AULA - FITOMETRIA

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FOTOMETRIA
Prof. Me Luis Alberto de Sousa 
‣ Determinações→ Baseadas em medições da
intensidade de energia radiante absorvida
ou transmitida sob condições controladas.
‣ O ESPECTROFOTÔMETRO → mede a energia
absorvida ou emitida é o
ESPECTROFOTÔMETRO.
‣ O setor de bioquímica representa dentro da
rotina do laboratório aproximadamente 50 –
60% do movimento em exames.
ESPECTROFOTÔMETRIA
• Determinações→ Baseadas em medições da intensidade de energia radiante absorvida
ou transmi5da sob condições controladas.
• O ESPECTROFOTÔMETRO → mede a energia absorvida ou emi5da é o 
ESPECTROFOTÔMETRO.
• O setor de bioquímica representa dentro da ro5na do laboratório aproximadamente 50 –
60% do movimento em exames.
ESPECTROFOTÔMETRIA
PADRÕES x CALIBRADORES :
• Soluções cujas concentrações de analitos são exatamente
conhecidas, destinando-se a atuar no ajuste (calibração) de um
sistema analítico.
- Monocalibradores (padrão primário): está presente em um único
analito.
- Multicalibradores (calibrador liofilizado): estão presentes na
mesma solução diversos analitos.
PADRÕES x CALIBRADORES :
• Padrões: soluções aquosas (são dissolvidos em água, álcool ou outros 
solventes) contendo quantidade exatamente conhecida de um analito, 
destinando-se à calibração de um sistema analítico manual ou semi-
automático. 
ex: Acompanham o kit.
• Calibradores: possuem matriz protéica (semelhante ao soro/plasma)
por isso são recomendados para automação.
-ex: de matriz proteíca: Calibrador 1 (multicalibrador)
O que são CONTROLES?
• Soluções com valores de analitos exatamente conhecidos, utlilizadas
para verificação de exatidão e precisão de uma metodologia analítica. 
Podem ser usados para verificar a linearidade da metodologia.
• Ex: Controle Normal
• Controle Patológico
FOTOMETRIA
• A fotometria é a metodologia analítica que utiliza-se da medição da
quantidade de luz monocromática absorvida ou transmitida por uma solução
aquosa, visando a determinação de um analito em uma determinada amostra.
• A concentração das soluções é proporcional à quantidade de luz absorvida.
‣Os equipamentos usados em fotometria são:
fotocolorímetro x espectrofotômetro
COMPONENTES BÁSICOS DA FOTOMETRIA
• Fonte de energia elétrica
• Fonte de energia radiante
• Lâmpada de Tunstênio – UV próximo e visível
• Lâmpada de Hidrogênio – região do UV
• Monocromador
• Porta Cubetas
• Quadradas
• Redondas
• Detectores: E° radiante transmitida em E° elétrica
• Circuito medidor: E° elétrica emitida e medido em A e/ou T
A - Fonte de REM : W , visível ; W-halogênio, UV ao IV; H ou Deutério, UV remoto
B - Colimador
C - Seleção de λ : Filtro – Fotocolorímetro ; Monocromador - Espectrofotometro
D - Cubeta
E - Célula Fotoelétrica
F - Amplificador
G - Registrador : Analógico ou digital 
FOTOCOLORÍMETRO ESPECTROFOTÔMETRO
1. Trabalha com luz
monocromática em
faixas de comprimento
de onda de luz visível.
- Utilizam como
monocromadores
os filtros.
Trabalha com luz 
monocromática em
comprimento de onda
definido, permitindo
leituras de absorbância
mais exatas, do u.v. ao
infra-vermelho.
Utilizam prisma, grade de 
difração ou filtro de 
interferência.
ESPECTRO UV / VISÍVELFOTOMETRIA
Na faixa de leitura entre 400 – 700 nm
ESPECTRO UV 
FOTOMETRIA
O espectro UV está dividido em 3 partes:
UVC (< 280nm)
UVB (280–320nm)
UVA (320–400nm).
FOTOMETRIA
UVA – Luz Negra – 320:400 nm
• Bronzeado;
• Formação da catarata;
UVB – Região do eritema – 280:320nm
• Região potencialmente carcinogênica;
• Protetores solares;
UVC – Bactericida e Germicida - < 280 nm
• Protegidos pela camada de ozônio;
• Lâmpadas de vidro bloqueiam completamente esses raios;
- Luz : radiação eletromagnética. Na luz visível, cada
cor corresponde a um comprimento de onda.
