Long Non-Coding RNAs the New Horizon of Gene Regulation in Ovarian Cancer

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Iael Weissberg Minutentag
Disciplina: Perfil Molecular do Câncer
Junho de 2019
Câncer de Ovário
Diagnóstico tardio 
5º em mortalidade nos EUA
Poucos Sintomas
Poucas Ferramentas de Diagnóstico precoce
O câncer de ovário é uma neoplasia ginecológica que causa morte em mulheres no mundo todo. O subtipo de câncer ovariano epitelial (EOC) representa quase 90% de todos os OC casos, contribuindo para 70% de todas as mortes causadas por CO, devido à ausência de Em 2016 o câncer de ovário teve nos EUA 22.000 novos casos e 14.000 mortes isso 
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RNAs longos não codificantes
Transcritos pela RNA polimerase II, <200 nucleotídeos
Não codificam proteínas
Localizados no núcleo e no citoplasma
Poucos classificados funcionalmente
Xie X, Tang B, Xiao Y-F, Xie R, Li B-S, Dong H, et al. Oncotarget . 2016;7(5):5226–39. 
Fang, S., Zhang, L., Guo, J., et al. (2017) NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucleic Acids Res.
HOTAIR
Os RNAs longos não codificantes atuam na regulação de processos biológicos, transcritos pela polimerase, podem ter de 200 a milhares de nucleotídeos com estruturas complexas e não são capazes de codificar proteínas. Os lncRNAs podem ser encontrados tanto no núcleo quanto no citoplasma, mais de metade do genoma humano é composto por RNAs longos não codificadores porém poucos foram classificados funcionalmente. 
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Mecanismo de ação
Adaptado de: Sana J, Faltejskova P, Svoboda M, Slaby O. J Transl Med 2012; 10(103) 
Diferentes de outros RNAs não codificadores como os microRNAs os lncRNA, são grandes e complexos, sua habilidade de alterar genes em particamente todas as fases do processo de transcrição nos mostra o quão grande é o seu potencial. lncRNAs são capazes de controlar a expressão gênenia atuando sobre a remodelação da cromatina, a transcrição, splicing e estabilidade pós-transcricional. Já foram mostrados 10 mecanismos de ação diferentes para os lncRNAs
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Adaptado de: Sana J, Faltejskova P, Svoboda M, Slaby O. J Transl Med 2012; 10(103) 
Inibir recrutamento da RNA polimerase II
Induzir remodelação da cromatina 
Bloquear o reconhecimento dos sítios de splice pelos spliciossomos 
Mecanismo de ação
Um lncRNA transcrito upstream do promotor afetar a expressão negativamente, inibindo o recrutamento da RNA polimerase II
ou positivamente induzindo remodelação da cromatina 
São capazes de hibridizar com os pré-mRNA e bloquear o reconhecimento dos sítios de splice pelos spliciossomos 
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Mecanismo de ação
Adaptado de: Sana J, Faltejskova P, Svoboda M, Slaby O. J Transl Med 2012; 10(103) 
A hibridização aos transcritos sense e antisense pode permitir que a Dicer gere siRNA endogenos
Ligar-se a miRNA gerando silenciamento funcional
A hibridização aos transcritos sense e antisense pode permitir que a Dicer gere siRNA endogenos
Os lncRNA podem se ligar a miRNA gerando silenciamento funcional, agindo como uma “esponja” de miRNAs
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Mecanismo de ação
Adaptado de: Sana J, Faltejskova P, Svoboda M, Slaby OO. J Transl Med 2012; 10(103) 
Formar complexos com proteínas modulando a atividade da proteína
 Estão envolvidos na estruturação e organização da célula 
Podem alterar a localização de proteínas nas células 
Influenciar em processos epigenéticos
Podem ser processados em RNAs pequenos não codificadores
Os lncRNA podem formar complexos com proteínas modulando a atividade da proteína
 Estão envolvidos na estruturação e organização da célula 
Podem alterar a localização de proteínas nas células 
Influenciar em processos epigenéticos
Podem ser processados para se torna RNAs pequenos não codificadores
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lncRNAs e Câncer
Adapatado de: Di Gesualdo F, Capaccioli S, Lulli M. Oncotarget . 2014;5(22). 
Os lncRNAs já foram observados afetando quase todos os hallmarks da carcinogênese e auxiliaram um melhor entendimento da biologia de diversos canceres incluindo o câncer de ovário. Estudos já descreveram que os lncRNAs tem envolvimento no prognóstico e relevância terapêutica no cancer de ovário
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 Variantes de lncRNAs associados com risco e funcionalidade do câncer de ovário
Multiplos SNPs identificados nos lncRNAs
 Relacionado com risco de desenvolvimento de câncer de ovário
Modular características das células cancerígenas
Risco de câncer de Ovário Epitelial
Sobrevivência Celular
Capacidade de Migração
Habilidades de invasão 
Variante A >T
(rs17427875)
 HOXA11-AS 
Além disso já foram observados SNPs nos lncRNAs capazes de alterar suas funções, e relacionados com o risco de desenvolvimento de câncer de ovário. Um exemplo é o HOXA11-AS, em um de seus éxon foi identificada uma variação onde uma adenina é substituída por uma timina, essa variante mais rara está ligada a diminuição do risco de câncer de ovário e células que apresentavam essa variação tinham menor sobrevivência celular e menor capacidade de migração e invasão.
