Análise de espermatozoides assistida por computador de citometria de fluxo

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Uso de análise espermática assistida por 
computador e citometria de fluxo para 
detectar variações sazonais da qualidade do 
sêmen bovino
Universidade Federal Rural do Semi-Árido
Disciplina: Fisiopatologia da Reprodução
Docente: Alexandre Rodrigues Silva
Discentes: Ednardo Bastos Alexandre
 Thaynara Ferreira Reginaldo
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Objetivo
 Investigar o efeito da estação do ano sobre os parâmetros funcionais do 
sêmen bovino congelado-descongelados, por meio da análise espermática 
assistida por computador e citometria de fluxo. 
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Introdução
● As variações sazonais da qualidade do sêmen 
bovino há muito perturbam os pesquisadores de 
centros de reprodução;
● Variações das características do sêmen entre os 
meses de verão e inverno;
● Mudanças sazonais no perfil endócrino e resposta 
dos testículos às gonadotrofinas;
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● Hipótese de alterações da qualidade do sêmen em bovinos 
relacionadas à estação do ano;
● Critérios de qualificação para criopreservação de ejaculados em 
estações de inseminação artificial;
● Abordagem multiparamétrica da qualidade do sêmen é 
recomendada; 
● A análise de espermatozoides assistida por computador (CASA) e 
citometria de fluxo.
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Análise espermática assistida por computador (CASA)
 Sistema automático com hardware e software que permite a avaliação exata e 
objetiva da motilidade, fornece informações precisas e significativas da cinética da 
célula espermática, determina a porcentagem de células móveis na amostra e 
quantifica características específicas do movimento espermático.
 
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ARRUDA (2011).Fonte: 
https://www.indoreinfertilityclinic.com/male-infertility-test/casa-
computerized-semen-analysis-test/
 
 As células espermáticas são classificadas quanto ao seu 
movimento em: 
-Móvel não progressivo, 
-Linear lento
-Linear rápido 
-Imóvel
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Fonte:https://www.indoreinfertilityclinic.com/male-infertility-test/casa-compute
rized-semen-analysis-test/
Citometria de fluxo
 Citometria de fluxo é uma tecnologia capaz de analisar simultaneamente 
diversos parâmetros de células ou partículas em suspensão. 
-Membrana plasmática;
-Acrossoma e integridade do DNA;
-Potencial de membrana mitocondrial;
-Níveis intracelular de cálcio;
-Indutibilidade de reação acrossômica.
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Materiais e Métodos
● Animais e coleta de sêmen;
● Manuseio e processamento;
● Análise laboratorial;
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Animais e coleta de sêmen
● Cinco touros Holstein-Friesian maduros;
● Durante o inverno e verão;
● Foram expostos ao fotoperíodo natural e às condições climáticas da área, 
e alimentados com a mesma ração;
● Ejaculavam duas vezes por semana em um tubo descartável conectado a 
uma vagina artificial pré-aquecida (38°C);
● No total, 86 ejaculados foram coletados.
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Avaliação:
● Volume de ejaculação (ml);
● Concentração espermática;
● Motilidade total (%) 
- Concentração espermática > 650 milhões/ ml e motilidade total >70% 
 - Concentração final de 60 milhões espermatozóides/ ml 
- Sémen embalado em palhetas de 0,25 ml, resfriado a -95°C por 10 min e congelado em N 
líquido (-196°C).
 