* Ultra Violeta (invisível): abaixo de 400 nm
* Violeta (visível): 350 – 430 nm Azul amarelado
* Azul (visível): 430 – 475 nm Amarelo
* Azul esverdeado (visível): 475 – 495nm Laranja
* Verde azulado (visível): 495 – 505 nm Vermelho
* Verde (visível): 505 – 555 nm Púrpura
* Amarelo esverdeado (visível): 555 – 575 nm Violeta
* Amarelo (visível): 575 – 600 nm Azul
* Laranja (visível): 600 – 650 nm Azul esverdeado
* Vermelho (visível): 650 – 700 nm Verde azulado
* Infravermelho (invisível): acima de 700 nm
OBS: para uma solução que absorve luz de uma determinada cor, a cor
observada dessa solução será sua cor complementar.
Ex: Glicose (método oxidase) cor desenvolvida é rosa forte. Filtro usado = 505 nm.
OU SEJA:
“Uma solução AZUL absorve o VERMELHO com maior
intensidade e portanto deve-se escolher a porção
vermelha para medida da solução azul”
OBJETIVO:
“Utilizar uma faixa no espectro na qual a E° radiante
seja absorvida ao máximo ou aproximadamente”
solução 10 g/l
Io IT1
solução 20 g/l
IT2Io
Feixe de luz de
intensidade Io
1 cm
Io IT1
Io IT3
3 cm
Feixe de luz de
intensidade Io
A absorção da luz 
é tanto maior 
quanto mais 
concentrada for 
a solução por ela 
atravessada 
A absorção da luz
é tanto maior
quanto maior for
a distância
percorrida pelo
feixe luminoso
através das
amostras
FOTOMETRIA
COMPONENTES BÁSICOS DA FOTOMETRIA
• ☺ Logo: Quando a E°radiante atravessa uma solução, a quantidade de E°
transmitida ↓ com:
• - ↑ espessura atravessada (LEI DE LAMBERT);
• - ↑ da concentração ou intensidade da cor da solução (LEI DE 
BEER);
• “LEI DE LAMBERT-BEER”
• A relação entre E emergente / E° incidente indica a transmitância da solução
TRANSMITÂNCIA
• Quando um raio incide sobre uma
solução colorida a intensidade de luz 
emergente (que sai = I) é menor que a 
luz incidente (I0) = parte da luz foi
absorvida
• T = I / I0
• Se I0 for 100% a I1 pode ser medida
como porcentagem de transmitância
• %T = TX100
ABSORBÂNCIA
Mede-se a intensidade de luz absorvida por uma solução colorida
pela redução da medida de intensidade de luz transmitida
A= quantidade de luz absorvida
T = fração da luz transmitida
A e T = inversamente proporcionais
A = -log %T/100
A = (log %T – log 100)
A = (log %T +2)
A = -log %T +2
A = 2 – log %T
*** A não é uma quantidade medida diretamente = calculada!!!
%T = Tx100
T = I1/I0
FOTOMETRIA
• Se a luz passa em uma solução onde não 
há absorção nenhuma, a absorvância será 
zero e a transmitância será 100.
• LEI DE BEER – a intensidade de um feixe de luz que atravessa uma
solução colorida, decresce exponencialmente à medida que a
espessura da cubeta ou a concentração da solução aumenta
arimeticamente.
It = Io . 10 – acd onde:
It = quantidade de luz transmitida
Io = quantidade de luz incidente
a = absortividade (própria de cada substância)
c = concentração (quanto mais molécula na solução, mais irá absorver)
d = espessura da cubeta
- Absorbância: quantidade de luz absorvida.
- Transmitância: quantidade de luz transmitida.
A
concentração
+ usado e + preciso
Linear = é diretamente proporcional
exponencial
Mantendo-se constante a espessura do meio que contém a solução em análise, a quantidade de luz monocromática absorvida é 
proporcional à sua concentração. 
A= a.c.d
Lei de Beer
A concentração de uma substancia é diretamente proporcional
à quantidade de luz absorvida e inversamente proporcional ao
logarítimico da luz transmitida
A = a x b x c
A = absorbância
a= absortividade (capacidade de absover)
b= percurso da luz em cm
c= concentração da substância em interesse
No laboratório = são lidas as absorbâncias da solução teste e da
solução padrão (conhecida) e aplicada....
Lei de Beer
No laboratório = são lidas as absorbâncias da solução teste e da 
solução padrão (conhecida) e aplicada....
Concentração do padrão (Cp) = Concentração do teste (Ct)
Abosrvância do padrão (AP) abosrvância do teste (AT)
Concentração do teste = CpXAt
AP
Aqui a espessura das cubetas é constante.
O teste e o padrão tem ser lidos em células iguais.
Luz incidente Io
Meio de contenção
Luz transmitida It
QUANTO MAIOR A ESPESSURA DO MEIO DE CONTENÇÃO, MENOR 
A QUANTIDADE DE LUZ TRANSMITIDA E VICE-VERSA.QUANTO MAIOR A ESPESSURA DO MEIO DE CONTENÇÃO, MENOR A 
QUANTIDADE DE LUZ TRANSMITIDA E VICE-VERSA.