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lncRNAs também foram observados em regiões de SCNAs
21,8% dos lncRNAs em regiões de SCNAs
FAL1 (Focally Amplified lncRNA on Chromosome 1)
Amplificado em tumores de ovário
Promove transformação maligna e proliferação celular
 Variantes de lncRNAs associados com risco e funcionalidade do câncer de ovário
Hu, X., Feng, Y., Zhang, D., Zhao, S. D., Hu, Z., Greshock, J., … Zhang, L. (2014). A Functional Genomic Approach Identifies FAL1 as an Oncogenic Long Noncoding RNA that Associates with BMI1 and Represses p21 Expression in Cancer. Cancer Cell, 26(3), 344–357. 
Expressão de p21
FAL1 + BMI1
Modificações na Cromatina
Outro fatores que também deve ser considerado são as regiões SCNAs (sommatic copy number alteration), cerca de 21,8% dos lncRNAs nessas regiões, um exemplo é o oncogene FAL1 é um long non-coding que está amplificado nas células tumorais e já foi associado com pior desfecho clínico. Ele se liga a proteína BMI1 do complexo policomb 1 aumentando estabilidade, o que leva a modificações na cromatina e supressão da expressão de genes supressores tumorais como p21, promovendo transformação maligna e proliferação celular
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 Outros lncRNAs no Câncer de Ovário
MALAT1
BC200 e GAS5
Migração
Proliferação
Invasão
Metástase
Wu DI, Wang T, Ren C, Liu L, Kong D, Jin X, Li X, Zhang G:. Oncol Lett 2016;11:1189- 1194. 
Li J, Huang H, Li Y, Li L, Hou W, You Z: Oncol Rep 2016;36:3241-3250. 
Migração
Proliferação
Invasão
Quimioresistência
MALAT1: A regulamentação positiva da MALAT1 promove a migração, proliferação, metástase, invasão e crescimento de células tumorais ovarianas in vivo. Down regalation de MALAT1 reverteu o comportamento agressivo das células OC, impedindo a progressão do ciclo celular em G0 / G1 levando a apoptose crescimento tumoral reprimido in vivo, suas vias de ação ainda não são conhecidas porém parece estar relaciona com MAPK
BC200 e GAS5: Expressão reduzidas desses long non-coding foi observada em tumores ovarianos e foi relacionada com aumento da migração, proliferação, invasão e resistência ao tratamento com carboplatina.
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lncRNAs como biomarcadores do câncer de ovário
Potenciais biomarcadores diagnósticos e de prognóstico
Expressão e metilação de HOTAIR (Prognóstico e diagnóstico)
Resistência ao Tratamento
Expressão de UCA1 ( Prognóstico)
 Menor Sobrevida, PFS e Resistência ao tratamento 
Expressão de C17or f91 (Prognóstico)
Menor Sobrevida e sobrevida livre de doença
Expressão de HOXA11as (Prognóstico)
 Menor Sobrevida e PFS
Os LncRNAs são considerados potenciais biomarcadores diagnósticos e de prognóstico devido aos seus padrões de expressão específicos de tecido e / ou célula. Seria vantajoso a elaboração de um painel de marcadores para obtençao de um resultado mais fidegno, O aumento de expresão desses quatro lncRNAs foi relacionado com pior prognóstico, resistencia ao tratamento e menor sobrevida livre de doença e livre de progressão, porém é importante resaltar que no momento de publicação do estudo não foram detectados lncRNAs nos fluídos corpóreos de pacientes de cancer ovário limitando sua utilização como biomarcadores diagnósticos.
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lncRNA como alvosterapêuticos
Adaptado de : Leone S, Santoro R. Challenges in the analysis of long noncoding RNA functionality. FEBS Lett. 2016;590:2342–53.
Inhibition of chromatin-associated lncRNAs 
EZH2
X
Redution of Chromatin remodeling
Alguns estudo funcionais utilizando CRISPR para alterar a expressão de lncRNAs foram realizados em linhagens celulares humanas, um dos lncRNAs testados foi o UCA1 cuja inibição foi capaz de enfraquecer células de câncer de bexiga. Outro possível alvo pra o CRISPR são SNPs dentro do lncRNAs como no HOXA11-AS, gerando knockouts dos alelos ligados a fenótipos mais agressivos, porém essa técnica é limitada a apenas alguns lncRNAs, pois existe a possibilidade de alterar os padrões de expressão de genes vizinhos criando risco a outras doenças.
Outra abordagens é a regulação de alvos dos lncRNAs como a EZH2, que junto com o FAL1 atua na remodelação da cromatina e silenciamento gênico, a inibição do complexo policomb 2 leva a redução da remodelação de cromatina e desilenciamento de genes, porém é possível que outros genes alpme dos desejados sejam afetados. 
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Conclusões
Atuam de diferentes formas na regulação gênica
Altamente tecido específicos
Necessária maior caracterização funcional e de vias 
Como pudemos observar os lncRNAs atuam em diferentes frentes da regulação da expressão gênica diversos fatores tornam os lncRNAs atrativos para o desenvolvimento de terapias ou como biomarcadores, como sua alta especificidade tecidual e habilidade de interagir com transcritos não codificadores como os miRNAs, porém ainda é necessária uma maior caracterização funcional e de vias para que os lncRNAs sejam incorporados em futuras terapias 
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