LISTA DE EXERCÍCIO BIOLOGIA MOLECULAR

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Faculdade Integral Diferencial - UNIFACID
Curso Bacharelado em Farmácia
Alunos: Renya Kinany de Almeida Batista, 2019511168887; Janilson Andrade Silva,
201951115511.
Disciplina: Biologia Molecular
Professora: Eliamara Sabino
Lista de exercício – Biologia Molecular
1. Antes da estrutura ser revelada, os cientistas já conheciam algumas informações a
respeito do DNA. Cite as 3 principais propriedades do DNA.
Armazenar e transmitir as informações genéticas.
Funcionar como molde para a síntese da molécula de RNA.
2. Descreva a estrutura do DNA e seus componentes.
O DNA é formado por duas cadeias de polinucleotídeos (fita), que são constituídas por
vários nucleotídeos. Os nucleotídeos são unidos uns aos outros por ligações denominadas
fosfodiéster (grupo fosfato ligando dois açúcares de dois nucleotídeos). Nessas ligações,
um grupo fosfato conecta o carbono 3’ de um açúcar ao carbono 5’ do próximo açúcar. Essa
junção dos nucleotídeos forma um padrão típico de repetição de unidade de açúcar-fosfato,
que forma a cadeia principal. A essa cadeia principal estão ligadas as bases nitrogenadas.
As duas cadeias de polinucleotídios do DNA formam uma dupla-hélice. As cadeias
principais estão localizadas na porção externa da hélice, já no interior são observadas as
bases nitrogenadas que estão unidas por ligações de hidrogênio. As cadeias principais
apresentam as direções 5’ → 3’ opostas, ou seja, uma cadeia está no sentido 5' → 3’, e a
outra, no sentido 3' → 5’. Em razão dessa característica, dizemos que as fitas são
antiparalelas.
3. De acordo com a pentose abaixo, poderíamos afirmar que a estrutura formada com
fosfato e bases nitrogenadas darão origem a uma molécula de DNA?
4. Explique o que é e como é formada a ligação fosfodiéster?
A ligação fosfodiéster une dois nucleotídeos. Em um nucleotídeo o carbono 5' do radical
desoxiribosil está ligado ao átomo de fósforo através de um átomo de oxigênio, ou seja, por
meio de uma ligação fosfo-éster. Quando um segundo nucleotídeo se une ao primeiro,
ocorre a formação de uma segunda ligação fosfo-éster. Essa ligação ocorre entre o fósforo
do grupo fosfato e o oxigênio associado ao carbono 3' do segundo nucleotídeo. Portanto, a
união de dois nucleotídeos em uma mesma cadeia de DNA resulta na formação de uma
ligação fosfodiéster. A ligação fosfodiéster é assimétrica, visto que o oxigênio 5' do grupo
fosfato está ligado ao C5' do radical desoxiribosil do desoxiguanilato, enquanto o oxigênio 3'
do fosfato está ligado ao C3' do radical desoxiribosil do desoxitimidilato.
5. Explique o processo de compactação da molécula de DNA no cromossomo.
Passa pelo nível dos nucleossomos, do solenoide até o nível das alças. O nível superior
corresponde a um cromossomo metafásico altamente condensado em uma célula em
divisão. Cada cromossomo é formado por uma única molécula de DNA dupla hélice
enrolada nas histonas, o nucleossomo. Esta fibra torna a enrolar-se em um segundo nível
de compactação, conhecido como solenóide. As células mantém, na maior parte do tempo,
o DNA compactado nas alças dos selenóides ligadas ao esqueleto cromossômico.
6. De acordo com a estrutura de procariotos. O que são plasmídeos e quais suas
funções?
Os plasmídeos (ou plasmídios) são moléculas extracromossômicas circulares de DNA
bacteriano. Essas moléculas destacam-se por sua capacidade de duplicação independente,
ou seja, são capazes de se replicar independentemente do DNA cromossomal.
