Variabilidade Genética, Mutação e Polimorfismos

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GENÉTICA MOLECULAR – VARIABILIDADE GENÉTICA, MUTAÇÕES E POLIMORFISMOS
PABLO BERINI LEMGRUBER – MEDICINA FAMINAS
É a característica que faz com que os indivíduos sejam tão diferentes na população. Mais de 85% do nosso genoma é idêntico, similar a outras espécies, então o que nós temos é que grande parte daquele número do genoma que foi descoberto é que não faz parte do DNA codificante, das nossas características. 
Variabilidade genética do genoma humana: mutações e polimorfismo
· Elas vão ser um pouco diferente sobre quando foi falado de alterações cromossômicas porque nesse caso como esta falando de mutação e polimorfismo, porque esta falando de mutações em regiões pequenas de genes. 
· Genes são aquelas unidades fundamentais do DNA que estão associadas a alguma característica porque estão conduzindo determinada proteína.
· Então o que tinha visto antes era alterações cromossômicas numéricas ou estruturais que como eram de um cromossomo inteiro elas causavam muitas alterações; e mexiam em todos os cromossomo, de todos os pares ou mesmo um cromossomos a mais inteiro todos os genes dos cromossomos estavam alterados.
· O que é mutação? Qualquer alteração dessa sequência de DNA, que será alterada em relação aos nucleotídeos que compõem essa sequencia, podendo ter alteração de um só nucleotídeo que é chamado de slip que é um polimorfismo; ou de vários nucleotídeos onde diminui o numero de repetições o que vai causar umas respostas diferentes nas células. 
· Essas mutações vão ser alteradas de acordo com o número de nucleotídeos que elas afetam, podem ser alteradas de acordo a localização; uma mutação no íntron é diferente de uma mutação no éxon, um éxon numa sequencia codificante vai ter uma alteração significativa do produto de houver se houver uma alteração significativa das bases que as compõem; pode ter também uma alteração que seja em uma região de ativação ou inativação de um gene, vai estar tentando regulação daquele gene.
· Podem classificar as mutações de acordo com as origens, se for originadas de algum evento físico como, por exemplo, uma radiação, as radiações são capazes de alterar o DNA então uma radiação solar UVA, UVB são capazes de alterar uma molécula de DNA conforme exposição; por isso que tem o câncer de pele como o mais prevalente no brasil justamente devido aquelas pessoas mais expostas. 
· E é justamente nessa radiação que está baseada alguns tratamentos, então a radioterapia esta baseada muitas vezes em alteração de DNA para matar as células especificamente como algumas radiações que vão levar ao câncer.
· Pode ser também a origem dessas mutações algumas substâncias químicas, já se conhece algumas substancias químicas que são capazes de alterar o DNA, como agrotóxicos, medicamentos; que são capazes de alterar a sequencia de DNA e depois as proteínas e alterar o produto final causando algum tipo de variação na expressão daquela células. 
· Podem ser também induzidas ou não, muitas vezes como tratamento de quimioterapia esta querendo alterar nível DNA, causar uma toxicidade ao DNA, então pode induzir ou pode acontecer aleatoriamente.
· Essas mutações, pode ser em qualquer região que aqui tem uma troca, uma alteração, tem um alelo selvagem que é o natural encontrado na natureza e o alelo mutante, ele mudou onde deveria ter G mudou para T, isso ocorre naturalmente no momento de duplicação de DNA sem querer ao invés de vir um nucleotídeo com um G vem um nucleotídeo com um T; e naturalmente tem mecanismo de reparo do DNA dessa alteração. Se houver alguma alteração nesse mecanismo de reparo ai essa mutações vão seguir e pode ser que essa alteração pontual cause alguma alteração na expressão da celular.
· Um outro tipo de mutação e quando não tem, não ocorre em uma base, houve uma deleção. Pode ter troca, pode ter deleção, pode ter uma adição de bases de uma ou de mais; onde se classifica esse tipo de mutação. Como essas mutações podem ou não alterar uma célula.
· Nas bases, as pirimidinas são uracila, citocina e timina; e a purinas são adenina e guanina. Então quando espera uma alteração de uma pirimidina por outra pirimidina terá uma transição, é a mesma coisa com a purina por outra purina terá outra transição; geralmente elas são menos patogênicas, elas podem causar uma menor alteração na conformação do DNA.
· Um outro tipo de mutação é a transversão será ao contrario uma pirimidina por uma purina ou purina por pirimidina; onde terá uma alteração maior nessa molécula de DNA, porque na transição não esta alterando a proporção do número de pirimidinas na molécula e na transversão terá uma alteração dessa proporção.
· Outro tipo de mutação será classificado em relação ao número de nucleotídeos que foram alterados, então se tem as mutações de ponto, chamadas de mutações pontuais são aquelas que ocorrem em uma região especifica do gene, muitas vezes vão alterar apenas um nucleotídeo o já é suficiente para alterar completamente a expressão de uma célula. 
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· No caso da anemia falciforme onde terá alteração de um nucleotídeo, e vai alterar toda a estrutura da hemácia.
· Outro tipo de mutação é a deleção de bases, e essa deleção assim como a inserção ou adição de bases ocorrem principalmente devido aquele mal pareamento, no momento do crossing over que terá uma diminuição ou repetição do número de bases.
· Além disso, pode ter um tipo de mutação que e chamada de expansões de sequencias repetidas, porque já tem uma região do DNA que é formada por varias sequências repetitivas e altera o número dessas sequencias repetitivas; porque? Algumas doenças estão caracterizadas pelo número de repetições, então às vezes quanto maior o número de repetições, mais toxicas é, maior é a produção de uma proteína que seja toxica, onde será mais grave o quadro daquela doença naquele indivíduo, do que aquele indivíduos que tem menos sequencias repetidas isso é um tipo de mutação que será classificada.
