscopia de Contraste
Diferencial (microscopia de Nomarski), que produz uma
imagem aparentemente tridimensional. Vistas em preto
branco e tons de cinza, que dependem da espessura e índice
de refração do material e do meio.
> Microscopia de Fluorescência
Substâncias são irradiadas pela luz de um determinado
comprimento de onda e emitem luz com um comprimento de onda
ainda mais longo. Iluminadas por uma fonte de luz de mercúrio
sob alta pressão. Substâncias observadas como coloridas e
brilhantes.
> Microscopia Confocal
A iluminação de uma fonte de laser alcança o espécime e gera
um reflexo, que é dirigido por um espelho a um obstáculo, que
bloqueia a luz proveniente de planos do espécime que estão à
frente ou atrás do plano focalizado. O laser varre o espécime
para que uma área maior do corte seja observada. A
consequência desse arranjo é que só a imagem originada do
plano focalizado alcança o detector, enquanto as imagens de
planos anteriores e posteriores são bloqueadas.
Baseia-se na iluminação por varredura a laser ponto a ponto de
um espécime, geralmente marcado com substâncias
fluorescentes.
Micr�cópi� Eletrônic�
> Transmissão
Como funciona: Ao invés da fonte de luz, tem filamento fino
de tungstênio aquecido chamado de catodo. Após seu
aquecimento, elétrons são liberados e são submetidos a
diferença de voltagem de 60 e 120 kw entre catodo e anodo,
que atraem os elétrons e os acelera. No tubo, o feixe de
elétrons passa pelo interior de bobinas elétricas, que são
lentes eletromagnéticas. Ao atravessar o corte, alguns
elétrons interagem com os elétrons do espécime e outros
simplesmente cruzam. O detector da imagem pode ser uma
placa fluorescente, câmera.
Permite aumento até 500x maior que o microscópio óptico.
> Varredura
Como funciona: não atravessam a mostra, mas varrem sua
superfície
refletidos e coletados por um coletor que mostra uma imagem
tridimensional.
Preparaçã� d� espécime� par� �am� micr�cópic�
Técnic� Histológic�
A técnica histológica visa a preparação dos tecidos destinados ao estudo da
microscopia de luz.
1- Remoção do tecido do animal
2- Tecido segmentado e processado
São fatiados em seções ou cortes histológicos muito delgados e colocados sobre lâmina de
vidro
3- Fixação
Evita digestão dos tecidos por enzimas existentes nas células (autólise) ou bactérias;
endurece fragmentos; preserva em grande parte estrutura e composição molecular dos
tecidos.
> Química: tecidos são imersos em soluções de agentes desnaturantes ou de agentes que
estabilizam as moléculas ao formar pontes com moléculas adjacentes (fixadores + utilizados:
solução de formaldeído a 4%; glutaraldeído)
> Física: submete os tecidos a uma congelação rápida tornando-os mais rígidos. Não
inativa a maioria das enzimas e mantém muitas proteínas em seus locais e conformações
originais (corte = criostato ou criomicrótomo).
4- Inclusão
> Desidratação: remover a água do tecido a colocando em diversos banhos de etanol
> Clareamento: substituição do álcool no fragmento por uma solução intermediária (xilol e
toluol), que ficam transparentes. Ao colocar na parafina líquida, essa substância evapora e
é preenchido com parafina.
6- Corte
Parafina endurecida, forma um bloco e serve de base para corte (micrótomo).
7- Montagem da lâmina
Diferença - Substâncias usadas no óptico e eletrônico.
Micrótomo Manual Rotativo - faz cortes finíssimos na parafina, que são colocados
em banho maria a 40 graus para que se estendam e sejam colocados em vidro.
Os cortes podem ser oblíquos, transversais e longitudinais, que resultam em
diferentes imagens.
Métod� d� Coloraçã� par� Visual�ar � Distinguir Diferente� Parte�
d� Célul� � Tecid�
Consiste em mergulhar a lâmina contendo o corte no(s) corante(s), de acordo com o
que se deseja corar;
Diversos tipos de coloração possibilitam visualização de estruturas de acordo com
suas propriedades químicas
Os termos histoquímica e citoquímica são usados para indicar métodos que
identificam e localizam substâncias em células e matriz extracelular, seja em cortes
histológicos ou em células cultivadas, a maioria baseada em reações químicas
específicas ou em interações de alta afinidade entre moléculas.