7. Cite as 4 regras básicas da replicação.
A replicação inicia-se nas origens de replicação, quesão sequências específicas muito ricas
em pares A=T: Procariontes (bactérias) –1origem de replicação; Eucariontes –múltiplas
origens de replicaçãolocalizadas ao longo do cromossomo; Em bactériasDNA circular “mais
curto”; Eucariotos DNA não circular e extenso cromossomos. Processo semiconservativo.
Início da replicação: Origem.
8. De acordo com experimento realizado por Meselson e Sthal, qual das estruturas
abaixo representa o processo de replicação? Explique o processo pelo qual os
cientistas desvendaram este enigma.
9. Relacione as respectivas proteínas e enzimas envolvidas no processo de
replicação, com sua respectiva função.
No processo de replicação do DNA várias enzimas estão envolvidas, como a
DNA-polimerase, helicases, proteínas SSB, ligases, topoisomerases e primase. As
helicases são enzimas com função de quebrar as pontes de hidrogênio entre as bases, para
que as duas fitas de DNA se separem. Essa separação é essencial para que a forquilha de
replicação se movimente. As SSB são proteínas que têm alta afinidade por DNA na forma
de fita simples, ocorrendo a ligação de forma cooperativa. Sua presença no processo de
replicação é de grande importância, pois ao se ligarem a fita simples do DNA, impedem que
a mesma sofra torções, induzindo a conformação do DNA ideal para o pareamento das
bases e consequentemente, a replicação. A primase é a enzima que sintetiza os primers
(iniciadores), que são pequenas sequências de RNA, a partir de um molde de DNA. Em
eucariotos, a atividade da primase está localizada como componente da DNA-polimerase. A
DNA-polimerase é a enzima que faz a síntese de uma nova fita de DNA. Ela possui a
capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3’OH de uma região pareada do
DNA, fazendo com que a cadeia se estenda no sentido 5’→3’. As células eucarióticas
apresentam vários tipos de DNA-polimerases como: α, δ, β, ε, e , sendo que α, δ, β e ε
estão localizadas no núcleo, e está localizada na mitocôndria. A polimerase δ é responsável
pela replicação do genoma nuclear, enquanto a polimerase α está envolvida na síntese do
primer para o início da replicação e na formação dos Fragmentos de Okazaki. As
polimerases β e ε participam dos processos de síntese durante a reparação do DNA. E a
polimerase é responsável pela replicação de DNA mitocondrial. Em bactérias existem três
tipos de polimerases: DNA polimerase I, DNA polimerase II e a DNA polimerase III. A DNA
polimerase I, possui baixa capacidade de polimerização 5’→3’ e é a única que possui
atividade exonucleásica 5’→3’em DNA dupla fita. A DNA polimerase II, possui uma
capacidade de polimerização baixíssima e o seu papel na célula ainda não foi muito bem
elucidado. Já a DNA polimerase III, é a principal responsável pela síntese das fitas de DNA
devido a sua alta capacidade de polimerização. Após a síntese do primer de RNA, a DNA
polimerase III pode começar a polimerização no sentido 5’→ 3’. Além da polimerização, a
DNA polimerase III possui atividade exonucleásica 3’→5’, essa atividade permite que logo
após serem adicionados, os nucleotídeos sejam retirados e é conferido se o seu
pareamento está correto (A com T e C com G). A replicação em procariotos segue o mesmo
padrão que em eucariotos, a maior das diferenças está nas enzimas polimerases que são
cinco nos eucariotos, sendo uma exclusivamente mitocondrial e as outras quatro nucleares,
enquanto que os procariotos apresentam três enzimas polimerases.
