Diagnóstico de doenças virais

Prévia do material em texto

1 
1 
 
 
Diagnóstico de Doenças Virais 
Disciplina de Doenças Virais 
Resumo por: Denise Ramos Pacheco 
Profa. Dra. Aline Santana da Hora 
Medicina Veterinária - UFU 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• > 2.600 espécies virais 
• > 35.000 cepas virais 
 
Conceitos importantes: 
• Patologia → pato: doença / logia: estudo → nunca usar como sinônimo da 
palavra doença!!! 
• Usar para sinônimo de doença → enfermidade, afecção. 
• Infecção x doença: 
• Um animal infectado não necessariamente desenvolve a doença ou está 
doente. 
 
Fonte: Aline da Hora. 
Doença ou infecção assintomática: qual é o fator determinante, o hospedeiro ou o 
2 
2 
 
 
patógeno? 
• Relação com hospedeiro/sistema imune e capacidade do patógeno causar 
doença. 
• Ambiente: alta densidade populacional, fatores estressantes, higiene, outros 
patógenos etc. 
• Equilíbrio entre os dois. 
• Patógeno: virulência, patogenicidade, taxas de morbidade e mortalidade. 
• Tríade: hospedeiro, patógeno e ambiente. 
 
Conceitos importantes: 
• Na doença viral, a maioria dos sinais clínicos observados é consequência da 
resposta do hospedeiro à lesão celular e tecidual; 
• Como resultado direto da replicação ou como resultado da resposta imune do 
hospedeiro (resultado indireto). 
 
O que levar em consideração para a escolha do teste? 
• Qual amostra devo coletar? 
• A detecção do anticorpo ou antígeno é melhor para a detecção da doença 
suspeita? 
• Esse teste responde à minha pergunta? 
Diagnóstico virológico → sensibilidade e especificidade analítica 
Sensibilidade analítica: Capacidade de um teste em detectar pequenas quantidades 
do agente e seus produtos. 
Especificidade analítica: Capacidade de um teste em detectar um determinado vírus 
(ou seus produtos) e distinguí-los de outros, mesmo que muito semelhantes. 
 
Obs: Quanto mais específico for o teste, menores as chances de reação cruzada; 
Teste mais sensível: precisa de poucas qdes de patógeno/antígeno ou anticorpo para o 
teste detectar; 
NENHUM teste possui 100% de sensibilidade e/ou de especificidade! 
 
Métodos 
 Direto: detectam o vírus, Ag ou ác. nucleico 
 Indireto: detectam os Ac específicos contra o vírus 
 
Fonte: Aline da Hora. 
3 
3 
 
 
• Métodos diretos → detecta o patógeno ou uma parte dele; antígeno: detecta 
proteínas virais; moleculares – genoma; elisa – antígeno; 
• Métodos indiretos → mensura a resposta do hospedeiro – sorologia; detecta 
anticorpos produzidos frente a infecção; 
• Lembrando que IgM é a primeira imunoglobulina a ser produzida, e depois 
produz a IgG. 
 
Métodos Diretos: 
1. Microscopia eletrônica: 
=> Princípio: visualização das partículas virais coradas com metais pesados em 
um microscópio ultrapotente. 
=> Propriedades: Rápida (poucas horas); detecta vírus viáveis e inviáveis; útil pra vírus 
que não replicam em cultivo; podem permitir a ID do agente. 
=> Restrições: equipamento caro, exige pessoal treinado, baixa sensibilidade, 
aplicação restrita à alguns vírus. 
=> Aplicações: infecções entéricas (rota, corona, astro) e cutâneas (pox, herpesvírus). 
 
Fonte: Aline da Hora. 
 
2. Isolamento em Cultivo Celular 
=> Princípio: observação do efeito citopático e/ou detecção de produtos virais após 
sua multiplicação em células de cultivo. 
=> Propriedades: Sensível (replicação). O agente fica disponível para estudos 
posteriores. Implementação e execução relativamente simples. 
 
4 
4 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• “tapete celular íntegro”: A 
• Conforme o passar do tempo, após inoculação do vírus, começa a alterar a 
morfologia: B 
• Alterações morfológicas vão aumentando conforme o passar do tempo: C 
• Efeito citopático intenso: D 
• Alteração celular provocada pela replicação do vírus 
=> Restrições: Demorado (até semanas). Não aplicável à alguns vírus. Somente 
detecta vírus que estejam viáveis. Contaminação bacteriana e fúngica. 
=> Aplicações: Todos os vírus que replicam em cultivo celular. Qualquer material 
clínico pode ser submetido ao isolamento. 
• Não precisa usar somente em vírus que causam efeito citopático, dá para usar 
em todos que replicam em cultivo celular. 
• Em vírus q causa efeito citopático é mais fácil de ver o resultado. 
 