Originam substâncias insolúveis coloridas (m. óptico) ou elétron-densas (m.
eletrônico)
Íons: Vários ions (p. ex., cálcio, ferro, fosfato) podem ser localizados em tecidos, usando
reações químicas que produzem produtos insolúveis escuros ou coloridos
Ácidos nucleicos: O DNA pode ser identificado e quantificado nos núcleos das células por
meio da reação de Feulgen, que produz cor vermelha no DNA.
Proteínas: Os métodos histoquímicos normalmente não possibilitam localização de
proteínas específicas, o que pode ser feito pela imunocitoquímica (é possível visualizar
enzimas como fosfatases, desidrogenase, peroxidase).
Polissacarídeos, oligossacarídeos e lipídeos.
�p�d� Corant�
Específicos para uma estrutura em particular e inespecíficos - célula vai corar do
mesmo jeito.
> Corantes ácidos: cargas negativas se ligam a células carregadas positivamente;
afinidade com estruturas básicas.
Componentes do tecido que coram com corante ácido: acidófilos.
> Corantes básicos: carga positiva se ligam a estruturas carregadas negativamente;
afinidade com estruturas ácidas.
Componentes do tecido que coram com corantes básicos: basófilos.
> Combinação de corantes/neutro: não carregam carga
HEMATOXILINA-EOSINA (H.E.):
> Rosa e núcleos da célula em azul
> Coloração do tipo H.E. por ter 2 corantes
- Hematoxilina: corante básico - cora as estruturas
ácidas de cor azul e roxa.
- Eosina: corante ácido - cora estruturas básicas (como
membranas) de cor rosa.
ÁCIDO PERIÓDICO DE SHIFF (P.A.S.)
> Baseada em processo histoquímico;
> Identificação de glicogênio, polissacarídeos que possuem
glicose
> Reativo de Shi� (incolor) = fucsina básica (cor bonina) + ácido
sulfuroso
> Ácido periódico = ao entrar em contato com glicóis, oxida os
grupos hidroxilas formando aldeídos que, ao reagirem com o
agente Shi�, apresentam uma coloração púrpura, magenta ou bonina = PAS+
IMPREGNAÇÃO PELA PRATA OU MÉTODO DE GOLGI
> Corar tecidos do sistema nervoso.
> Dicromato de potássio e nitrato de prata = deposição de
cromato de prata que resulta em um cristal marrom
avermelhado
> Sistema nervoso aparece em marrom ou preto,
AZUL DE TOLUIDINA
> Corante básico e por isso pinta estruturas ácidas
(ácidos nucleicos e polissacarídeos);
> Cora ao mesmo tempo ácidos nucleicos em azul e
polissacarídeos em roxo
TRICRÔMICO DE MASSON
> Três contrastes diferentes = estruturas basofílicas e ácidos
nucleicos ficam azul;
> Colágeno = azul ou verde
> Citoplasma, eritrócitos, queratina e músculos = vermelho
TETRÓXIDO DE ÓSMIO
> Tóxico;
> Visualizar membranas lipídicas e vesículas;
> Corar estruturas como gorduras, mielina e complexo
de golgi;
> Microscopia de transmissão.
Com� �aminar Corte� Histológic� n� Micr�cópi� Óptic�
1- Observe a lâmina a olho nu (ajuda a se orientar, formato da preparação, local da
lâmina)
2- Focalize a imagem no microscópio
3- Comece com a menor magnificação (objetiva de menor aumento)
4- Passe para a de maior aumento e não esqueça de focalizar
5- Use o maior aumento e sempre focalize a imagem
6- Anote e descreva as estruturas maiores e menores que você encontra na lâmina
7- Depois de identificar e descrever, é possível reconhecer a coloração e tipo de
corte usado
8- Anote informações adicionais: funções da célula, do tecido e do órgão
A forma está relacionada com a função mesmo em nível microscópico
Problema� n� Interpretaçã� d� Corte�:
Distorção e artefatos causados pelo processamento dos tecidos; impossibilidade
de corar todo o tecido em uma só preparação; duas e três dimensões (esquecer de
considerar o tecido em sua totalidade)
+ INFO = CAPÍTULO 1 DO LIVRO HISTOLOGIA BÁSICA