· A mutação de ponto é quando tem alteração de apenas uma base, uma região, seja uma radiação; então ao invés de ter uma adição de G nessa fita terá uma alteração pelo T, onde vem a base complementar onde será Adenina. Então teria a substituição de um par de bases GC para TA e isso esta causando alteração na expressão daquela célula, isso é extremamente comum em nosso genoma. Têm-se muitas alterações de ponto no nosso genoma, e isso faz com que sejamos diferentes uns dos outros, esse é um tipo de mutação mais recorrente. Existe um banco de DNA genético disponível, na internet BBSNB são todos os slips presentes em cada uma das espécies e hoje em dia tem uma movimentação no sentido da paternidade ser realizado por esse slips e não mais pelos microssatélites; ainda é realizado pelo microssatélite por ser mais barato, mas a informação por slips é muito mais rica porque tem mais slips do que microssatélites no organismo , eles conseguem diferenciar bem os indivíduos, soa bastante utilizados; e além disso tem-se observado que esses Snipes muitas vezes estão relacionados na alteração na expressão um determinado fenótipo, sabe também que esta relacionado a uma determinada característica, então eles vão ser utilizados como marcadores moleculares, se quiser saber se aquele indivíduo tem alteração ou não ai vai naquele slip especifico para saber se ele tem ou não pré disposição a um a determinada doença. Essas mutações pontuais são importantes para avaliar.
· O que quer dizer código genético degenerado? Mais de uma trinca, diferentes trincas pode modificar para o mesmo aminoácido. Então teria três bases combinadas teria 64 possibilidades de trincas, no entanto agente tem 20 aminoácidos só na natureza, ou seja, tem 64 trincas que estão codificando para 20 aminoácidos, então tem mais de uma trinca codificando para o mesmo aminoácido. O que isso significa? Isso significa que tanto o CCU, CCA, CCG estão codificando para prolina; então se trocar esse 3º nucleotídeo, essa 3ª base, o CCA para CCG se houver uma mutação nessa 3ª base da trica, devera ter alteração? NÃO, então se acontecer alguma mutação nessa 3ª base muitoprovavelmente não vai ter alteração do fenótipo do indivíduo, da proteína que esta sendo produzida. Isso ocorre geralmente com alteração na 3ª base.
· Se houver alteração na 1ª base, CCA para ACA, ai muda a trinca, muda completamente a proteína. Então se houver alguma alteração que ocorra na 3ª base e não na 1ª. 
· Pode classificar as alterações em sinônimos que são aquelas que mesmo que tenha a mutação não observa uma alteração no produto final; e não sinônimos onde consegue observar alguma alteração. A alterações podem ser tanto para um outro aminoácido, antes viu alteração de prolina para treonina, como também para um aminoácido que é stop códon, exemplo quando tem um aminoácido de parada, onde estava produzindo uma proteína que deveria ter 50 aminoácidos na cadeia parou quando estava com 3 aminoácidos, não será a mesma proteína, pois quando chegou no 3º aminoácido entrou uma aminoácido de parada e formou uma proteína menor só com 3 aminoácidos; então isso também altera. Nessa qualidade de não sinônimo vai determinar se elas são não sinônimo no sentido de alterar o aminoácido ou no sentido de promover um códon de parada.
· Exemplos de mutações de pontos não sinônimos: alteração de AAA para UAA e esse UAA é um stop códon, então entrou um códon de parada. Pode ter tido uma alteração e não ter parado a proteína deveria ter só 15 aminoácidos e tem 70, é uma proteína completamente diferente.
· No caso de mutações sinônimas tem geralmente uma alteração na base de 3ª trinca, esta codificando CUA mudou para CUG, os dois nucleotídeos por mais que tenha tido uma mutação pontual não teve uma alteração de aminoácidos, então muitas vezes se olha só o genoma não é suficiente saber se esta tendo uma alteração da expressão. E UCU para UCC, também tem alteração de serina para serina não tem alteração de verdade, pois terá produção de serina em ambas as trincas, onde é classificada como mutação de códon sinônima, ou silenciosa ou conservativas; geralmente acontecem em regiões que são codificadores em regiões ectópicas menor necessidade de se preocupar, geralmente ocorre na 3ª base e não tem alteração final da proteína na sequência de aminoácidos produzidos. Ex. 5 aminoácidos e códon de parada e não teve alteração deles mesmo tendo uma mutação que alterou o RNAm; muitas vezes como só alteram as regiões intronicas isso nem passa para o RNAm.
 
· Quando tiver essa alteração não sinônima será classificada em mutações de sentido trocado, terá uma alteração onde o aminoácido esta sendo produzido, então trocou a base e o aminoácido, isso com sentido trocado. Outra classificação é sem sentido quando tem alteração com códon de parada. 
· Então, por exemplo, com uma alteração de CAC para CUG, quando tiver essa proteína alterada que passou de CAC para CCC terá uma glicina no lugar da valina, quando alterou o aminoácido alterou a conformação primaria, secundaria, terciaria e quaternária da proteína consequentemente; com isso alterou a proteína e quando altero uma proteína porque teve uma troca de aminoácido se classifica como não sinônima e de sentido trocado.
 
· Isso é um mecanismo de muitos tipos de câncer, quando altera a proteína muitas vezes vai alterar a morfologia da célula ou mesmo a capacidade de multiplicação dessa célula.
· A outra classificação da mutação é a sem sentido, é quando houve alteração de um aminoácido normal entre os 20 aminoácidos para um aminoácido do tipo de códon de parada. Então por exemplo, uma alteração no ATT e quando teve essas alteração entrou o stop códon, quando entrou o stop códon a proteína desse tamanho ate o final parou logo no inicio com 3 aminoácidos, porque essa mutação promoveu a entrada de um códon; essa é mutação não sinônima e sem sentido.
 
· Então, quais os 3 tipos de mutações vistas? Sinônima ou não sinônima; dentro da Sinônima classifica como sentido trocado ou sem sentido.
