Diagnóstico de doenças virais

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Por: Vinícius Souza Mendes
Taxonomia dos vírus
Em bactérias, a espécie vem do latim e
os vírus vem do inglês.
No geral, os vírus são agrupados na
família de acordo com características
estruturais morfológicas genéticas e
biológicas em comum.
Exemplo: herpesvírus -> Vírus
grandes, envelopados, várias
glicoproteínas (envelope), capsídeo
icosaédrico, dsDNA, latência.
Havia mais de 2600 espécies virais e
mais de 35.000 cepas existentes.
Conceito importante
A palavra patologia não deve ser usada
como sinônimo de doença, pois
patologia é o estudo da doença.
Infecção vs Doença
Para doenças virais, o evento doença é
uma exceção à regra!
Triângulo em iceberg: Primeiro
tem-se a exposição da infecção ->
infecção subclínica -> doença leve,
moderada e severa -> fatalidade do
animal. A maioria dos indivíduos
estaram na parte que se expuseram a
infecção ou infecção subclínica
(assintomático).
O estágio subclínico é detectável
somente com apoio diagnóstico
(disseminador silencioso)
O que determina se o animal será
assintomático? Precisa haver um
equilíbrio entre hospedeiro e
patógeno.
Toda vez que pensarmos em doenças
infecciosas, devemos lembrar da
tríade: hospedeiro (sistema imune),
patógeno (virulência) e meio
ambiente (população, densidade)
Na doença viral, a maioria dos sinais
clínicos observados são consequências
da resposta do hospedeiro à lesão
celular e tecidual. Como resultado
direto da replicação ou como resultado
da resposta imune do hospedeiro
(resultado indireto).
O que levar em consideração para
a escolha do teste
- Qual amostra deve coletar? A
detecção de anticorpo e antígeno é
melhor para detecção da doença
suspeita?
-Este teste responde à minha
pergunta?
Sensibilidade e especi�cidade analítica:
-Sensibilidade analítica: Capacidade
de um teste em detectar pequenas
quantidades do agente e seus produtos
(quanto maior a sensibilidade do teste,
menor será a quantidade de
anticorpos e antígeno necessário pois
o teste é muito sensível).
-Especi�cidade analítica: capacidade
de um teste em detectar um
determinado vírus ( ou seus produtos)
e distingui-los de outros, mesmo que
muito semelhantes, ou seja, menor a
chance de ter reação cruzada.
Nenhum teste do mundo tem 100% de
especi�cidade ou sensibilidade.
Métodos de diagnóstico direto
Consiste na detecção do patógeno ou
parte do patógeno.
1) Microscopia eletrônica: Os vírus
são muito pequenos por isso não
conseguimos observar no microscópio
óptico a partícula viral em si
(podemos ver os corpúsculos que são
acúmulos virais, mas não podemos
caracterizá-los de acordo com a
morfologia viral).
A princípio da técnica, temos a
visualização das partículas virais
curadas com metais pesados é um
microscópio Ultra potente.
É rápido o diagnóstico (poucas horas),
detecta vírus viáveis e inviáveis.
Pode ser útil para vírus que não
re�itam em cultivo celular e pode
permitir a identi�cação do agente.
Restrições: Equipamento
extremamente caro e exige
manutenção (que é cara), exige
pessoal treinado, baixa sensibilidade
(Amostra com pouca quantidade de
vírus e podemos pegar uma parte que
não tenha vírus, abaixa a
sensibilidade) aplicação restrita a
alguns vírus.
Aplicações: Infecções entéricas (rota,
corona, astro) e cutâneas (pox,
herpesvirus).
Acaba �cando essa técnica mais para
estudos.
2) Isolamento em cultivo celular:
Colocamos o meio de cultura em uma
garrafa e no fundo da garrafa há um
tapete de células que devemos
infectar com determinado vírus e elas
serão substratos para o vírus se
multiplicar.
É uma técnica que ampli�ca o
resultado.
Princípio: Observação do efeito
citopático e/ou detecção de produtos
virais após sua multiplicação e células
de cultivo
Propriedades: Sensível (aumenta
replicação viral) e o agente �ca
disponível para estudos posteriores
(podemos congelar esse vírus viável).
Implementação e execução
relativamente simples
Restrição: Técnica demorada, pode
levar até semanas para ter o
resultado da amostra ou observar o
efeito citopático.
Não é aplicado a alguns vírus (ex:
coronavírus felino).
Somente detecta vírus que estejam
viáveis (podemos até coletar o vírus
viável, mas pelo tipo de transporte
pode se tornar inviável)
Contaminação bacteriana e fúngica
nos meios pela manipulação das
garrafas de forma inadequada
Aplicações: Todos os vírus que se
replicam em cultivo celular, qualquer
material clínico pode ser submetido ao
isolamento.
3) Hemaglutinação:
Princípio: Observação da capacidade do
vírus de se ligar às moléculas da
membrana plasmática dos eritrócitos.
O recipiente tem um fundo em V -> se
a amostra é negativa (forma um botão
de hemácias que sedimentam no fundo
do recipiente), se é positiva (as
hemácias �cam presas em uma malha
junto com o vírus e �cam dispersas).
