Aula 1 e 2 Fundamentação e Técnicas de identificação de DNA

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Disciplina: BIOTECNOLOGIA
Profª Natália Faria Romão
Bióloga / Mestre em genética e toxicologia
Esp. em Microbiologia dos Alimentos – ITAL
Experiência: 2 anos de trabalho em lab. Análise Alimentos
Doutoranda em: BIOTECNOLOGIA – UFAM (Rede Bionorte)
Bolsista: FAPERO/CAPES
N1:
 Exercícios: 1,0
APS: 2,0
Práticas: 1,0
 Avaliação: 6,0
N2:
 Exercícios: 1,0
APS: 2,0
Práticas: 1,0
Avaliação integrada: 2,0
Avaliação: 4,0
Modo de Avaliação
Bibliografia utilizada
Plano de Ensino
PARA N1:
• Conceitos e histórico da biotecnologia.
• Técnicas Básicas da Biologia molecular (Enzimas de
restrição, eletroforese e PCR)
• Tecnologia do DNA recombinante e a Engenharia
genética.
• Genômica, Proteômica, Transcriptômica e
Metabolômica.
• Extração de DNA.
• Terapia gênica
• Expressão de proteínas (Recombinantes)
PARA N2:
• Marcadores moleculares
• Técnicas que avaliam toxicidade e
mutagenicidade/genotixicidade
• Técnicas emergentes como microarrays, iRNAs e
CRISPR.
• Sequenciamento
• Práticas: Teste de toxicidade / mutagenicidade Allium
cepa.
Plano de Ensino
Biotecnologia
AULA 1: Introdução, 
revisão de Técnicas 
básicas de identificação 
de ácidos nucléicos
Profª Natália Faria Romão
Bióloga / Mestre em genética e toxicologia
Doutoranda: Biotecnologia - UFAM
Bolsista: FAPERO/CAPES
É um conjunto de conhecimentos 
que permite a utilização de agentes 
biológicos (organismos, células, 
organelas, moléculas) para obter 
bens, assegurar serviços (com fins 
industriais). 
Variam por autor
Biotecnologia
BIOTECNOLOGIA
CONHECIMENTOS
Ciências e Tecnologia
AGENTES BIOLÓGICOS
Organismos, Células, 
Organelas ou unidades 
funcionais
PRODUZIR BENS ASSEGURAR SERVIÇOS
• A biotecnologia tem por base vários ramos do
conhecimento que poderiam ser classificados
como fundamentais:
– Bioquímica
– Fisiologia
– Genética
– Microbiologia
– Virologia
– Botânica
– Zoologia
– Ecologia
– Engenharia química
Biotecnologia
Multidisciplinar
Biotecnologia
 A Biotecnologia opera a nível molecular, onde as
barreiras reprodutivas estabelecidas na formação da
espécie desaparecem.
 Isso é possível porque todos os seres vivos possuem
DNA como molécula fundamental portadora da
informação gênica e compartilham o mesmo código
genético, que codifica determinadas proteínas dos
homens, animais, plantas, insetos e microorganismos.
Biotecnologia
 Uma das características da biotecnologia que tem
contribuído para o receio que parte da população
manifesta em relação a ela é a velocidade com que esta
ciência avançou nos últimos anos e como sua aplicação
em benefício da sociedade atingiu o mercado de forma
tão inesperada.
Ex.: de 50 a 100 anos atrás uma invenção demorava
cerca de 30 anos para ser disponibilizada ao público;
hoje as invenções são comercializadas antes mesmo
que o público tome conhecimento.
Biotecnologia – marcos históricos
• 6.000 a.C.: bebidas alcoólicas (cerveja e vinho)
são produzidas por sumérios e babilônios;
• 2.000 a.C.: panificação e bebidas fermentadas
são utilizadas por egípcios e gregos;
Biotecnologia – marcos históricos
• 1875 d.C.: Pasteur mostra
que a fermentação é
causada por
microrganismos;
• 1880-1910: surgimento da
fermentação industrial
(ácido láctico, etanol,
vinagre...);
Biotecnologia – marcos históricos
• 1910-1940: síntese de glicerol, acetona e ácido
cítrico;
• 1940-1950: antibióticos são produzidos em
larga escala por processos fermentativo;
• 1953: estabelecida a estrutura do DNA;
• 1973: início da engenharia genética;
• 1982: insulina humana é produzida.
Biotecnologia – história no mundo
Primeira Geração: 6.000 /2000 a.C.