· No RNAm tem –se uma serina nessa região, nessa alteração tem uma alteração de uma base, na 2 base da trinca, e essa alteração promoveu a produção de uma leucina; UCA mudou para UUA; essa UCA produziu uma serina e a UUA produziu uma leucina. Qual é o tipo de mutação, classifique? Mutação pontual, não sinônima de sentido trocado.
· No próximo temos uma alteração de UCA para UAA, sendo esse um UAA é um stop códon. Mutação pontual não sinônima sem sentido.
· E na última de UCA para UCG, (quando muda só a 3ª base não tem alteração de verdade), teve também uma produção de serina. Mutação pontual e sinônima.
· Essas mutações acontecem principalmente no sitio codificante, normalmente lá nos éxons que se vê esse tipo de alterações; e tem as mutações em região que não é codificante, mas que ela esta regulando a produção da proteína que será característica daquele gene. 
· Quando tem uma alteração na região que regula a expressão do gene, pode ter uma alteração para aumentar ou diminuir a expressão de uma determinada característica. Então muitas vezes a mutação não esta no éxon, procura porque esta acontecendo aquela reposta naquele paciente, porque tem aquela proteína toxica em maior quantidade se no exozoma não tem nenhum tipo de alteração, nenhuma mutação daquele paciente normal para um que esteja em um estado mais grave. Observa-se a região reguladora onde encontra essa alteração que faz aumentar a expressão daquela proteína e quando tem uma quantidade maior de proteína do que a basal pode promover uma alteração em algum tipo de doença.
· Pode- se classificar as mutações quanto à localização que elas ocorrem.
· Além dessas alterações que tem a troca de uma base por outra; pode ter uma mutação que pode ter uma inserção ou deleção de base; onde tem uma alteração que chama janela de leitura, pois ela pode alterar tudo dali para frente. Elas são mais perigosas do que uma troca. Uma troca pode acontecer e ficar silenciosa; mais se tiver uma sequencia de DNA de ATA, ACG, TTA, GCC, tem –se 4 trincas de base, se tiver uma alteração onde entrou uma base nova, uma inserção, inseriu um A, onde terá uma trinca de ATA, ACG, ATP, AGC; daqui para frente a proteína será completamente alterada porque simplesmente porque mudou uma base. O mesmo acontece se tiver a sequencia de ATA, ACG, TTA, GCC e tiver uma deleção de base, cortou o A, foi retirado da molécula de DNA; terá uma sequência de ATA, GCT, TAG, CCA; então a adição de uma base mudou muito. 
· Então se tiver essa sequencia ATA, AGC, TTA, GCC; com alteração de 3 bases, em que tem a adição de ATA; a proteína será ATA, ATA, ACG, TTA, GCC; não mudou, então muitas vezes quando tem a adição de 3 altera menos a proteína do que se houver a inserção ou deleção de apenas uma base. 
 
· Às vezes terá uma deleção de 3 bases, onde ficará um aminoácido no lugar de uma proteína o que pode causar uma proteína completamente diferente, mas será menos sentida do que se houver uma base a mais ou a menos. Essa pontual é mais perigosa do que muitas vezes se entrar uma sequência inteira. Ela não é menos prejudicial, mas ela pode ser por estar alterando menos a proteína.
· A título de curiosidade: tem-se um estudo que e chamado de modelagem molecular, onde tem nos grandes centros de pesquisa essa modelagem molecular que é quando projeta sabendo qual é a sequencia de DNA (proteínas), no computador qual é a forma dessa proteína. Digamos que seja uma linhagem de um câncer específico onde se fez o mapeamento e sabe a sequência do DNA daquela célula tumoral, nessa célula tumoral consegue ver a proteína que ela esta produzindo que muitas vezes esta relacionada aquela infecção. Então produz um medicamento mais especifico para aquela proteína, onde projeta no computador uma proteína de algum medicamento (fitoterápico) que interage com aquela molécula que esta sendo produzida. Isso pode ser feito por saber qual a molécula esta sendo produzida, como é o aminoácido final, qual a conformação primaria, e fara secundaria, terciária, e quaternária no computador e saberá como é a proteína e produzira ummedicamento para essa proteína fazendo a modelagem do medicamento; e testa virtualmente esse medicamento com a proteína que foi produzida pela sequencia que foi jogada no computador. A fiocruz utiliza isso para produção de medicamento com essa modelagem molecular.
· A delação terá a retirada de uma base e a inserção tem uma base a mais onde a sequência fica alterada, e em 1 altera muito mais do que as 3 bases.
· Alteração da janela de leitura é o que consegue ler de aminoácidos em cada uma delas.
· Se tiver alteração com uma base, terá uma alteração muito maior, onde todos os aminoácidos da frente estarão geralmente alterados.
· Pode ter além dessas alterações dessa janela de leitura tem as inserções em algumas regiões que chama de splicing que vão ser retirados onde tem o íntron ou o éxon. Então dependendo da região que esta mutação aconteceu terá uma alteração maior ou menor da sequência produzida.
· Por último será visto a classificação de expansões de DNA repetitivo em tunner.
· A parte do DNA repetitivo pode ter 3 repetições daquela base, em outro indivíduo tem 5 repetições daquela base que terá um fenótipo diferente do que tem 3 repetições, onde isso será causando tanto por aquele pareamento errado que promove duplicações ou deleções de sequencias maiores de nucleotídeos ou também no mecanismo que é chamado de “escorregão” da polimerase. É como se tivesse produzindo um grão da molécula de DNA, como se tivesse dobrando como um grão ele introduz uma molécula maior ou menor.
· Esse é o crossing over desigual que já foi visto nas alterações cromossômicas, produzindo delação ou inserção. Tem sequencias que são repetitivas e quando tem o pareamento de cromossomos homólogos, ele pareou, ele produz um produto recombinante maior e um produto recombinante menor; um com inserção de bases e um com deleção de bases.