É uma técnica rápida, boa
sensibilidade, especi�cidade e fácil
execução.
Restrições: Aplicável em um grupo
restrito de vírus.
Hemaglutinação inespecí�ca -> a
vírus hemaglutinante na mostra, mas
não sabemos qual o vírus.
Necessidade de espécies doadoras de
hemácias: galinhas, coelhos, cobaias.
não é automatizável, depende da
manipulação da pessoa.
Aplicações: Aplicável aos vírus
hemaglutinantes de aves e mamíferos.
�uidos corporais e suspensões de
tecidos:
Bovinos: adeno, corona, parain�uenza
3
Equinos: encefalite equina (leste e
oeste), in�uenza, adeno, encefalite
japonesa.
Suínos: peste suína, encefalomielite,
hemaglutinante, in�uenza, parvo
Cães: adeno e parvo
Gatos: panleucopenia felina
Para parvovírus trabalhando em
estudos, é o padrão ouro.
4) Imuno�uorescência e
imunoperoxidase
Princípio: Proteínas virais são
detectadas por anticorpos especí�cos
conjugados com o material
�uorescente (IFA) ou como enzima
(IPX).
Propriedades: Rápido (minutos a
poucas horas), simples e baixo custo,
Boa sensibilidade e especi�cidade,
detecta vírus inviáveis, pode informar
sobre sorotipos.
Disponíveis em kits e aplicável
virtualmente em todos os vírus.
Imuno�uorescência: -Indireta: Há 2
anticorpos, o primário se liga ao
antígeno viral, e o segundo anticorpo é
marcado com a �uorescência, e ao
ligar com o anticorpo primário contra
proteína viral, a ligação irá gerar a
�uorescência.
-Direta: A �uorescência é mais
intensa e tem maior sensibilidade.
Proteína viral presente na amostra de
sangue, tecido -> o reagente tem
anticorpo (marcado com a
�uorescência) contra o antígeno viral
-> quando ocorre essa ligação, no
microscópio, ligamos uma luz e
enxergamos a imagem.
Imunoperoxidase: Há 2 anticorpos, o
primário se liga ao antígenos viral, e o
segundo anticorpo é marcado com
biotina, e ao ligar com o anticorpo
primário contra proteína viral, e ao se
ligar, a biotina age com a avidina
(complexo biotina + avidina) irá
�orescer).
Restrições: Equipamento caro (IFA).
Reações inespecí�cas -> algumas
células emitem �uorescência natural.
Reagentes para alguns vírus podem
não estar disponíveis.
Aplicações:
Aplicável para qualquer vírus que tem
anticorpos especí�cos.
Materiais: tecidos ( frescos,
Congelado, Fixados), esfregaços
(sanguíneos e secreções), células de
cultivo.
5) Testes imunoenzimáticos (elisa) /
cromatográ�cos
Princípio: A presença de antígeno que
reage com o anticorpo especí�co
imobilizado ou após migração, é
revelada pela mudança de cor.
Propriedade: simples e prático,
disponível em kits, rápido e boa
sensibilidade e especi�cidade.
Restrições: Não automatizável,
especi�cidade E sensibilidade podem
deixar a desejar, custo alto por
amostra.
Aplicações: Aplicações a vários vírus
de pequenos animais.
Kits disponíveis para uso em clínicas e
também para o uso em bovinos suínos
e aves
6) Detecção de ácidos nucleicos (PCR),
hibridização
Princípio: ácidos nucleicos (RNA ou
DNA) do vírus são detectados por
sondas marcadas (hibridização,
observado em microscópio de
�uorescência) ou após a ampli�cação
por reação enzimática (PCR)
Propriedades: Especí�ca e sensível
(ampli�ca o resultado).
Necessita de quantidades mínimas de
amostra.
Potencialmente aplicável a todos os
vírus.
Rápida e automatizada (PCR). Pode ser
uma técnica quantitativa (qPCR).
PCR: qualquer tipo de material que
tem oantígeno viral -> extração do
ácido nucleico -> suspensão de ácido
nucleico -> cNTPs, primers
(sequências dos patógenos que vamos
complementar), enzima polimerase ->
coloca dentro do termociclador
(30-50 ciclos) em 3 etapas:
Desnaturação (aquecimento de 95 °C
-> a �ta dupla se dissocia em 2 �tas
simples, anelamento (50°C) dos
primers para delimitar a área alvo ->
extensão (72°C) a polimerase lê o
genoma do patógeno e vai
completando com os primers (adenina
- timina; citosina - guanina).
Exemplo: No �nal, o que importa são
as �tas menores que queremos
ampli�car: No ciclo 4 -> temos 8
cópias do alvo com 8 fragmentos do
ácido nucleico.Ou seja, na amostra, se
tiver 1 partícula do vírus, após 4 horas
teremos mais de 1 bilhão de cópias de
alvo.
Como podemos ler? Pelo método
convencional de eletroforese: de
acordo com o peso molecular, as
moléculas irão correr sobre um gel de
agarose e as bandas irão migrar ->
positivo ou negativo.