10. Explique o processo e o sentido da replicação na fita contínua e descontínua.
A replicação do DNA é o processo de duplicação da molécula de DNA. Nele ocorre a
separação das duas cadeias de nucleotídeos e a formação de cadeias complementares. A
replicação ocorre antes da divisão celular, durante a interfase. O processo de replicação
inicia-se com a separação das duas fitas que formam a molécula de DNA. Em seguida,
ocorre a ligação dos nucleotídeos livres no núcleo a um nucleotídeo correspondente em
uma das fitas. Tem-se agora duas moléculas de DNA, constituídas por uma fita antiga,
pertencente à molécula original, e uma fita nova. Esse
processo é considerado, assim, semiconservativo. A replicação do DNA ou duplicação do
DNA é um processo de grande importância para a transmissão do material genético, pois,
quando ocorre a divisão celular, esse material será dividido de forma igual entre as
células-filhas. A replicação ocorre antes do início da divisão celular, durante a fase S da
interfase. Na replicação, a molécula de DNA será duplicada. As duasmoléculas formadas
serão constituídas por uma fita que pertencia à molécula original e uma fita recentemente
sintetizada. Pelo fato de as novas moléculas serem constituídas por uma fita “antiga” e uma
“nova”, esse processo é denominado semiconservativo. O processo de replicação é
mediado por ação de algumas enzimas, como a helicase, responsável por desenrolar a
hélice de DNA e separar as cadeias de nucleotídeos.
11. Explique o processo de alongamento cromossômico gerado pela enzima
telomerase.
O a longamento é a fase que a sequência de RNA fica mais longa, graças à adição de
novos nucleotídeos. Durante o alongamento, a RNA polimerase “caminha” ao longo de uma
fita de DNA, conhecida como fita molde, da 3’ para 5’. Para cada nucleotídeo no molde, a
RNA polimerase adiciona um nucleotídeo de RNA correspondente, complementar, à
extremidade 3’ da fita do RNA. O transcrito de RNA é quase idêntico à fita de DNA não
molde ou codificante. Contudo, as fitas de RNA têm a base uracila (U) em vez de timina (T),
assim como um açúcar ligeiramente diferente no nucleótido. Assim, como podemos ver no
diagrama acima, cada T da fita codificante é substituído por um U no transcrito de RNA.
12. Explique o processo de transcrição no modelo eucarioto e procarioto. O que
difere entre estes modelos?
Em eucariotos, a transcrição acontece no núcleo para depois ser sintetizada a proteína pela
tradução no citoplasma. Já em procariotos, não existe núcleo. Os dois processos ocorrem
no mesmo meio. O RNA transcrito em eucariotos passa por uma série de alterações antes
de serem completamente formados.
13. Explique o processamento e splicing de pré-RNAm.
No splicing do RNA, partes específicas do pré-RNAm, chamadas íntrons são reconhecidas
e removidas por complexos proteína-e-RNA chamados de spliceossomos. Os íntrons
podem ser vistos como sequências "lixo" que devem ser retiradas para que a "versão de
partes boas" da molécula de RNA possa ser montada. Um ponto-chave aqui é que são
somente os éxons de um gene que codificam uma proteína. Não só os íntrons não
carregam informações para construir uma proteína, como eles realmente têm que ser
removidos para que o mRNA codifique uma proteína com a sequência certa. Se o
spliceossomo falha ao remover um íntron, um mRNA com "lixo" extra será feito, e uma
proteína errada vai ser produzida durante a tradução.
14. Como o RNam maduro é exportado da região nuclear para região citosólica?
Explique o processo.
15. Explique os termos abaixo:
a. “O código genético é degenerado”. Exemplifique.
Diz-se que o código genético é degenerado ou redundante por existirem vários codões que
codificam o mesmo aminoácido. Por exemplo, os codões UCU, UCC,UCA e UCG codificam
todos o aminoácido Serina (Ser).
b. “códon usage”
Viés de uso de códon refere-se a diferenças na frequência de ocorrência de códons
sinônimos na codificação de DNA. Um códon é uma série de três nucleotídeos que codifica
um aminoácido resíduo específico em uma cadeia de polipeptídeo ou para a terminação de
translação.
c. “Sequências Shine-Dalgarno”:
A sequência de Shine-Dalgarno é uma sequência do RNA mensageiro de bactérias e
arqueas localizado a cerca de 8 bases a montante do códon de início AUG. Essa sequência
de RNA ajuda a recrutar o ribossomo ao RNA mensageiro para iniciar a síntese de
proteínas, alinhando o ribossomo com o códon de início.