· E a outra forma de produzir essa alteração é com esse escorregão da DNA polimerase, esse escorregão é o que? Se já tem sequências que são repetitivas, então se esse GAG esta interagindo como CAG, ai produz outro CAG, e outro CAG, tanto faz para ele, e pode ser que ele faça esse grão, e quando ele produz esse grão terá uma sequência complementar a ele que aumentou ou diminuiu a sequência de DNA produzida; simplesmente porque grampeou. Uma parte de molécula de DNA é cortada e nessa replicação terá um sequência deletada ou um sequência de inserção.
 
· São duas formas de produzir essa alteração de repetição.
· Classificou quanto à localização, quanto ao tipo, agora vamos classificar quanto à origem. Estejam atentos na prova ou exercício qual o tipo da classificação. Classifique a mutação: em relação a expressão fenotípica? Se é sinônima ou não sinônima, em relação a localização se é no íntro ou no éxon se é em uma região reguladora que altera a expressão, ou em relação a origem se é espontânea ou induzida. Então o tipo de classificação dela vai depender desse parâmetro que vai ser colocado na prova.
· A origem das mutações podem acontecer de maneira espontânea onde a todo o momento terá produção de células mutáveis, são números assustadores os números de células mutantes produzidas ao dia; se pensar nessa multiplicação de células é muito natural que durante essa replicação do DNA aconteça essa duplicação e que passe abatido. Se essa célula continuar e não for atacada pelos mecanismos de reparo de DNA e não for atacada pelo sistema imune, e muitas vezes essas células vão se perpetuar vão produzir algum tipo de tumor. Então, essas mutações podem ser do tipo espontâneas que ocorre os erros de duplicação de DNA e também algum tipo de modificação de base que ocorra de maneira natural.
· Ou ainda podem ser induzidas, onde tem fatores de risco exógenos que podem ser físicos ou químicos; tem as radiações ionizantes, raio x, raio beta, raio alfa; que um potencial maior de produção de mutações e se baseia com radioterapia; e algumas radiações não ionizantes e alguns agentes químicos que seja mutagênicos. Existem diversos componentes que utiliza em laboratório que tem a capacidade de alterar, de produzir algum tipo de metilação no DNA e essa um metilação produz alguns sítios que são mais prováveis que aconteça uma quebra no DNA e quando acontece uma alteração na conformação do DNA terá alteração em todos os processos de replicação, transcrição e tradução do DNA.
· Isso também é uma alterações bem observadas que promove um sitio que mais predisposto a alterações, os dímeros são sequencias com 2 daquelas bases, então duas bases de timina unidas geralmente produzem essa dobra na molécula de DNA. E quando tem uma alteração conformacional, ou seja, uma alteração física na molécula de DNA promovendo essa dobra pode ter uma alteração também no produto; muitas vezes não tem alguma alteração mas são regiões em que observa uma alteração estrutural na molécula de DNA.
 
· Um outro tipo de agente causador de mutações são alguns radicais livres que interagem com moléculas de DNA, e quando agem no DNA pode causar uma quebra estrutural causando alteração física do DNA que terá uma alteração do núcleo da célula quando for traduzido por essa trinca.
· Tem-se taxas de mutação diferentes em diferentes células, então dependendo do grau de proliferação dessas células vai ter taxa de mutação maior; e também entre espécies e quando se fala em espécies fala-se em indivíduos diferentes com hábitos diferentes que vão produzir substancias diferentes que estarão interagindo como DNA. Hoje fala-se sobre a epigenetica que é uma área da genética que se vê a atuação de substancias que não são necessariamente as bases nucleotidicas com essa sequencia de DNA, elas tem capacidade de alterar o perfil de expressão dessas células. 
· Isso muda muito, tem que fazer mudanças no que tem pensado em genética evolução, pois quando pensa em algumas moléculas que são produzidas interagem com DNA, muitas vezes adquiriu essas moléculas ao longo da sua vida e elas vão alterar a expressão. Ex. estudo feito com camundongos onde observou que o pai desses camundongos tinha passado por situações de perigo durante a vida, onde essas situações de perigo foram printadas no DNA desse indivíduo então onde passavam tinha medo de altura. Então pensa que isso não pode ser passado para o filho, porem o que observou é que pode sim, ele foi passado de pai para filho. Esse medo de altura foi produzido ao longo da vida desses pais em determinadas moléculas, conseguiram interagir com moléculas de DNA desses ratos e foram passadas de geração para geração. Se olhar o DNA do ratinho pequeno não tinha nenhuma alteração, mas ele tem moléculas naquela célula que interage com DNA que vão alterar essa expressão.
· Isso é muito explorado na medicina porque se existem moléculas que não estão necessariamente no DNA, mas que estão alterando essa expressão muitas vezes é o que precisa lá no princípio de uma determinada doença. Seja ela com nutrição, com terapia, algum tipo de químico ou mesmo por algum tipo de comportamento que submeta aquele indivíduo.
· Essas mutações também podem ser alteradas em relação ao tamanho do gene, se tem um gene maior tem uma menor de probabilidade de mutações.
· Pode alterar a função celular.
· A localização vai ser alterada, e quando vê aqueles genes duplicados aquelas regiões chamadas de expressões de repetições, pode ter regiões mais propensas a acumular essa mutações com maior numero ou menor dessas alterações.
· Quando tem uma mutação que tem como consequência onde um único gene pode ter mais de uma mutação, as doenças são causadas por mais de uma mutação por determinado gene precisa-se avaliar e caracterizar quais são as mutações, avaliar o que espera da expressão daquele indivíduo.