Fonte: Aline da Hora. 
 
3. Hemaglutinação: 
=> Princípio: observação da capacidade do vírus de se ligar às moléculas da 
membrana plasmática dos eritrócitos (aglutinar eritrócitos). 
=> Propriedades: Rápido. Boa sensibilidade e especificidade. Fácil execução. 
=> Restrições: Aplicável em um grupo restrito de vírus. Hemaglutinação inespecífica (há 
virus hemaglutinante nas amostras). Necessidade de espécies doadoras de hemácias 
(galinhas, cobaias, coelhos). Não automatizável. 
Bovinos: adeno, corona, parainfluenza 3. 
Equinos: encefalite equina (leste e oeste), influenza, adeno, encefalite 
japonesa. 
 Suínos: peste suína, encefalomielite hemaglutinante, influenza, parvo. 
Cães: adeno, parvo. 
Gatos: panleucopenia. 
=> Aplicações: Aplicável aos vírus hemaglutinantes de aves e mamíferos. Fluidos 
corporais e suspensões de tecidos. 
5 
5 
 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• O fundo do pocinho é em “v”, a hemácia sedimenta, células separam do 
plasma. Se fizer reação de hemaglutinação e o vírus não tiver ação 
hemaglutinante, ou se não tiver vírus na amostra, as hemácias se depositam no 
fundo do tubinho (amostra negativa). Se houver vírus hemaglutinante, há junção 
das hemácias e vírus e as hemácias não se agrupam, se depositam separadas, 
espalhadas, a imagem que vê é uma espécie de “malha” (resultado positivo no 
teste de hemaglutinação). 
 
Fonte: Aline da Hora. 
 
4. Imunofluorescência e Imunoperoxidase: 
=> Princípio: proteínas virais são detectadas por Ac específicos conjugados com um 
marcador fluorescente (IFA) ou com uma enzima (IPX). 
=> Propriedades: Rápida (minutos a poucas horas). Simples, baixo custo. Boa 
sensibilidade e especificidade. Detecta também vírus inviável. Pode informar sobre 
sorotipos. Disponível em kits. Aplicável virtualmente a todos os vírus. 
=> Restrições: Equipamento caro (IFA). Reações inespecíficas (algumas células 
emitem fluoresência natural). Reagentes para alguns vírus podem não estar 
disponíveis. 
=> Aplicações: Aplicável para qualquer vírus que se tenha Ac específicos. Materiais: 
tecidos (frescos, congelados, fixados), esfregaços (sanguíneos, de secreções), 
células de cultivo. 
6 
6 
 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• Coloca na lâmina de vidro amostra de tecido, esfregaço sanguíneo, com 
presença de antígenos virais 
• Os reagentes que usa → imunof. Direta: anticorpo anti-antígeno, já marcado 
com agente fluorescente (fluoresceína); no microscópio observa a ligação do Ac 
com antígeno viral em verde; imunof. Indireta: o antígeno viral da amostra e 2 
anticorpos → um primário, que não é marcado, se liga ao antígeno viral, e joga o 
anticorpo secundário, marcado, que se liga ao primário e no microscópio 
aparece essa ligação. A DIRETA é mais sensível, mais que a indireta e que a 
imunoperoxidase; a fluorescência produzida na indireta é mais forte, pela 
quantidade de anticorpo marcado. Técnica fluorescente. Na indireta tem mais 
anticorpos marcados 
• Imunoperoxidase: lâmina de vidro com amostra de tecido, sangue, com 
partículas/proteínas/antígenos virais; o Ac anti-antígeno viral se liga a ele, em 
seguida participa um Ac secundário marcado com biotina, o qual se liga ao 
primeiro Ac; a biotina age com um complexo chamado avidina (complexo 
avidina-biotina), que tem uma coloração diferente (marrom). Técnica enzimática 
• Imunoperoxidase é mais barato 
5. Testes imunoenzimáticos/imunocromatográficos: 
=> Princípio: A presença do Ag que reage com o Ac específico imobilizado ou após 
migração, é revelada pela mudança de cor. 
=> Propriedades: Simples e prático. Disponível em kits. Rápida. Boa sensibilidade e 
especificidade. 
=> Restrições: Não automatizável. Especificidade e sensibilidadepodem deixar a 
desejar. Custo alto por amostra. 
=> Aplicações: Aplicável à vários vírus de pequenos animais. Kits disponíveis para uso 
em clínicas, também para uso em bovinos, suínos e aves. 
 