• Fatos:
– cruzamento de espécies animais e plantas;
– leveduras para fermentação de pão e álcool
Biotecnologia – história no mundo
Segunda Geração: Fim do século XIX
Teoria de Louis Pasteur
• Fatos:
– microrganismos causam enfermidades humanas
– ação dos microrganismos anaeróbios nas 
fermentações láctea, butírica, alcoólica....
Terceira Geração: Início de 1970. Biologia Molecular
• Fatos: 1o – isolamento e manipulação de genes 
2o – fusão e multiplicação de células
Biotecnologia – história no mundo
Manipulação do material genético e reprogramação de 
microrganismos
“fábricas” para produção de vários bens úteis
Química
Farmacêutico
Alimentos
Agropecuário
Papel & 
celulose
Biotecnologia moderna
Biotecnologia moderna
• PLANEJAMENTO A LONGO PRAZO -
discutir e definir uma plataforma tecnológica 
adequada.
• Subsídios do governo federal/estadual;
• Balanço pesquisa básica / tecnológica;
• Definir algumas prioridades tecnológicas chaves 
para o futuro;
• Propriedade intelectual e Transferência de 
tecnologia
BRASIL
Biotecnologia moderna
Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ
Instituto Ludwig de Pesquisa ao Câncer
Instituto Butantan
EMBRAPA – CENARGEN
IPEPATRO- Porto Velho (RO)
BRASIL
Os Centros de Excelência em 
Biotecnologia 
Biotecnologia moderna
• Cultura de Células: Plantas e Humanas;
• Clonagem: Molecular, Celular – Terapia Gênica e 
animal;
• Genômica
• Bioinformática
• Bionanotecnologia
Novas Tecnologias em Biotecnologia
Revisão Geral para o Estudo de 
BIOTECNOLOGIA
Utilização de Bactérias
Benefícios X Patogenidade
• Bactérias Nitrificantes: grande importância ecológica:
– Fixam o nitrogênio da atmosfera na forma de
nitratos
– Bactérias Desnitrificantes: devolvem o nitrogênio
dos nitratos e da amônia para a atmosfera.
• Bactérias responsáveis pela decomposição de matéria
orgânica.
• Capacidade de fermentação: produção de queijos
iogurtes, temperos, embutidos...
• Indústria farmacêutica: fabricação de antibióticos
específicos. Ex.: Estreptomicina.
Archeas: Arqueobactérias
• Aspergillus niger: produção de ácido cítrico para
alimentos e bebidas desde de 1914.
• Saccharomyces cerevisae: pão, vinho, etanol e na
engenharia genética: proteínas heterólogas – Ex.:
Vacina da hepatite B.
Fungos: na biotecnologia
• Pichia pastoris: produção de proteínas heterólogas –
quimosina bovina (coalho), hormônio do
crescimento humano (medicamento), lipases
(detergentes), amilases (xaropes)...
Fungos: na biotecnologia
• Trichoderma sp: produção de celulases comerciais
– remoção da parede celular das plantas para a
produção de suco de frutas de melhor qualidade.
• A habilidade dos fungos degradar plantas está
levando a investigação desses organismos para
programas de limpezas do meio ambiente –
biodegradação de compostos tóxicos.
Fungos: na biotecnologia
Microorganismos na Biotecnologia
• As microalgas:
– fabricação de gomas, corantes naturais, pastas, entre
outros.
• As macroalgas:
– As Rodófitas, Clorófitas, Feófitas, são usadas
diretamente em sopas, saladas, condimentos…
algas: na biotecnologia
• As Rhodophytas:
– Produção do ágar, sendo utilizado no meio
culinário (é usado como espessante e estabilizante)
ou na produção de meios de cultura.
– O outro produto é a carragenina, também usado
como estabilizador, clareamento de cervejas, entre
outros.
algas: na biotecnologia
• As Rhodophytas:
– no meio farmacêutico como alguns medicamentos,
cápsulas de remédios e cremes cosméticos.
– Tem também um poder laxativo.
– A carragenina, possui formas reversíveis as
mudanças de temperatura (transformação de um
líquido em gel e vice-versa), estando presente em
cremes dentais, tintas, cosméticos, sabões e tecidos.
algas: na biotecnologia
• As Phaeophytas:
– produzem o alginato, usados como espessantes eestabilizadores, clareador de cervejas, estabilizador de
espumas, e na preservação de frutas.
algas: na biotecnologia
• Espécies do gênero Laminaria:
– Usadas no combate ao inchaço da tiróide, e como
substância anti-coagulante (devido a um componente
com características semelhantes a heparina).
– Por possuírem propriedades de aumentar e diminuir
seu volume, é utilizada na dilatação do colo uterino, a
fim de provocar o parto prematuro.