- Esta lei é uma relação da
idéia matemática, que tem
algumas limitações na
prática, onde:
- A concentração do soluto
deve estar dentro dos
limites da linearidade, caso
contrário = dilui-se a
amostra.
-Essencialmente, esta lei
será seguida somente se a
radiação incidente for
monocromática, seleciona-
se um comprimento de
onda para leitura.
Linear até uma determinada 
concentração
A
concentração
sensibilidade
• OPERAÇÃO DE ZERAGEM
• Com o BRANCO no compartimento da amostra, a absorbância dada pelo
aparelho é ajustada para ZERO.
• Com isso, as interferências causadas pelos reagentes ficam, em tese, 
EXCLUÍDAS,
• Em seguida, faz-se a leitura da ABS da amostra verdadeira cuja intensidade
de cor é devida a substância a ser analisada.
REAÇÕES DE PONTO FINAL (luz visível)
• Reações em que forma-se (ou se consome) uma quantidade fixa de produtos
após tempo determinado de reação. 
• Ex: glicose, col, tri, prot, alb
• ANALITO + REAGENTES ⇒ produtos corados
• Condições controladas: 
- Proporção amostra / reagentes
- Tempo e temperatura de reação. 
• Cálculo:
[ANALITO] = 
_________________
Absorbância padrão
x Absorbância Teste 
- Note que na fórmula existe uma constante que se repete
em todos os cálculos, Concentração/Absorbância do padrão... 
chamada fator de calibração.
- Então multiplica-se o fator de calibração pela absorbância do teste e
obtém-se a concentração do teste.
Concentracao padrão
Glicose (mg/dL) = 
Padrão calibrador
glicose 100 mg/dL 
Absorbância padrão
x Absorbância Teste Concentracao padrão
Absorbância do Teste = 0,362 
Absorbância do Padrão = 0,340
Fator de Calibração= 100
0,340
= 294
Glicose (mg/dL) = 0,362 x 294 = 106
TESTE
REAÇÕES CINÉTICAS (luz U.V.)
Ex: TGO, TGP, FAL, GGT, CPK, LDH
• Existem casos em que a velocidade de consumo de substrato ou
formação de produtos é constante e não linear.
• Não se aplica o conceito de reação de ponto final.
• Determina-se a variação (delta) média minuto a minuto obtendo-se a
concentração do analito.
• Com reagentes bem formulados, controlados o comprimento de
onda, cubeta, volume de amostras e de reagentes, pode-se
estabelecer um FATOR CONSTANTE que dispensa o uso de calibradores.
- Fator cinético:
• Variando-se qualquer componente, o fator é alterado
automaticamente.
• O fator deve ser alterado quando:
1. O aparelho apresentar variações significativas.
- Os resultados de controles se mostrarem incompatíveis.
- Haverem alterações de volume de reagentes ou amostras.
ε = A /c.d, onde ε é absortividde molar e d é caminho 
ótico
Fator = 
1
x 1 x Amostra + Reagentes
Volume
Volume
amostrat
e . d
X 1000
INTERFERENTES:
• Reagentes expostos a luz direta, temperaturas altas, 
poeira, etc.
• Resíduos de detergentes.
• Vapores de ácidos ou álcalis (amônia).
QUALIDADE DA ÁGUA REAGENTE:
• Condutividade inferior a 0,5 µS/cm
• Lâmpada: acende a partir de 2 µS/cm
• A vida útil da coluna deionizadora varia de acordo com a
quantidade de impurezas presentes na água da rede e de
acordo com o tipo de equipamento (no caso de acordo com
a vazão-capacidade de deionização).
• A troca portanto deve ocorrer dentro do 
intervalo previsto anteriormente (em geral até 6-
10 horas de uso efetivo).
• As resinas com o passar do tempo acumulam 
microrganismos que podem contaminar o 
reagentes (por isso recomenda-se troca mensal 
mesmo que a condutividade seja aceitável).
Resultados e 
quadro clínico
são
compatíveis?
Há valores de 
referência?
Valores dos 
controles 
estão dentro 
do limite 
estabelecido?
Há 
linearidade 
do método?
Cálculos 
corretos?
‣ Calibração equipamento
‣ Limpeza do instrumento
‣ Qualidade dos reagentes
‣ Controle de qualidade do equipamento
‣ Manutenção de peças do equipamento
Problemas analítico
METODOLOGIA
REAÇÃO
ULTRAVIOLETACOLORIMÉTRICAPRECIPITAÇÃOAGLUTINAÇÃO
REAÇÃO
COLORIMÉTRICA
CINÉTICA DE 
DOIS PONTOS
CINÉTICA
TEMPO FIXO
CINÉTICA
CONTÍNUA
PONTO FINAL
REAÇÃO
ULTRVIOLETA
PRODUTO FORMADO
PROCEDIMENTO