7 
7 
 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• De baixo: imunoenzimático (anticorpo preso); de cima: imunocromatográfico 
(migração do anticorpo). 
 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
 
• Mistura amostra com antígeno junto com anticorpo marcado q vem com o kit, 
liga no Ac preso e altera a cor; se não tiver ligação anticorpo antígeno não tem 
ligação e não faz a linha mudar de cor. 
• Sempre por ligação Ag + Ac. 
• Também pode ser realizado em testes laboratoriais, não somente em testes 
rápidos. 
8 
8 
 
 
 
6. Detecção de ácidos nucleicos (PCR, hibridização): 
=> Princípio: Ác. nucleicos (RNA, DNA) dos vírus são detectados por sondas marcadas 
(hibridização – em cortes histológicos) ou após amplificação por reações enzimáticas 
(PCR). 
=> Propriedades: Específica. Sensível. Necessita de quantidades mínimas da amostra. 
Potencialmente aplicável a todos os vírus. Rápida e automatizável (PCR). Pode ser 
quantitativa (qPCR). 
=> Restrições: Custo alto. Requer equipamento e pessoal treinado. Técnica 
sofisticada. 
=> Aplicações: Aplicável a virtualmente todos os vírus conhecidos. Pode ser realizada 
em qualquer amostra clínica. 
Obs: Transcrição reversa: enzima transcriptase reversa sintetiza DNA a partir de RNA → 
RT-PCR 
QPCR: PCR em tempo real 
RT-PCR: usando a transcriptase reversa 
RT-qPCR 
 
Fonte: Aline da Hora. 
9 
9 
 
 
 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• Ocorre todos os ciclos tbm, desnaturação, anelamento, extensão, mas o 
resultado vê em um gráfico, a amplificação. O gráfico é baseado em 
fluorescência, cada vez que forma uma fita dupla pela extensão da enzima 
10 
10 
 
 
polimerase há uma extensão da fluorescência 
• Algumas são quantitativas, o quanto de patógeno tem por mL de sangue; ou dá 
para usar apenas para ver se tem patógeno ou não tem (resultado mais rápido, 
1h e meia); a PCR convencional dependendo demora no mínimo umas 4 hrs 
para obter o resultado 
 
Métodos Indiretos: 
1. Imunodifusão em gel de ágar 
=> Princípio: observação de linhas de precipitação pela reação Ag-Ac. 
=> Propriedades: simples execução e implementação. Custo baixo. Sensibilidade 
razoável. Resultados em 24-48h. 
• Placa de petri ou lâmina de vidro, a mesma que usa para esfregaço sanguíneo. 
• Faz um gel de ágar e poços com furos, onde vai distribuir o antígeno e o 
anticorpo, e o soro do animal a ser testado. 
=> Restrições: Reações inespecíficas frequentes. Sensibilidade limitada. 
Qualidade do Ag é crítica. Somente qualitativa. 
=> Aplicações: AIE, língua azul, leucose enzoótica bovina. 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• No primeiro furo coloca o antígeno, no segundo coloca o soro do animal. 
Exemplo: animal positivo para anemia infecciosa equina, então tem soro com 
anticorpos. Tanto o anticorpo quanto o antígeno fazem difusão radial, então tem 
um espalhamento radial de ambos, radialmente ao poço que foi feito. Quando 
encontra antígeno e anticorpos, visualmente é possível observar uma linha de 
precipitação (ligação Ag+Ac). 
• Faz um furo central do gél de ágar, onde coloca o antígeno. Mais 3 furos que são 
os controles positivos (C+, controle positivo; soros com anticorpos anti-anemia 
infecciosa equina); faz mais 3 furos (1,2,3 com soro dos animais que está 
testando). Ocorre migração de antígeno na direção do anticorpo e vice-versa, 
ocorre linha de precipitação. Entre o 1 e o antígeno, não tem linha de 
precipitação, então é negativo para os 3 (na imagem de cima); na imagem de 
baixo já é possível observar a linha entre o poço da amostra testada e o 
11 
11 
 
 
antígeno, o animal é positivo, quando aparece essas linhas. 
 