· Tem diferentes versões, viu-se em microssatélites, então quanto maior o número de repetições maior número de alelos onde são alelos diferentes, são números de repetições diferentes que caracteriza alelos diferentes. Ex. receptor do LDL tem diferentes tipos mutações relacionadas a esse gene. Quando pensa,em numero de gene não tem só uma mutação relacionada a doença, pode ter diferentes tipos de mutações que esta causando o mesmo tipo de alteração de característica final. No LDL tem 700 tipos de mutações catalogadas. Elas podem gerar um ganho ou perda de condução, um aumentou ou diminuição da proteína que esses genes estão codificando e também na modelagem molecular pode ter uma alteração dessa afinidade de enzima substrato ou receptor ligante em caso de medicamento.
· Elas podem acontecer tanto em células germinativas quanto em células somáticas, são mais comuns em células somáticas, e quando ocorrem nas células somáticas não necessariamente são passadas de geração para geração; e quando ocorre em células germinativas vai ter essas alterações passadas nas gerações, hereditárias.
· Ela pode alterar sim ou não a função da proteína ou das células, sim ou não dependendo, se forem silenciosas ou não, se estiverem relacionadas a uma alteração maior de proteína ou não.
· Na próxima aula falara sobre as mutações pontuais.
Mutações Gênicas
· mutação de ponto
· deleções de bases
· interseções de bases
· expansão de sequências repetidas
Grande parte do nosso DNA é idêntico, não tem variações, e quando um indivíduo apresenta uma variação ele apresenta consequentemente uma variação em seu fenótipo, ou seja, hoje além de ser estudado o genoma, transcriptomas, etc. muitos bancos estão ali para descreverem mutações que permanecem na população em maior frequência. Com isso eles conseguem associar esses quadros dessas mutações a determinadas condições. Por exemplo, imagine que um grupo A apresenta uma doença (câncer), e um grupo B que não apresenta a doença. Hoje em dia é feito um método em que onde tem mutação é possível marcar, por meio de chips de DNA, as alterações do DNA através dos polimorfismos que um determinado indivíduo possui. 
Existem alguns aminoácidos que possuem uma caracterização estrutural muito semelhante, e consequentemente funções muito semelhantes. Quando temos uma alteração da sequência polipeptídica primária de uma proteína isso faz com que tenha alteração de outro aminoácido muito semelhante a ele também
Classificação das mutações em relação aos tipos de substituição ou de deleção, inserção de uma ou mais bases, e ainda temos o que chamamos de expansões de sequencias repetidas; ou seja, tem-se um número de sequencias repetidas e vão ocorrer após processos moleculares, duplicação, p.ex, a existência de novas repetições de sequências repetitivas. E isso estará caracterizando um grau de doenças mais grave.
O primeiro tipo de mutação que vamos falar é a mutação de ponto.
Mutações de ponto
São aquelas que vão causar alteração de apenas UMA base nesse genoma. Portanto, nesse ex, tem-se uma fita dupla de DNA, sendo que em roxo, esse pareamento G-C será alterado para T-A. Isso muitas vezes pode ser induzido por algumas substâncias; essa alteração pode alterar toda a janela de leitura (nós vamos falar sobre essa janela de leitura). Pq é preciso ler trincas de nucleotídeos para formar aminoácidos que, por sua vez, vai formar as proteínas. Se tem alteração nessas trincas de nucleotídeos que formam os aminoácidos tem-se alteração na estrutura primária das proteínas que, por sua vez, pode alterar a estrutura secundária, terciária e quaternária. Então a conformação final de uma proteína pode ser alterada simplesmente pela alteração de apenas uma base nucleotídica.
Consequências das mutações de ponto
Então vamos observar aqui as alterações das mutações de ponto. Quando se fala das consequências das mutações de ponto é preciso tem em mente esse processo de transcrição e tradução para uma proteína (do DNA para uma proteína).
0. Depende do local do genoma- O DNA vai ser lido em trincas; na verdade os RNAm que serão lidos em trincas; a partir do DNA irá produzir um transcrito, que é o RNAm e, este contém a informação para a produção de uma molécula de proteína formada por uma sequência de aminoácidos. Essas alterações podem tanto alterar a proteína quanto serem despercebidas. Por que ela pode ser percebida ou não? Porque a gente tem um código genético, o qual definido ele como degenerado. O que quer dizer (vcs vão encontrar em diversos livros esse termo – “o código genético humano é degenerado”); o código genético é degenerado, pois: se a gente colocar 03 nucleotídeos possíveis, 03 porções e a gente fizer uma trinca de nucleotídeos e, em cada um desses espaços da trinca de nucleotídeos a gnt tem 04 possibilidades de nucleotídeos formando aquela trinca, a gnt chega a 64 combinações possíveis de trincas de nucleotídeos. Na natureza, a gente só tem 20 aa possíveis que são codificados por essas trincas. Então, tem-se 64 combinações para apenas 20 aa. Isso significa que mais de uma trinca vai codificar para um mesmo aa. Portanto, se tem uma trica: UAU e uma UAC ambas estão codificando para o aa tirosina; se ocorrer uma mutação de ponto no 3º nucleotídeo (UAU virando UAC = NÃO tem alteração do aa resultante, visto que os dois produzem tirosina). Logo a proteína formada não tem NENHUMA alteração na sua conformação, pois na proteína tem uma tirosina, mesmo tenha ocorrido uma mutação na molécula de DNA e foi passada para o RNAm; porém, no momento em que vai passar do RNAm para a proteína, não observa alteração na cadeia polipeptídica.
0. No caso de genes de proteínas: sinônimas ou não-sinônimas- Uma mutação de ponto pode ou não alterar a cadeia polipeptídica. Isso significa, em termos genéticos, que elas podem ser sinônimas ou não sinônimas.
As mutações de ponto não sinônimas têm alteração da proteína ou da informação daquele transcrito AAA e aí, tem-se uma alteração no 1º nucleotídeo dessa trinca. Então modificou para UAA. UAA é um estoque códon; logo se tinha uma sequência polipeptídica em que entraria um lisina e que continuaria a produção da proteína, tem-se a codificação de um códon de parada e aí, a proteína para de ser produzida. Ou seja, ela fica menor do que ela seria, do que seria o normal dela.