16. Explique as etapas da tradução: iniciação, alongamento e terminação.
A tradução envolve "decodificar" um RNA mensageiro (RNAm) e usar sua informação para
produzir um polipeptídeo ou cadeia de aminoácidos. No geral, polipeptídeo é basicamente
uma proteína (com a diferença técnica que algumas proteínas grandes são formadas por
muitas cadeias de polipeptídeos. Iniciação ("começo"): nesta etapa, o ribossomo se junta ao
RNAm e ao primeiro RNAt para que a tradução possa ter início. Alongamento ("meio"):
nesta etapa, os aminoácidos são trazidos ao ribossomo pelos RNAt e são ligados entre si
para formar uma cadeia. Terminação ("fim"): na última etapa, o polipeptídeo final é liberado
para que possa cumprir sua função na célula.
17. A sequência do DNA dita as proteínas que estão contidas no organismo. Diante
disso mostre a sequência de nucleotídeo gerada pela caída de DNA Abaixo:
DNA 3’ TACTCGTTCGCTAAUCGTAC 5’
15. O que são regiões promotoras? Qual a diferença da regulação gênica em
procariotos e eucariotos.
É uma região do DNA que inicia a transcrição de um determinado gene. Os promotores
estão localizados perto do sítio de início da transcrição de genes, na mesma fita e a
montante no DNA (para 5' da fita código). Os promotores podem ter por volta de 100-1000
pares de bases de comprimento. A diferença mais importante é que o DNA eucariótico é
compactado em nucleossomos, formando a cromatina, enquanto o DNA procariótico não
tem nucleossomos.Nos eucariontes, a estrutura da cromatina é dinâmica e é um ingrediente
essencial na regulação gênica.
16. Quais os pontos de regulação da expressão gênica?
Embora todos os estágios da expressão gênica possam ser regulados, o principal ponto de
controle para muitos genes é a transcrição. Estágios posteriores de regulação comumente
refinam os padrões de expressão gênica "rascunhados" durante a transcrição.
17. Explique o controle positivo e negativo na expressão gênica.
Controle positivo: Ativador ligado facilita a transcrição. Controle negativa: Repressor ligado
inibe a transcrição.
18. Explique a regulação gênica no Operon do Triptofano.
O operon trp é regulado pelo repressor trp . Quando ligado ao triptofano, o repressor trp
bloqueia a expressão do operon. A biossíntese do triptofano também é regulada pela
atenuação, mecanismo baseado no acoplamento entre transcrição e tradução.
19. O operon Lac, atua proteínas repressoras e ativadoras, que regulam o início da
transcrição gênica. Diante disso, explique o que pode ocorrer nas situações abaixo:
1. a) –Glicose/ - Lactose
Não ocorre transcrição do operon lac. Os níveis de AMPc estão altos, pois a glicose está
ausente. No entanto, o repressor lac também estará ligado ao operador (em razão da
ausência de alolactose), atuando como uma barreira à RNA polimerase e impedindo a
transcrição.
2. b) + Glicose/ - Lactose
Não ocorre transcrição do operon lac. Isso porque o repressor lac permanece ligado ao
operador, impedindo a transcrição pela RNA polimerase. Além disso, os níveis de AMPc
estão baixos em função dos níveis altos de glicose, portanto a CAP está inativa e não é
capaz de se ligar ao DNA.
3. c) – Glicose/ + Lactose
Ocorre intensa transcrição do operon lac. O repressor lac se solta do operador, pois o
indutor está presente (allolactose). Os níveis de AMPc estão altos, já que não há glicose.
Portanto, a CAP está ativa e se liga ao DNA. A CAP auxilia a RNA polimerase a se ligar ao
promotor, permitindo altos níveis de transcrição.
4. d) Pouca glicose/ + lactose
Ocorre um nível baixo de transcrição do operon lac. O repressor lac é liberado do operador
porque o indutor (alolactose) está presente. No entanto, os níveis de AMPc estão baixos,
pois há glicose presente. Logo, a CAP se mantém inativa e não é capaz de se ligar ao DNA,
portanto a transcrição acontece em um nível baixo, fraco.
