Coupling of Downstream RNA PolymerasePromoter Interactions with Formation of Catalytically Compet

Prévia do material em texto

➔ 5º tópico dos resultados e 
figura 5
➔ 6º tópico dos resultados e 
figura 6
➔ Figura 7 da discussão
Estudo dirigido 2 - Expressão Gênica
Alunas: Camila Delaix, Isabella Bomfiglio, Laura Boose, Laura Hoefel
5º tópico: Efeito do DksA e do ppGpp na ligação entre a RNA polimerase e fragmentos do 
promotor
➔ O DksA faz parte de uma classe de reguladores de transcrição que são 
capazes de se ligar à RNA polimerase em seu canal secundário.
➔ Já o ppGpp também é capaz de se ligar à RNA polimerase, promovendo 
regulação gênica. Ele se liga entre as subunidades ꞵ’ e ⍵ no exterior da 
enzima.
➔ Ambos fazem o papel de regular a iniciação da transcrição em procariotos 
em resposta a sinais ambientais, como estresse.
Effect of DksA and ppGpp on RNAP binding to model promoter fragments
a) DksA/ppGpp aumentou a afinidade 
com upstream fork junction, mas diminui 
com downstream.
Figura 5 - Resultados
- Muito alta a afinidade (Kd<0.2nM) entre downstream fork junction a RNAP. 
- Colocaram um competidor que é similar, mas com uma substituição na posição -8 
(probe 36), que enfraqueceu a ligação ao RNAP.
Oligo é a parte de fita simples da fork junction, não é afetada por DksA/ppGpp. 
Então pode-se dizer que DksA/ppGpp consideravelmente enfraquece a 
interação RNAP com downstream complex. 
DksA/ppGpp claramente afetou a taxa de RNAP binding a downstream fork junction probe 35
Afinidade diminuída 
com downstream
Inibição da iniciação da transcrição de derivados N25cons por DksA e ppGpp
b) Dados de afinidade mostraram que 
o complexo downstream + 
DksA/ppGpp tem afinidade bastante 
diminuida (16x menor)
6º tópico: Inhibition of transcription initiation from N25cons derivatives by DksA 
and ppGpp
a) DksA/ppGpp não afetou a iniciação da 
transcrição em provas longas (+21 e +14) mas 
diminuiu bastante nas provas menores.
Figura 6 - Resultados
b) Promotores mais longos com GC se mostraram 
mais suscetíveis (ajudam na inibição). Os mais curtos 
quase não foram afetados. 
● DksA/ppGpp aumenta significativamente o 
comprimento mínimo requerido para iniciação de 
transcrição. 
● Consistente quando vê-se que DksA/ppGpp 
suprimiu interações downstream como visto em 5b.
Enfraquecimento das interações downstream → inibição da transcrição 
‐ O switch está localizado na base de B’ clamp e serve 
como uma dobradiça para abrir ou fechar o B’ clamp.
‐ B’ clamp mais fechado = maior eficiência de transcrição. 
‐ “Isso explicaria porque as fitas +6 tem maior atividade de 
iniciação de transcrição do que as +4, pois a extensão de 
DNA downstream induziria o fechamento correto de clamp 
e permitiria organizar o centro ativo para a catálise.”
Figura 7 - Discussão