Relatório Coloração - Laboratório de Biologia Celular

Prévia do material em texto

PRÁTICA 02 
 
COLORAÇÃO 
 
INTRODUÇÃO 
 
 As diferentes estruturas celulares interagem praticamente da mesma forma com a luz, sendo 
que a velocidade com que a luz atravessa os diferentes compartimentos celulares é muito próxima. Isto é 
consequência da constituição química e da densidade dos diferentes componentes celulares, ou seja, dos 
seus índices de refração. As pequenas diferenças no índice de refração não são suficientes para dar 
contraste às diversas estruturas celulares. 
 O uso de substâncias coloridas com capacidade de ligação diferencial a componentes químicos 
específicos da célula permite a sua identificação e localização. Para ser utilizada como corante, uma 
substância deve possuir cor e capacidade de ligação com grupos químicos específicos das células ou de 
seus produtos. 
 A cor apresentada pela molécula de um corante é atribuída à presença de grupos cromofóricos 
(ou cromóforos). Estes grupos representam uma região da molécula capaz de absorver os raios luminosos 
de determinados comprimentos de onda e refletir as radiações complementares não absorvidas. Corantes 
vermelhos, por exemplo, apresentam intensa absorção de luz de comprimentos de onda correspondentes 
às outras cores, em especial o verde, deixando passar aqueles referentes ao vermelho. 
 Denomina-se coloração vital a aplicação de corantes no indivíduo ainda vivo. Estes corantes 
não devem alterar as estruturas e fisiologia da célula, podendo, portanto, serem utilizados na coloração 
de células vivas. O lítio carmin e a tinta da China (nanquim) são exemplos de corantes usados na 
coloração vital. Por outro lado, quando o material é corado logo após a sua remoção do organismo, a 
coloração é denominada supra vital. O vermelho neutro, o verde janus, o azul tripan e o azul de metileno 
são exemplos de corantes usados na coloração supra vital. 
 Em geral, os corantes interagem com os componentes celulares por meio de seus radicais 
ionizáveis, por interação eletrostática. Quando o radical ionizável do corante é aniônico (apresentando 
cargas negativas), este é dito de natureza ácida. Inversamente, se o corante é catiônico (apresentando 
cargas positivas), ele é dito de natureza básica. 
 Em pH fisiológico (aproximadamente 7,2), os ácidos nucléicos (DNA e RNA) apresentam cargas 
negativas, uma vez que eles possuem grupos fosfato ionizáveis na sua estrutura. Por isso, eles têm 
afinidade por corantes básicos como, por exemplo, o azul de metileno e a hematoxilina. Regiões celulares 
onde há predomínio de substâncias ácidas, como o núcleo, são denominadas de basófilas por terem 
afinidade por corantes básicos. O citoplasma também apresenta algumas regiões basófilas, dada à 
presença de RNA (principalmente o RNA ribossômico). 
 As proteínas, que participam da composição de quase todas as estruturas celulares, podem 
apresentar caráter ácido (quando contém predominantemente aminoácidos com radicais do tipo -COO-), 
ou básico (quando contém predominantemente aminoácidos com radicais do tipo -NH3+). Esses radicais 
estarão ionizados dependendo do pH do meio intracelular. Grande parte das proteínas encontradas no 
citoplasma tem afinidade por corantes ácidos, o que confere a acidofilia característica desta região da 
célula. A eosina e a fucsina ácida são corantes ácidos e, portanto, coram as regiões celulares onde 
predominam os componentes de caráter básico. 
 Uma das técnicas de coloração muito utilizada na citologia e na histologia animal é a coloração 
pela hematoxilina e eosina (HE). A hematoxilina, por ser um corante básico, cora o núcleo (cor azul) devido 
aos ácidos nucléicos nele presentes. A eosina, por ser um corante ácido, cora o citoplasma (cor rosa) 
devido à predominância de proteínas básicas nesta região da célula. 
 Este tipo de coloração, envolvendo afinidade ácido-base, embora facilite o estudo da morfologia 
celular, não dá maiores informações a respeito da constituição química das estruturas coradas. 
 