Se, p.ex, tiver um códon de parada que é UGA e, nessa região que está produzindo um códon de parada UGA, acontecer uma mutação passando a ser UGG; onde deveria terminar a produção de uma proteína, ele continuou e colocou um triptofano que não deveria existir naquele local. Então, quando tem alteração da cadeia polipeptídica, tem-se uma mutação de ponto NÃO-sinônimas.
O que é diferente na mutação de ponto sinônima em que um códon, como ex, aqui na direta, o CUA. Ele sofreu uma mutação e, agora ele tem o códon CUG; essa alteração, tanto ser o A quanto ser o G produzem uma leucina. Logo, essa alteração não foi percebida para uma alteração de uma proteína. Outro exemplo é nesse códon UCU, quando sofre alguma mutação pode gerar UCC, que tbm codifica um serina como UCU. Essas mutações são conhecidas como mutações de ponto sinônimas ou silenciosas.
Regiões codificadoras
· Sinônimas (conservativas ou silenciosas):trocam a base, mas não o aa; em geral, 3a base do códon- As mutações podem acontecer nas regiões codificadoras; nesse caso, as regiões codificadoras são aquelas que estão produzindo proteínas que vão ser importante na determinação do fenótipo de um indivíduo. O que se observa é que, quando há uma troca que ocorre na 3ª base desse códon, essas mutações, em geral, não são pressentidas. Porque?
Se a gente voltar nesse código genético:
Quando a gnt observa a 3ª base presente em cada um desses códons, geralmente, estão alteradas; se a gente olhar na tirosina, na terceira coluna de códons, tanto o UAU quanto UAC produzem tirosina.
Na segunda coluna, UCU, UCC, UCA, UCG, produzem serina. Então uma mutação de ponto nessa 3ª base do códon não modificaria essa sequência de aa de uma proteína; porém quando se tem alteração na 1ª base isso já é mais comprometedor para a função da proteína.
Dessa forma, a gente tem que as mutações sinônimas ou silenciosas (tbm chamadas de conservativas) geralmente ocorrem na 3ª base do códon. Nesse caso, o que a gente observa é que a gnt tem a troca dessabase, porém a gnt não vai trocar o aa.
Existem alguns autores que fazem uma ressalva, no sentido de haver uma mutação em que se observa a troca da proteína; trocou-se um aa pelo outro, porém esses aa são quimicamente semelhantes. De uma maneira resultante tem uma proteína com uma conformação que não é significativamente diferente e, aí o fenótipo não é alterado de forma significativa; alguns deles coloca m tbm sobre essa capacidade conservativa de algumas mutações.
Regiões codificadoras
Em relação às regiões codificadoras, além das mutações silenciosas ou sinônimas, a gente encontra mutações que são não-silenciosas ou não-sinônimas.
· Não sinônimas (não-silenciosas): trocam a base e o aa- Nesse caso a gente tem a troca da base e, isso está associado a troca do aa. Com essa troca do aa, tem-se alteração da proteína formada, da conformação, modificando tbm a função da proteína e o fenótipo resultante.
o Com sentido trocado: troca a base e o aa; em geral, 1ª e 2ª bases do códon, afeta a função- Dentre essas mutações não-sinônimas, não-silenciosas, em que se tem a troca da base e do aa, a gnt vai classifica-las de algumas formas. Essa classificação
dessas mutações a gnt fala classificação quanto a expressão fenotípica. Portanto eles podem ser classificados, inicialmente, com sentido trocado. Nesse sentido trocado, tem a troca da base e do aa, por consequência. E, como eu falei para vocês, essa troca ocorre, geralmente, na 1ª ou 2ª base do códon, afetando a função dessa proteína.
Nesse ex, está mostrando o filamento selvagem (normal) em azul, produzindo um RNAm que, por sua vez, esse RNAm produz uma proteína NARMAL.
Quando se tem o DNA com uma substituição de nucleotídeo; tivemos uma alteração do que estava no azul CAC; no vermelho que é um DNA que está produzindo uma proteína alterada, tem a substituição do A do CAC por um C = CCC (logo, tem-se essa sequência marcada em azul).
Essa sequência vai gerar um códon= GGG que, vai produzir um aa que é a glicina.
Lá no filamento normal de DNA, tinha CAC produzindo GUG que, por sua vez, produz o aa valina (alteração da valina pela glicina, tem-se a proteína alterada).
Um ex. de mutação de ponto, em quem alteração de apenas uma base nucleotídica e, ai altera o aa sendo codificado e altera proteína, é a anemia falciforme; ela é caracterizada pela alteração de apenas uma base, comprometendo bastante o fenótipo do indivíduo.
Aqui mais um exemplo, em que nós temos uma alteração; uma mutação de ponto. Inicialmente, na esquerda, tem-se nesse DNA TCA, sequência de nucleotídeo, produzindo um complementar AGT que vai produzir um RNAm UCA. Esse RNAm produzido, esse UCA, codifica para serina.
Vamos observar aqui, nesse primeiro exemplo, a alteração desse segundo nucleotídeo. Eu falei com vcs que, tanto alterações no primeiro quanto no segundo nucleotídeo, são prováveis de produzir mutações que não são silenciosas, que chamamos de não sinônimas e, essa mutação que gerou uma fita molde AAT ela vai produzir um RNAm UUA. Esse RNAm UUA, se a gnt observar no código genético ele codifica para uma proteína leucina. Portanto, tem-se uma modificação da sequência de aa, onde eu tinha serina agora tem uma leucina. Dependendo da composição química da leucina, diferente da composição da serina, vamos ter uma conformação proteica diferente.