20. Cite e explique as principais enzimas que são codificadas pelo operon lac, bem
como sua principal função no metabolismo bacteriano.
Glicose e lactose. Bactérias E. coli podem quebrar a lactose, mas esse não é o combustível
favorito delas. Se houver glicose disponível, elas provavelmente vão preferi-la. A glicose
requer menos etapas e menos energia para ser quebrada do que a lactose. No entanto, se
a lactose for o único açúcar disponível, as E. coli seguem em frente e a utilizam como fonte
de energia. Para utilizar a lactose, a bactéria precisa expressar o operon lac, o qual codifica
as enzimas-chave para a absorção e metabolismo da lactose. De maneira a ser mais
eficiente possível, as E. coli devem expressar o operon lac somente se duas condições
forem atendidas: A lactose está disponível e a glicose não está disponível. Comoos níveis
de lactose e glicose são detectados, e como alterações nos níveis afetam a transcrição do
operon lac? Duas proteínas reguladoras estão envolvidas: Uma, o repressor lac atua como
um sensor de lactose. A outra, a proteína ativadora de catabólito (CAP), atua como um
sensor de glicose. Essa proteínas se ligam ao DNA do operon lac e regulam sua transcrição
com base no níveis de lactose e glicose. Vamos examinar como funciona.
21. Explique a regulação gênica pós-traducional que ocorre no gene da caseína na
presença de leite.
Há mecanismos regulatórios que agem nas proteínas já formadas. Neste caso, uma
“alteração” da proteína como a remoção de aminoácidos ou adição de uma modificação
química pode levar a uma mudança em suas atividades ou comportamento. Essas etapas
de processamento e modificação podem ser alvos para a regulação. A regulação de
proteínas já produzidas pode ajudar as células a responderem a estímulos ou mudar seu
comportamento de forma rápida e acentuada. Uma proteína que já havia sido produzida
mas estava em seu estado inativo, pode ser “ativada” por uma simples modificação química,
sem precisar passar pela transcrição e tradução. Algumas proteínas devem ser clivadas
proteoliticamente (cortadas) para se tornarem ativas. A insulina usada pelos diabéticos é um
exemplo. Outras proteínas podem receber o acrescimo de grupos químicos, tais como os
grupos metil, fosfato, acetil e ubiquitina. Geralmente, esses grupos são adicionados e
removidos dinamicamente para o controle da atividade. A adição ou remoção de grupos
químicos pode regular a atividade proteica ou o tempo que a proteína permanece na célula
antes de ser “reciclada”. Às vezes, as modificações químicas também podem determinar
onde a proteína se encontra na célula por exemplo, no núcleo ou citoplasma ou aderida à
membrana plasmática.
22. Explique como ocorre o controle da atividade protéica, de proteínas maduras
porém não atuantes.
23. Como a compactação da cromatina pode interferir na regulação gênica? Quais
mecanismos a célula utiliza para expor a região ou gene que deve ser expresso em
um determinado tecido?
Cada cromossomo é formado por uma única molécula de DNA dupla hélice enrolada nas
histonas, o nucleossomo. Esta fibra torna a enrolar-se em um segundo nível de
compactação, conhecido como solenóide. As células mantém, na maior parte do tempo, o
DNA compactado nas alças dos selenóides ligadas ao esqueleto cromossômico. A
expressão gênica também é regulada em nível proteico, por meio da modulação da
tradução do RNAm e por meio da modificação da estrutura e da estabilidade das proteínas.
Controle da expressão gênica: em eucariontes, a regulação pode ocorrer em qualquer etapa
da expressão do material genético.
24. Explique como ocorre o controle da expressão gênica com inativação do
cromossomo X.
A informação flui do DNA → RNA → Proteína. A inativação do cromossomo X é um
impressionante exemplo de modificação e regulação epigenética nos mamíferos. O evento
é responsável por garantir a compensação de dose em relação à transcrição gênica nos
cromossomos sexuais entre fêmeas (XX) e machos (XY).