PCR em tempo real (qPCR) -> ocorre
todos os ciclos que ocorre na PCR
convencional e o resultado vemos em
grá�co baseado em �uorescência.
Resultado em 1 hora e 30 min.
Restrições: Custo alto
Requer equipamentos e pessoal
treinado e a técnica é so�sticada.
Aplicações: Virtualmente para todos
os vírus conhecidos.
Pode ser realizada em qualquer
amostra clínica.
Métodos de diagnóstico indireto
Mensura a resposta do hospedeiro ->
sorologia (IgM e IgG).
1) Imunodifusão em gel de ágar
Princípio: observação de linhas de
precipitação pela reação Ag-Ac.
Iremos fazer um furo com o antígeno
e o outro furo colocamos o soro do
animal -> o anticorpo e antígeno
fazem difusão radial, a medida que vão
migrando e quando encontram
antígeno e anticorpos -> formam uma
linha de precipitação.
Propriedades: Simples execução e
implementação. Custo baixo.
Sensibilidade razoável e resultados em
24-48 horas.
Restrições: reações inespecí�cas
frequentes, sensibilidade limitada e a
qualidade do antígeno é crítica.
É uma técnica somente qualitativa
(podemos dizer que o animal tem ou
não anticorpos contra os antígenos e
não a titulação deles).
Aplicações: anemia infecciosa equina,
língua azul, leucose enzoótica bovina.
2) Soro neutralização
Princípio: Anticorpos presentes no
soro previne a replicação do vírus e a
produção do efeito citopático em
cultivos.
O soro teste com anticorpos entra em
contato com o vírus por 24 horas -
veri�camos as células. Se o animal
tiver anticorpos, ele reage com os
vírus e não há replicação nas células
(não acontece nada). Se o animal é
negativo, não tiver anticorpos contra
o vírus, ele consegue infectar e
replicar nas células.
Podem ser usadas com cepas ncp
(mais usadas na pesquisa) pois
precisam de testes de IFA e IPX para
os resultados.
Propriedade: sensível e especí�ca,
custo reduzido, qualitativa e
quantitativa.
Restrições: Exige o cultivo celulares.
A implementação e execução podem
ser problemáticas (Pela di�culdade
para que as células e vírus
permaneçam viáveis).
Contaminação bacteriana.
Toxicidade do soro (pode não utiliza
determinado soro)
Detecta somente anticorpos
neutralizantes.
Aplicações: virtualmente todos os
vírus que replicam em cultivo celular
e causam efeito citopático.
3) Elisa
Princípio: Anticorpos presentes no
soro se ligam aos antígenos
imobilizados em placas de poliestireno
e são detectados por anti-Ac
conjugados com enzimas.
Propriedades: Rapido (2-3h).
Sensível e especí�co.
Automatizável
Disponível em kits
Pode detectar classes especí�cas de
Ac (IgG e IgM).
Restrições: requer equipamento,
leitoras e lavadoras de placas.
Custo dos kits pode ser altos
Não disponível para todos os vírus.
Qualidade de antígeno é crítica.
Aplicações: Usada para inúmeros
vírus, quali ou quantitativa.
anticorpos totais ou classe
especí�cos no soro ou secreções
(leite).
variações da técnica detectam
antígenos.
4) Imunocromatogra�a para Ac
Princípios: Ac reage com Ag e sua
presença é revelada pela mudança de
cor.
Propriedades: Simples e prática, kits,
rápida, boa sensibilidade e
especi�cidade.
Restrições: Não automatizável,
especi�cidade e sensibilidade podem
deixar a desejar e custo individual
alto.
Aplicações: Aplicável a vários vírus de
pequenos animais. Kits disponíveis
para uso em clínicas e também há kits
para vírus de aves, suínos e bovinos.
5) Inibição da hemaglutinação
Princípio: Anticorpos anti virais
impedem atividade hemaglutinante dos
vírus
-Cães: adeno e parvo
-Gatos: panleucopenia felina.
O botão -> inibição da hemaglutinação
O todo rosado -> hemaglutinação
Propriedades: técnica rápida, sensível
e especí�ca, custo baixo.
Restrições: Uso apenas para vírus
hemaglutinantes.
Quer animais doadores de eritrócitos
Inibidores especí�cos podem dar
falso-positivos
Não automatizável
Aplicações: Vírus hemaglutinantes de
aves e mamíferos
Bovinos: adeno, corona, parain�uenza
3
Equinos: encefalite equina (leste e
oeste), in�uenza, adeno, encefalite
japonesa
Suínos: peste suína, encefalomielite
hemaglutinante, in�uenza, parvo.
6) Fixação do complemento
Princípio: Na ausência de Ac, o
sistema complemento promove lise de
eritrócitos
7) Imuno�uorescência para Ac
Princípio: Ac presentes no soro se
ligam à Ag especí�co imobilizados e
são detectados por Ac marcados com
isotiocianato de �uoresceína (FITC).
Propriedades: Rápida, simples e
relativa sensibilidade
Restrições: Reações inespecí�cas,
exige microscópio com luz UV, pode
não detectar níveis baixos de Ac e não
automatizável.
Aplicações: Uso atual restrito