1. OBJETIVOS 
 
- Conhecer diferentes tipos de corantes. 
- Observar o material biológico antes e após a coloração. 
- Relacionar a constituição química da célula e a utilização de corantes ácidos e básicos. 
- Justificar a importância dos corantes na microscopia de luz. 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
2. ATIVIDADE 
 
2.1. Células da mucosa oral 
 
- Coloque uma gota de solução salina 0,9% sobre uma lâmina. 
- Com um palito de fósforo faça uma suave raspagem na mucosa bucal. 
- Transfira o material para a gota de solução salina 0,9%. 
- Cubra o material com lamínula e observe ao microscópio, utilizando as lentes objetivas de 10, 20 e 40X. 
- Inicie a focalização do material com o diafragma fechado, porém, regulando a sua abertura a cada 
mudança de objetiva. 
- Após a observação com a lente objetiva de 40X, volte à lente objetiva de 10X e retire a lâmina do 
microscópio. 
- Coloque uma gota do corante azul de metileno em uma das bordas da lamínula. 
- Encoste um pedaço de papel de filtro no lado oposto ao da gota de corante. O papel absorverá a solução 
salina, permitindo que o corante passe por capilaridade para o espaço entre a lâmina e a lamínula. 
- Aguarde alguns minutos e observe o material ao microscópio. 
- Inicie a focalização regulando abertura do diafragma a cada mudança de lente objetiva. 
- Após a observação, responda: 
 
 
a. Esquematize uma célula e indique o núcleo, o citoplasma e o limite celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
b. Por que no enunciado anterior foi dito limite celular e não membrana plasmática? 
 
 Porque a membrana plasmática só pode ser visualizada em microscópio eletrônico. 
 
b. Por que foi mais difícil observar as células antes da coloração? 
 Porque não havia contraste entre as estruturas celulares, como citoplasma e o núcleo. 
 
c. Qual foi o efeito do corante sobre as células? 
 O corante destacou majoritariamente o núcleo, considerando que o azul de metileno é um corante 
básico que possui afinidade com o núcleo basófilo. 
 
d. O que se entende por substância corante? 
 substância deve possuir cor e capacidade de ligação com grupos químicos específicos das células ou 
de seus produtos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
 
 
 
 
2.2. Corte histológico de fígado (hepatócitos) de rato (Mus musculus) corado hematoxilina e 
eosina (HE) 
 
- Observe que, neste material, as células não aparecem individualizadas. Estas estão organizadas 
compondo um tecido, o que dificulta a visualização dos limites celulares. Estas células possuem forma 
cúbica, núcleo esférico e central e são denominadas hepatócitos. 
- Após a observação, responda: 
 
 
a. Qual é a cor predominante no citoplasma das células e qual é o corante responsável pela coloração? 
 Rosa e eosina. 
 
 
 
b. O que caracteriza quimicamente os corantes ácidos e os básicos? 
 
 O radical ionizável, sendo os ácidos carga negativa e os básicos positivas. 
 
 
c. Cite alguns exemplos de corantes ácidos e de corantes básicos. 
 
 A: eosina e fucsina ácida (pq tem básica dela também). B: azul de metileno e hematoxilina. 
 
d. O que são estruturas basófilas e acidófilas? 
 
 Estruturas que possuem afinidade por elementos básicos (basófilas) ou por elementos ácidos 
(acidófilas). 
 
 
e. A que se deve a basofilia apresentada pelo núcleo e a acidofilia pelo citoplasma? 
 
 
 O núcleo é um composto de carga negativa, por isso tem características ácidas que possuem 
afinidade com a carga positiva e basicidade do corante (presença de ácidos nucleicos). O mesmo 
ocorre com o citoplasma, que por ter carga positiva é atraído pela acidez do corante ácido de carga 
negativa. (presença de proteínas básicas). 
 
 
f. Qual é a limitação apresentada pelas técnicas de coloração que envolvem interações eletrostáticas? 
 
 A coloração convencional ( por meio das interações eletrostáticas) não é específica, não há uma cor 
para cada componente. Pode haver mais de um componente químico sendo corado pelo mesmo 
corante. Falta de especificidade.