25. Como a expressão gênica pode estar envolvida com alguns cânceres?
Uma diferença importante entre oncogenes e genes supressores do tumor é que os
oncogenes resultam da ativação de proto-oncogenes, enquanto que os genes supressores
do tumor provocam câncer quando eles são inativados.
26. Quais as proteínas ou motivos de ligação ao DNA que atuam na expressão
gênica? Fale onde se ligam e se atuam em procarioto ou eucarioto.
27. Como os genes eucarióticos podem ser regulados por meio de controle de
expressão gênica de RNAm?
A expressão gênica eucariótica envolve muitas etapas e quase todas elas podem ser
reguladas. Diferentes genes são regulados em diferentes pontos e não é incomum que um
gene, particularmente se for um gene importante ou poderoso, seja regulado em várias
etapas. A estrutura da cromatina, DNA e suas proteínas organizadoras, pode ser regulada.
Uma cromatina mais aberta ou "relaxada" faz com que o gene esteja mais disponível para a
transcrição. A transcrição é um ponto-chave de regulação para muitos genes. Conjuntos de
proteínas de fator de transcrição se ligam a sequências de DNA específicas dentro ou perto
de um gene, promovendo ou reprimindo sua transcrição para um RNA. Processamento de
RNA. Splicing, capping e adição de uma cauda poli-A a uma molécula de RNA podem ser
regulados, de modo que possa sair do núcleo. Diferentes RNAm podem ser feitos a partir do
mesmo pré-RNAm através do splicing alternativo.
16. O que clonagem molecular? Cite os principais componentes envolvidos no
processo e suas respectivas funções.
A clonagem molecular é uma técnica da engenharia genética conhecida também por DNA
recombinante, clonagem gênica ou manipulação gênica. Essa tecnologia permite pegar um
“pedaço” do DNA e combiná-lo com outro, produzindo muitas cópias de diferentes
combinações genéticas. É necessário isolar o fragmento de DNA de interesse. Para que se
tenha o DNA recombinante, de duas origens diferentes, é necessário utilizar as enzimas de
restrição. Essas enzimas reconhecem a sequência alvo específica e cortam seletivamente o
fragmento que será utilizado.Unir o gene e o : DNA recombinante. O fragmento de DNA é
inserido em um vetor, que é uma molécula de DNA na qual um gene é inserido para
construir a molécula de DNA recombinante. Geralmente os plasmídeos (moléculas de DNA
circulares existentes naturalmente nas bactérias) são usados como vetores para clonar
fragmentos de DNA. Eles são projetados para permitir a inserção de um DNA exógeno, têm
origens de replicação e são capazes de se replicar independentemente do cromossomo
bacteriano. Assim, o fragmento do gene alvo se une ao vetor, através da DNA ligase,
formando o plasmídeo recombinante contendo o gene de interesse. A DNA ligase é a
responsável por selar as lacunas do eixo do DNA, funcionando como uma “cola”.
Transformação:A molécula de DNA recombinante produzida é introduzida em um organismo
hospedeiro, podendo então ser replicadas. Esse processo é conhecido como
transformação, no qual as células bacterianas captam o DNA do ambiente externo. As
células hospedeiras copiam o DNA do vetor juntamente com o próprio DNA, criando
múltiplas cópias do DNA inserido. Alguns exemplos de células hospedeiras são as bactérias
Escherichia coli e Bacillus subtilis e a levedura Saccharomyces cerevisiae. Na prática, esse
procedimento gera uma mistura de construções recombinantes. Algumas células contêm o
gene clonado de interesse, ao passo que outras podem conter outros genes do DNA
original. Seleção dos clone recombinante: Para Selecionar apenas as células de interesse
o vetor possui um marcador selecionável que permite a identificação de moléculas
recombinantes. Um marcador de antibiótico é frequentemente usado, assim uma célula
hospedeira sem o vetor morre quando exposta a um determinado antibiótico, enquanto o
hospedeiro com o vetor sobrevive e se multiplica, porque é resistente. Multiplicação do gene
pós as células com o plasmídeo recombinante serem identificadas, elas podem crescer em
grande escala, replicando o fragmento de DNA. Nesse momento, damos às bactérias um
sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo. As bactérias servem como “mini
fábricas”, produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo
continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a
tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina. A proteína de
interesse é então purificada, separada dos demais conteúdos das células, por exemplo,
outras proteínas e macromoléculas. Isso garante que não haja nenhuma impureza, restando
apenas o produto final, como no caso da insulina.