Logo, com essa conformação proteica diferente tem-se um fenótipo diferente para uma determinada característica daquela célula.
Ainda se pode ter alteração provida de uma mutação de ponto, em que essa região, esse 2º códon, foi alterado para TAA; no seu complementar gerou ATT e este gera um RNAm com o códon UAA. Acontece que, o códon UAA é finalizador; é um stop códon (códon de parada). Então se vocês observarem essa 3ª linha em que tem a cadeia polipeptídica, em roxo, vocês vão ver que a cadeia polipeptídica que deveria seguir, e que ela seria maior em que tem a continuação dela, ela finalizou. Então a proteína que deveria ser maior, muitas vezes o sítio de interação dessa proteína com seu receptor, continuaria a ser produzido aqui e eu tenho uma proteína, que muitas vezes, não é funcional. Esse é um tipo de mutação que a gente observa dentre as mutações não-sinônimas. E ainda, a gente pode ter uma mutação, aquelas que ocorrem no 3º nucleotídeo de um códon e, nesse caso, esse DNA AGC, que houve essa alteração de AGT para AGC, ele gerou um códon UCG; e esse códon UCG codifica para uma serina. Então, tanto o UCA do primeiro quadradinho quanto UCG do último quadrado geram serinas, por mais que ele esteja mutado, em uma mutação silenciosa.
Dentre as mutações sinônimas (do último quadradinho, tbm chamada de silenciosa).
Dentre as mutações não-sinônimas chamadas de sentido trocado, que é essa primeira, em que teve a troca do aa e tem tbm a classificação em mutação sem sentido- devido a mutação tem-se a geração de um códon de parada e, ai para o sentido dessa proteína nessa mutação sem sentido.
Mutações em sítios de splicing:
Pode haver inclusão de íntron- Pode-se ter ainda, mutações que acontecem em sítios de splicing, o que é um processo em que se tem, como se fosse uma lapidação de um fragmento de DNA, em que se tem éxons e íntros e, aí então, essa mutação faz com que possa haver a inclusão de um íntron em uma região em que deveria ter só éxons. Assim há codificação de uma proteína errada.
Aluno: polimorfismo seria uma adaptação?
Prof: Não. O polimorfimo é gerado mesmo de uma alteração, de uma mutação. O polimorfismo, muitas vezes permanece porque ele foi conveniente para a população e, aí sim seria uma adaptação. Mas muitas vezes, ele n e conveniente e permanece em grande parte da população.
Mutações em seqüências regulatórias (da transcrição e da tradução)
· Mutações de redução ou aumento da expressão gênica- Essas mutações podem acontecer tanto nesses sítios de splicing e tbm podem acontecer em algumas sequências: sequencias regulatórias. Logo vão regular tanto a transcrição do DNA em RNAm quanto na tradução (codificação de proteínas). Logo pode-se ter tanta alteração do splicing, pode ter alterações dos transcritos que são produzidos e alterações na ligação de RNA não codificantes. Com essas alterações dessa região regulatória, se eu tenho um sítio, uma sequência de DNA que é específica para receber um fator que esteja promovendo a transcrição ou que seja a ligação de um RNA que esteja ativando um determinado gene; se tem alteração dessa sequência regulatória pode-se ter uma redução ou um aumento da expressão daquele gene, porque aquela região que está relacionada a expressão. Portanto, muitas vezes, é muito perigoso; às vezes vc estuda o gene, avalia a sequência codificadora do DNA e aí não se observa nenhuma alteração que codifica para uma proteína. Aí você tem o exame genético do indivíduo, vc observa que ele n apresenta mutação, porém as proteínas não estão sendo produzidas. Muitas vezes a mutação é na região que regula a ativação ou inativação desse gene.
Deleções e inserções de bases: Essas mutações que falei até agr são relacionadas a substituição de bases. Outro tipo de mutação são as deleções e inserções (Indells) de bases.
As deleções são a retirada de uma ou mais bases, sendo que sua complementar tbm é retirada. Já a inserção é a adição de uma ou mais bases nessa sequência, gerando uma sequência mutante.
Consequências das inserções e deleções
· Deslocamento do módulo (janela) de leitura (frameshift mutation)- sabemos que para a produção de uma sequência polipeptídica; essa sequencia de aa vai ser produzida a partir de uma sequência de códons. Então, tem-se aqui trincas de bases nucleotídicas, que são chamadas de códons e, esses códons, cada um deles, gerando um aa.
Imagina nessa figura, nesse dna: vamos olhar o DNA normal nessa primeira linha; esse DNA normal é produzido a partir de uma sequência nucleotídica CAG CCC ACT = 03 códons produzindo essa sequência de aa.
Quando a gente tem uma inserção de apenas 01 nucleotídeo após o códon CAG; então a gnt teve a inserção desse T na 2ª linha, a gnt modificou TODOSos códons dali para frente. A inserção do T, fez com que tivesse deslocamento do que está presente dali para a frente, ou seja, o que era CCC agora é TCC. Consequentemente esse códon alterou tbm formando um CAC; ele conseguiu deslocar todas essas bases. Com isso, se vcs olharem na 2ª linha a sequência de aa produzida, ela é alterada a partir do primeiro aa.
Essas inserções, quando se tem a inserção de 01 nucleotídeo apenas, ele é mais perigoso, vai alterar mais de forma significativa essa proteína, do que quando a gente tem uma inserção de uma sequência trinucleotídicas ou com múltiplos de 3. Porque nesse caso, quando eu tenho a inserção
e uma sequência trinucleotidica, vou inserir apenas um aa a mais nessa proteína e, dali para frente continua essa janela de leitura. O que era o códon 2 passa a ser o códon 3; tem uma alteração menos significativa quando a gente tem a inserção de 03 nucleotídeos.