2. Soroneutralização 
=> Princípio: Ac presentes no soro previnem a replicação do vírus e a produção do 
efeito citopático em cultivos. Também pode ser usada com cepas ncp (mais usadas 
na pesquisa) pq precisam de testes de IFA ou IPX para o resultado. 
*Ncp: cepa não patogênica; mais usado em pesquisa pq precisa de outra técnica para 
saber o resultado. 
=> Propriedades: Sensível e específica. Custo reduzido. Qualitativa e quantitativa. 
=> Restrições: Exige cultivos celulares. Implementação e execução podem ser 
problemáticas. Contaminação bacteriana. Toxicidade do soro. Detecta somente Ac 
neutralizantes. 
• Alguns soros acabam sendo tóxicos para as células, invalidando sua utilização no 
teste. 
=> Aplicações: Virtualmente todos os vírus que replicam em cultivo celular e causam 
efeito citopático. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• Quando tem um soro a ser testado, com anticorpos contra aquele vírus → o soro 
teste é colocado homogeneizado junto com suspensão de vírus → incubação 
em 24 horas para ocorrer ligação Ag+Ac → injeta nas células → se os Ac se 
ligarem aos Ag o tapete celular não se altera; mas se os Ac permanecerem livres, 
ou seja, não se ligar aos Ag do soro, ocorre infecção do tecido cultivado. Vírus 
não citopatogênico → não há alteração das células do tapete celular, então é 
reservado mais para pesquisas. 
 
3. ELISA 
=> Princípio: Ac presentes no soro se ligam aos Ag imobilizados em placas de 
poliestireno e são detectados por anti-Ac conjugados com enzimas. 
=> Propriedades: Rápida (2-3h). Sensível e específica. Automatizável. Disponível em kits. 
Pode detectar classes específicas de Ac (IgG, IgM). 
12 
12 
 
 
=> Restrições: Requer equipamentos (leitoras e lavadoras de placas). Custo dos kits 
pode ser altos. Não disponível para todos os vírus. Qualidade do Ag é crítica. 
=> Aplicações: Usada para inúmeros vírus. Qualitativa ou quantitativa. Ac totais ou 
classe específicos no soro ou secreções (leite). Variações da técnica detectam Ag. 
 
Fonte: Aline da Hora. 
3. Imunocromatografia para Ac 
=> Princípio: Ac reage com Ag e sua presença é revelada pela mudança de cor. 
=> Propriedades: Simples e prática. Kits. Rápida. Boa sensibilidade e especificidade. 
=> Restrições: Não automatizável. Especificidade e sensibilidade podem deixar a 
desejar. Custo individual alto. 
=> Aplicações: Aplicável à vários vírus de pequenos animais. Kits disponíveis para uso 
em clínicas. Também há kits para vírus de aves, suínos e bovinos. 
 
Fonte: Aline da Hora. 
4. Inibição da hemaglutinação 
=> Princípio: Ac antivirais impedem a atividade hemaglutinante dos vírus. 
=> Propriedades: Rápida. Sensível e específica. Custo baixo. 
=> Restrições: Só para vírus hemaglutinantes. Requer animais doadores de 
eritrócitos. Inibidores específicos podem dar falso-positivos. Não-automatizável. 
=> Aplicações: Vírus hemaglutinantes de aves e mamíferos. 
Bovinos: adeno, corona, parainfluenza 3. 
13 
13 
 
 
Equinos: encefalite equina (leste e oeste), influenza, adeno, encefalite 
japonesa. 
Suínos: peste suína, encefalomielite hemaglutinante, influenza, parvo. 
Cães: adeno, parvo. 
Gatos: panleucopenia. 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• Quando hemaglutina (poço com sangue no meio, pontinho), tinha anticorpo. 
 
5. Fixação do complemento 
=> Princípio: Ac que levam à ativação do sistema complemento e lise de eritrócitos. Na 
ausência de Ac, o sistema complemento promove lise de eritrócitos. 
=> Propriedades: Boa sensibilidade e especificidade. 
=> Restrições: Demorada. Trabalhosa. Não automatizável. Requer animais doadores de 
sangue. 
=> Aplicações: já foi muito usada. Atualmente, em desuso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• Se tem anticorpo, se liga ao Ag, se liga ao sistema complemento → não promove 
hemólise, hemácias livres e se depositam no fundo do pocinho (fundo em V). 
 
6. Imunoflorescência para Ac 
14 
14 
 
 
=> Princípio: Ac presentes no soro se ligam à Ag específicos imobilizados e são 
detectados por Ac marcados com FITC (isotiocianato de fluoresceína). 
=>Propriedades: Rápida. Relativa sensibilidade. Simples. 
=> Restrições: Reações inespecíficas. Exige microscópio com luz UV. Pode não detectar 
níveis baixos de Ac. Não automatizável. 
=> Aplicações: Uso atual restrito. 
 
Fonte: Aline da Hora. 
• Antígeno fixado em lâmina, coloca soro do paciente; se fluorescer, é uma 
amostra positiva.