17. Qual aplicação da clonagem gênica?
Entre as possibilidades estão o desenvolvimento de proteínas recombinantes mais seguras
para o tratamento de doenças, o aprimoramento da terapia genética, a produção vacinas,
além do uso na agricultura.
18.Quais os principais vetores de clonagem utilizados? Que tamanho de pb pode
ser inserido neles? Qual suas vantagens e desvantagens?
Um vector de clonagem é uma molécula de DNA que leva até à célula hospedeira o DNA
alvo, e que aí se replica. Um vector de clonagem deve apresentar uma sequência que
permite a sua replicação no interior de uma célula hospedeira bacteriana (leveduras, no
caso dos YAC’s). Deve apresentar um local de clonagem, isto é, um local para inserir o DNA
alvo. Existem 4 tipos de vectores de clonagem: plasmídeos, fagos, cosmídeos e YAC’s
(yeast artificial chromosomes). De um modo geral, o procedimento de clonagem,
independentemente do vector, engloba uma fase inicial de tratamento do vector e do DNA
em estudo com enzimas de restrição, de modo a originar terminais complementares. O
passo seguinte corresponde à união do DNA alvo ao vector com a DNA ligase. De seguida,
introduz-se o DNA alvo na célula hospedeira por transformação. Finalmente,
seleccionam-se as células que contêm o DNA alvo recorrendo a marcadores como é a
resistência a antibióticos. Algumas características que um vector de clonagem deve
apresentar: Possuem locais de reconhecimento para enzimas de restrição; Permitem a
replicação; De fácil isolamento; Pequenas dimensões; Permite a sua multiplicação dentro da
célula com um elevado número de cópias.
19. Explique como ocorre o processo de transformação bacteriana com inserção
plasmidial in vitro.
Bactérias especialmente preparadas são misturadas com DNA (ex., de uma ligação). Um
choque térmico é dado nas bactérias, o que faz com que algumas delas incorporem um
plasmídeo. Os plasmídeos usados na clonagem contém um gene para resistência a
antibiótico. Desta forma, todas as bactérias são colocadas em uma lâmina de antibiótico
para selecionar aquelas que incorporaram um plasmídeo. Bactérias sem um plasmídeo
morrem. Cada bactéria com um plasmídeo dá origem a um aglomerado de bactérias
idênticas, contendo plasmídeo, que são denominadas de colônia. Várias colônias são
verificadas para identificar uma com o plasmídeo correto (por exemplo, por PCR ou
digestões de restrição). Uma colônia contendo o plasmídeo correto cresce em volume e é
usada para a produção de plasmídeo ou proteína.
20. Quais as três principais características que um vetor de clonagem deve ter?
Possuem locais de reconhecimento para enzimas de restrição; Permitem a replicação; De
fácil isolamento; Pequenas dimensões; Permite a sua multiplicação dentro da célula com
um elevado número de cópias.
21. Cite e explique as etapas para a clonagem molecular.
A clonagem do DNA é utilizada para várias finalidades.Como exemplo, vejamos como a
clonagem do DNA pode ser utilizada para sintetizar uma proteína (como a insulina humana)
nas bactérias. As etapas básicas são: 1. Cortar e abrir o plasmídeo e "inserir" o gene. Esse
processo baseia-se em enzimas de restrição (que cortam o DNA) e na DNA ligase (que
une/cola o DNA). 2. Inserir o plasmídeo na bactéria. Utilizar a seleção por antibiótico para
identificar as bactérias que pegaram o plasmídeo. 3. Cultivar lotes de bactérias portadoras
de plasmídeo e usá-las como "fábricas" para fazer a proteína. Colher a proteína das
bactérias e purificá-la.