Manuseio e processamento do sêmen
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● Preparação do sêmen congelado antes da análise:
- Quatro canudos de cada ejaculado foram descongelados;
-Agrupados em um tubo de laboratório pré-aquecido (37°C).
● Avaliação da motilidade espermática com CASA:
- Motilidade total (%)
- Motilidade progressiva (%)
- Velocidade de trajeto (VAP, µm/s );
- Velocidade curvilínea (VCL, µm/s);
- Velocidade progressiva (VSL, µm/s);
- Amplitude do deslocamento lateral da cabeça (ALH, µm). 
Análise laboratorial do sêmen
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Fonte: Malala, E. et al. Use of computer-assisted sperm analysis and flow cytometry to detect seasonal variations of bovine 
semen quality. Theriogenology, Israel, v. 87, p.79-90, 2017. 
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● Análise de citometria de fluxo:
01 02 03 04
Produtos químicos 
e reagentes
Instrumentos e 
configurações
Membrana plasmática 
e integridade 
acrossomal
Taxa de sobrevivência 
do esperma em 
condições hipotônicas
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05 06 07 08
Indutibilidade da 
reação 
acrossômica
Potencial de 
membrana 
mitocondrial (MMP)
Níveis de cálcio 
intracelular
Ensaio da estrutura da 
cromatina do esperma
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Resultados
● Comparação dos ejaculados coletados no verão e no 
inverno.
● As amostras de sêmen coletadas no inverno apresentaram 
maiores valores de PMAI, HMMP e LOW-Ca2+ 
● Os valores gerais de IAR foram maiores no inverno vs. verão. 
● Os valores de HYPO-SURV não foram afetados pela estação 
do ano. 
● Os valores de DFI% não diferiram entre os espermatozóides 
de verão e inverno nem às 0h nem às 3h;
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Fonte: Malala, E. et al. Use of computer-assisted sperm analysis and flow cytometry to detect seasonal variations of bovine 
semen quality. Theriogenology, Israel, v. 87, p.79-90, 2017. 
 
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Fonte: Malala, E. et al. Use of computer-assisted sperm analysis and flow cytometry to detect seasonal variations of bovine 
semen quality. Theriogenology, Israel, v. 87, p.79-90, 2017. 
Discussão 
● Características de motilidade pós-colheita;
● Desenvolvimento e a manutenção da motilidade dos 
espermatozóides;
● Pilares da análise laboratorial: motilidade espermática, 
avaliação da membrana plasmática e a integridade da 
membrana;
● O colesterol presente no plasma seminal inibe indução de 
Reação Acrossomal mediada por progesterona;
● Alterações na composição lipídica da membrana plasmática.
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Conclusão
● Detecção de mudanças sazonais no estado funcional dos espermatozóides congelados.
● Relação entre a estação de coleta de sêmen e a capacidade dos espermatozoides de manter sua 
funcionalidade após a criopreservação. 
● Influência da temperatura nos ejaculados 
● Discrepâncias individuais 
● Relação entre o estado funcional de organelas espermáticas individuais e as condições 
climáticas sazonais.
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Referências
Bergstein, T.G.; Weiss, R.R.; Bicudo, S.D. Técnicas de análise de sêmen. Rev. Bras. Reprod. 
Anim., Belo Horizonte, v.38, n.4, p.189-194, out./dez. 2014. Disponível 
em:<http://www.cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/v38n4/pag189-194%20(RB513).pdf> . 
Acesso em: 17.04.21 
Instituto de ciências biomédicas. Serviço de citometria. Departamento de imunologia da 
Universidade de São Paulo. São Paulo, 2014. Disponível 
em:<http://www.icb.usp.br/~imunoicb/?page_id=295>. Acesso em: 17.04.21
Malala, E. et al. Use of computer-assisted sperm analysis and flow cytometry to detect 
seasonal variations of bovine semen quality. Theriogenology, Israel, v. 87, p.79-90, 2017. 
Matos, D. L. et al. Análise computadorizada de espermatozóides: revisão de literatura. Rev. 
Bras. Reprod. Anim, Belo Horizonte, v.32, n.4, p.225-232, out./dez. 2008. Disponível 
em:<http://cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/download/RB176%20Matos%20p225.pdf>. 
Acesso em: 19.04.21
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http://www.cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/v38n4/pag189-194%20(RB513).pdf
http://www.icb.usp.br/~imunoicb/?page_id=295
http://cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/download/RB176%20Matos%20p225.pdf