· Além do deslocamento do módulo de leitura, inserções em sítios de splicing e regiões regulatórias podem alterar completamente estes processos, da mesma forma que as mutações de ponto- além desse deslocamento, dessa janela de leitura, desses códons que estão codificando para os aa e produzindo a cadeia polipeptídica; tem tbm que quando essas inserções ocorrem sítios de splicing e tbm em regiões regulatórias desses genes do DNA, tem a capacidade alterar totalmente o processo de splicing e de regulação da expressão dos genes; isso tbm ocorre nas mutações de ponto. Por isso elas são, muitas vezes, descritas, na literatura cientifica: Quais são as mutações que se observa em maior número na parte da população e os locais que elas estão acontecendo. Além dos bancos de dados de sequências de genes com nucleotídeos que os compõe e que, por sua vez, estão associados a algumas proteínas, a gente tbm tem sequencia também desses polimorfismos. Essas mutações, geralmente acontecem de maneira espontânea, muitas vezes não são passadas e não permanecem na população; porém quando elas permanecem, se tornam um polimorfismo, elas podem ser descritas e aí, elas vão ser colocadas nesse banco de dados apenas de sequencias de alterações. Então tem alterações que são bem conhecidas e bem descritas (podem ser chamadas de Indells); a gente conhece tanto os tipos de alterações, quais são sequencias inseridas, deletadas e em quais regiões cada uma dessas mutações acontecem.
Expansões de DNA repetitivo em tandem- outo tipo de mutação.
· Grandes inserções e deleções- existem sequências maiores de DNA e DNAs repetitivos, que são inseridos ou deletados; essas deleções ou inserções vão ocorrer no momento do pareamento desses cromossomos.
1. Pareamentos errôneos durante a meiose- os cromossomos homólogos qnd se pareiam na meiose; qnd eu tenho sequencias repetitivas,DNA fica sem uma referência onde ele deve se ligar, por isso ele pareia de maneira errada.
1. “Escorregão” da polimerase- a polimerase na hora de produzir uma nova molécula, a gnt tem produção de uma molécula com uma mutação (escorregão da polimerase).
Expansões de DNA repetitivo em tandem
· Crossing over desigual- sequências que são repetitivas e ai ele fica sem referência onde ele deve se ligar; pareamento de forma incorreta. Por isso no crossing ele vai produzir produtos recombinantes diferentes.
A gente tem também o escorregão da polimerase, em que a polimerase q está colocando novos nucleotídeos, muitas vezes, ela escorrega e deixa de colocar nucleotídeos que são complementares a determinada região, que é repetitiva. Ela entende, essas regiões repetitivas e, uma delas ela deixa passar. Logo tem-se números de repetições diferentes em cada alelo que são formados.
Esse número de repetições diferentes são as ferramentas utilizadas em testes de paternidade e investigação criminal. Por isso é importante agente trabalhar com esse número de repetições diferentes, com a geração desses microssatélites.
 “Escorregão” da DNA polimerase (Replication Slippage)
Origem das mutações
· Espontâneas (endógenas)
· Erros de replicação- mutações podem ser geradas por erros de replicação, esses escorregões da polimerase
· Modificações químicas das bases- isso é natural, espontâneo, principalmente no processo de duplicação de DNA.
· Induzidas (exógenas: físicos e químicos) - essas mutações podem ser geradas de acordo com o meio, então são induzidas ou exógenas, produzidas por fatores químicos e físicos, tais como:
· radiações ionizantes: raios X, α,- comum falarmos que algumas frequências de raios x alfa e beta são capazes de gerar alterações no Dna com alteração na conformações desses ac nucleicos
· Radiações não-ionizantes
· Agentes químicos mutagênicos
Alguns exemplos dessas alterações que promovem uma quebra; quando se tem quebra da timina, essas repetições de timina promovem dobras na estrutura do DNA e essas dobras, por sua vez, vão alterar a conformação da estrutura helicoidal do DNA.
Sabemos que alguns radicais livres tem a capacidade de gerar dano do DNA com essas quebras e essas quebras de DNA; imagine que eu tenho uma quebra no meio de uma estrutura que codifica uma proteína; a proteína formada vai ter algumas alterações.
Taxa de mutação é diferente p cada tipo de gene. Elas são alteradas de acordo c o metabolismo; tanto vai depender do tamanho do gene, logicamente genes maiores são mais prováveis de sofrerem mutação devido a seu tamanho e suscetibilidade a mutação.
Tem tbm alteração de função celular;
Localização tbm se altera; as mutações podem acontecer tanto em éxons quanto em íntrons, bem bom em regiões entre os genes, regiões espaçadoras, regiões regulatórias.
Genes que tem essas duplicações, essas repetições, são mais propensos a produzir essas alterações no número de repetições, principalmente devido ao escorregão da polimerase e um pareamento desigual.
Consequências das mutações- podem gerar diferentes números de repetições e aí tem- se diferentes alelos formados. P ex., pode ter uma mutação que gerou um alelo que agora é dominante. Então tem-se diferentes fçs que será determinada para aquele alelo e o número de bases diferentes p cada um deles.
· Um único gene pode conter várias mutações-
· Diferentes indivíduos carregam diferentes “versões” deste gene => ALELOS
· Exemplo:
· Receptor do LDL
· Localizado no Cromossomo 19
· Gene com 44.000 pares de base- qnt maior o gene maior é a possibilida de mutações.
· Proteína de 860 aa
· + de 700 mutações catalogadas- por isso seria bom a gente conhecer alguma alteração, polimorfismos associados a uma determinada característica em indivíduos que tem o receptor de LDL alterado. Porém existem vários tipos de mutações associados a esse receptor que podem promover diferentes quadros, diferentes fenótipos.
· Mutação com ganho ou perda de função
· Aumento ou diminuição da produção da proteína- p. ex, se tiver um stop códon, então eu tenho redução do número dessa proteína.
Alteração da afinidade enzima/substrato- alteração no processo chave fechadura, logo alteração na conformação