Exercício Marcadores Moleculares e Tecnologias de Edição do Genoma

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Exercício Marcadores Moleculares e Tecnologias de Edição do Genoma
 Ana Beatriz dos Santos Mendes
1) Defina marcadores moleculares e suas características. 
É a utilização de genes individuais como marcadores, com a finalidade de fazer inferências sobre as características de uma população.
2) Defina Polimorfismo 
São variações genéticas que podem ocorrer em sequências codificadoras e não codificadoras, levando a alterações qualitativas e/ou quantitativas das proteínas em questão.
3) Quais as técnicas utilizadas para verificar os marcadores moleculares? Descreva-as. 
Reação em cadeia polimerase PCR: Segmentos de DNA específicos são replicados in vitro. Resulta na produção de milhares de cópias da sequência desejada, em quantidade suficiente para permitir a pronta visualização do DNA, sem a necessidade de métodos indiretos.
Sequenciamento do DNA: O resultado obtido do sequenciamento é a tradução do equipamento do comprimento de onda correspondendo a cada uma das bases nitrogenadas marcadas com cores diferentes. Usado para determinar a ordem das bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) da molécula de DNA.
Microaranjo: Na placa de microarranjo temos a DNAc marcado com fluoróforo. Ela é sensibilizada por sondas ocorrendo a ligação por complementariedade e, posteriormente, lida por scaner para verificar a expressão gênica e os resultados interpretados por bioinformática.
Microssatélites: Unidades de repetição de pares de bases do DNA (AT, GC), que são utilizados como marcador genético em estudos de parentesco. Baseado na amplificação por PCR de regiões específicas do genoma utilizando um par de primers locus específico.
4) Quais os tipos de Marcadores Moleculares? Descreva-os. 
Marcadores moleculares baseados no modo de ação gênica: Marcadores moleculares baseados no modo de ação gênica, podendo ser dominantes ou codominantes.
Marcadores moleculares baseados no Método de detecção: Marcadores moleculares baseados no Método de detecção. São a hibridização, PCR e sequenciamento.
Marcadores moleculares baseados no rendimento: Definidos de acordo com a quantidade de loci genotipados por vez. Sendo eles de baixo rendimento ou alto rendimento.
5) Descreva os tipos de reparos endógenos utilizados pelas técnicas de edição do genoma. 
União terminal não-homóloga (em inglês, non-homologous endjoining, NHEJ): associado com o religamento direto da quebra. Este procedimento, embora apresente certa acurácia, está associado com eventuais mutações, quer por deleções ou inserções, os chamados indels. 
Reparo direcionado por homologia (em inglês, homology-directed repair, HDR): Parto do ponto clivado, mas exige a existência de um modelo para que este reparo seja sucedido. A HDR pode ser empregada para restaurar a funcionalidade de genes mutados pela sua correção, retomando sua expressão e finalidade fisiológica benéfica.
6) Defina: 
a. knock out genético: Forma mais simples de edição de genes, que utiliza da NHEJ para introduzir deleções no local de destino
b. Knock in genético: Condiciona à adição de genes em loci específicos, como os safe harbor loci. A inserção é condicionada a partir de um modelo de DNA contendo o gene de interesse. E permite corrigir sequências com mutações, necessitando de um modelo corretivo de DNA.
7) Quais as principais técnicas de edição do Genoma? Descreva-as 
Knock out genético: Forma mais simples de edição de genes, que utiliza da NHEJ para introduzir deleções no local de destino.
Reparo por NHEJ: O reparo por NHEJ pode condicionar à inserção (indels) de sequência em genes.
Inserção (Knock in) por HDR: Condiciona à adição de genes em loci específicos, como os safe harbor loci. A inserção é condicionada a partir de um modelo de DNA contendo o gene de interesse.
Nucleases dedo de zinco: As nucleases dedo de zinco consistem na associação de séries de ZFs C2H2 com a endonuclease de restrição FokI, a qual apresenta domínios de ligação no DNA independentes dos próprios ZFs. A associação de ZFs com a FokI forma nucleases quiméricas com novas propriedades e especificidades de ligação. Para gerar a DSB, as ZFNs devem atuar como um dímero na dupla fita.
Talens: consistem em DBDs cutomizáveis associadas a uma FokI não-específica. As DBDs, neste caso, consistem em repetições altamente conservadas derivadas dos efetores pseudo-ativador de transcrição (em inglês, transcription activator-like effectors, TALEs), proteínas secretadas pela Xanthomonas.
Sistema CRISPR/Cas9: Consiste num dos sistemas mais simples e eficientes de aplicação para edição genômica. Neste sistema, DSBs podem ser geradas pela associação da Cas9, uma endonuclease, com o CRISPR RNA (crRNA) e o crRNA de ativação em trans (em inglês, trans-activating crRNA, tracrRNA).
8) Todas as alternativas apresentam aplicações da tecnologia do DNA recombinante EXCETO. 
a. Investigação de paternidade. 
b. Recuperação de espécies extintas. 
c. Produção, em bactérias, de proteínas humanas de interesse médico. 
d. Terapia gênica de algumas doenças hereditárias. 
9) A alternativa que não corresponde à finalidade do Projeto Genoma e à manipulação dos genes é: 
a. Conhecer melhor a influência dos genes nas características dos indivíduos. 
b. Determinar a sequência de bases nitrogenadas de cada gene. 
c. Curar todos os tipos de doenças. 
d. Diagnosticar e prevenir doenças genéticas. 
e. Descobrir a posição de cada um dos inúmeros genes humanos nos cromossomos. 
10) As principais ferramentas empregadas na tecnologia do DNA recombinante são as enzimas de restrição, que têm a propriedade de cortar o DNA em pontos específicos. O papel biológico dessas enzimas bacterianas na natureza é, provavelmente: 
a) proteger as bactérias contra os vírus bacteriófagos. 
b) reparar o DNA bacteriano que sofreu mutação deletéria. 
c) auxiliar no processo de duplicação do DNA. 
d) auxiliar no processo de transcrição do mRNA. 
e) auxiliar no processo de tradução do DNA.