Estratégias de clonagem

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Estratégias de clonagem 
O que é clonagem? 
Inserção de um fragmento de DNA em um vetor 
(molécula de DNA) para produzir uma molécula de 
DNA recombinante 
O processo não é totalmente in vitro, é preciso usar 
uma célula hospedeira como fonte multiplicadora 
Cada vetor carrega apenas um fragmento de DNA 
 
 
VETORES 
Moléculas de DNA que precisam ser facilmente 
manipuláveis 
Características: replicação autônoma, presença de 
sítios de clonagem múltipla e presença de marca de 
seleção 
 
 Quanto menor o vetor mais fácil de clonar 
• Plasmídeos não integrativos 
• Epissomais 
 
Mecanismos de disseminação de plasmídeos 
• Através dos pilus pode ocorrer transferências 
de plasmídeos entre bactérias 
Marca de seleção 
• É usada para diferenciar as bactérias que 
receberam o plasmídeo das que não 
receberam 
• Se inserem um produto de resistência a 
antibiótico 
 
MECANISMOS DE CLONAGEM 
POR ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
Enzimas nucleases fazem a clivagem dos plasmídeos 
• Exonucleases: removem nucleotídeos a partir 
de uma extremidade de DNA 
• Endonucleases: quebram a ligação 
fosfodiester em uma região interna do DNA. 
Banco de dados: REBASE 
Tipos de extremidades 
• Coesivas: com extremidades (facilitam o 
processo porque existe uma 
complementariedade) 
• Cegas: sem extremidades 
Linkers: alteram a extremidade de uma mólecula 
cega, unindo-se a essas extremidades pela ação de 
uma ligase. BamH1 forma a extremidade coesiva 
Adaptadores: alteram a extremidade de uma 
molécula coesiva. 
Seleção 
Seleção por alfa-complementação: seleção de 
colônias azul e brancas 
É baseada na presença da região lacZ, que está sobre 
controle do promotor lac. Na presença de IPTG e do 
substrato da enzima ocorre a formação do pigmento 
azul. 
 As bactérias não possuem a enzima 
completa, por isso não deixam a colônia 
azul 
 O plasmídeo possui a complementação da 
enzima 
Serve para diferenciar as células com o plasmídeo de 
interesse das com plasmídeo incompleto 
Seleção auxotrófica 
É inserido uma leucina funcional no vetor, então as 
células que contem a região funcional ela consegue 
sobreviver em um meio sem leucina. 
 
PCR para obtenção dos clones do gene de 
interesse 
PCR 
1) Desnaturação: separação da dupla fita 
2) Anelamento com primers (complementares a 
região codificadora do gene de interesse) que 
ajuda a enzima (DNA polimerase) a começar a 
extensão 
3) Extensão: adição de nucleotídeos (5´→3´) → 
síntese do novo DNA 
Pontos a considerar: 
• Fidelidade de extensão das enzimas: 
considerar as taxas de erro de incorporação 
das enzimas 
• Tipo de extremidade gerada: sticky-ends, 
blunt-ends 
• Vetores adequados para clonagem 
Como confirmar que a sequência do gene amplificado 
está correta? Sequenciamento 
 
 
Estratégia geral 
1) Obtenção do produto de PCR e purificação: 
polimento das extremidades se necessário 
2)Digestão do vetor com enzima de restrição: 
desfosforilação das extremidades do vetor para evitar 
a ligação do vetor vazio 
3) Ligação fragmento +vetor 
Ligação: extremidades cegas 
• Vetor desfosforilada, apenas o gene 
de interesse contem o fosfato 
necessário para ligação 
Ligação: extremidades coesivas 
• A região de sobreposição já permite 
um alinhamento entre as sequencias 
 
Projeção de primers que incluem um sítio de 
restrição: É possível adicionar no primer a sequência 
(região 5´) reconhecida pela enzima de restrição 
durante a amplificação por PCR 
OBS: é preciso adicionar uma sequencia maior que a 
reconhecida pela enzima para prevenir a degradação 
dessa sequencia 
Taq DNA polimerase 
Geração de extremidades protundentes (A) 
 
→ tratamento com enzimas para polimento (se 
necessário): T4 DNA polimerase, adição de fosfato 
(T4 PNK) 
Obs: Pfu e Pfx não adicionam A na extremidade 3´ 
 
 
CLONAGEM TA 
Vetor que contem um T nas extremidades que 
proporcionam o pareamento T-A 
A taq polimerase é utilizada como enzima para 
amplificação 
TA tradicional: 
1) Obtenção do produto de PCR 
2) Hibridização TA 
3) Ligação 
MECANISMOS DE CLONAGEM BASEADOS 
EM RECOMBINAÇÃO 
TA recombinação (tipo Topo) 
Baseada nas topoisomerases 
Vetores Topo: a região de sítio de clonagem múltipla 
vem com uma topoisomerase covalentemente ligada 
ao DNA plasmidial. Em uma determinada temperatura 
a topoisomerase entra em ação e é capaz de quebrar 
o DNA, inserir o produto de PCR e ligar o DNA sem 
ação das ligases 
 
 
SISTEMA GATEWAY 
Vetores Gateway: presença dos sítios de 
recombinação 
Enzimas: BP clonasse e LR clonasse 
Acontece uma recombinação entre B1→ P1 B2 → P2 
Para transferir o gene para um vetor de destino é 
preciso fazer outra recombinação 
 
Desvantagens: caro, depende de um vetor específico 
 
RECOMBINASES PROPRIETÁRIAS 
Infusion 
Vantagens: pode ser usado qualquer vetor 
 
Amplificamos o gene de interesse por PCR 
adicionando os primers específicos para regiões 
complementares ao vetor 
A enzima infusion é capaz de reconhecer a 
complementariedade das sequencias e fazer a 
recombinação entre eles 
 
CLONAGEM POR RECOMBINAÇÃO IN VIVO 
A clonagem é feita dentro das células da bactéria 
Bactérias competentes: E. Coli KC8, porque ela 
contem várias enzimas recombinases 
Utiliza-se um vetor linearizada com um inserto 
complementares e a própria bactéria faz a ligação dos 
fragmentos 
Vantagem: mais barata porque não precisa comprar 
enzimas 
 
Saccharomyces cerevisiae: 
 
 
GIBSON ASSEMBLY 
União de mais de um fragmento 
1) Vetor linearizado + 2 fragmentos com uma 
região de sobreposição entre si 
2) Incubação: 5´exonuclease + Dna polimerase + 
DNA ligase 
5´exonuclease: retirada de nucleotídeos no 
sentido 5´→ 3´ formando duas regiões 
complementares mas com buracos 
DNA polimerase: fecha os buracos 
incorporando os nucleotídeos que faltam 
DNA ligase: Liga os fragmentos por ligação 
fosfodiester 
3) Transformação