– A Digenia simplex, é usada como anti-helmíntico;
– A Phycocyaninis, é usada no combate à tumores.
algas: na biotecnologia
Os microorganismos e outros 
organismos como as algas são 
utilizados em larga escala na 
Biotecnologia nos processos de 
industrialização.
TÉCNICAS DE 
IDENTIFICAÇÃO DE 
DNA
TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO DE DNA
• Para se entender a técnica necessitamos
compreender os procedimentos que levam ao
desenvolvimento da técnica:
Enzimas de Restrição
Eletroforese
PCR
TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO DE DNA
Enzimas de Restrição
• A partir de 1970, ficou mais fácil analisar a
molécula de DNA com o isolamento da
enzimas de restrição.
• São endonucleases: dentro das moléculas de
DNA, cortando-as em locais bem definidos;
• São produzidas normalmente por bactérias –
ajudam a defende-las de invasores = vírus.
• Essas enzimas “picotam” a molécula de DNA
em determinados pontos = pontas adesivas,
que podem se ligar a outras pontas de
moléculas de DNA que tenham sido cortadas
com a mesma enzima.
Enzimas de Restrição
• Em Engenharia Genética, esses fragmentos de
DNA serve para criar, in vitro, novas
moléculas, recortando e colando vários
pedaços de informações.
Enzimas de RestriçãoEnzimas de Restrição
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Tipos de cortes: 
- Produção de terminais coesivos (adesivos) 
- Produção de terminais abruptos (ou cegos)
Enzimas de Restrição
Enzimas de Restrição
• O DNA pode ser composto de várias
repetições da sequência GAATTC (por
exemplo) ao longo de sua extensão.
• Em contato com a enzima EcoRI a fita
pode ser clivada "cortada" em diversos
lugares, gerando vários pedaços, de
tamanhos diferentes.
Enzimas de Restrição
Enzima Organismo Sequencia
EcoRI Escherichia coli RY13 5' G AATTC 3'
AluI Arthrobacter luteus 5' AG CT 3'
BamHI Bacillus amyloliquefasciens H 5' G GATCC 3'
HaeIII Haemophilus aegyptus 5' GG CC 3'
HindIII Haemophilus influenzae Rd 5' A AGCTT 3'
Enzimas de Restrição
Técnica de separação de partículas através de 
corrente elétrica
1-Identificação de substâncias
2-Homogeneidade de sistemas biológicos
3-Determinação de pontos isoelétricos 
Eletroforese
• Movimento de partículas
dispersas num fluído sob
influência de um campo elétrico
uniforme.
• DNA, carga negativa
– Tem tendência a se dirigir ao
pólo positivo quando sujeito
a um campo elétrico
• Serve para separar moléculas
por tamanho/carga elétrica
– Proteína deve ser
desnaturada com detergente
(SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em
trabalhos de biologia molecular
Eletroforese em gel de Agarose
Foto: Natália Romão
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e 
pectina.
Etapas:
Eletroforese em gel de agarose
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
Eletroforese em gel de agarose
Aplicação das amostras
Definição do mapa das 
amostras por canaleta
Eletroforese em gel de agarose
Foto: Natália Romão
Corrida do gel
• Aplicação do campo 
elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo 
de íons através da 
solução tampão
• Terminais positivo e 
negativo
• Tempo adequado, senão 
o DNA sai do gel
Eletroforese em gel de agarose
Foto: Natália Romão
Corrida do gel
Eletroforese em gel de agarose
Foto: Natália Romão
Coloração das moléculas
• Brometo de etídio
– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV
– Gel de agarose
• Prata
– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc
Eletroforese em gel de agarose
Diagnóstico padrão para E. Coli
Foto: Natália Romão
• Os fragmentos de DNA menores podem
migrar mais rapidamente que os fragmentos
de DNA maiores.
• É possível calcular o tamanho exato de um
dado fragmento com base na sua razão de
migração.
Eletroforese em gel de agarose
• A reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase 
Chain Reaction), foi idealizada em meados de 1980 e 
totalmente descrita em 1987
Antes e depois de Karry mullis
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
• Uma simples cópia de um gene específico dentro
de um genoma pode ser amplificado para alguns
microgramas, partindo-se de quantidades
mínimas como sub picogramas de DNA total.
• A condição básica para a aplicação da técnica,
depende da construção de oligonucleotídeos
(iniciadores) os quais são complementares as duas
fitas opostas do DNA e que estejam flanqueando
a sequência a ser amplificada
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Técnica que permite a amplificação da 
quantidade de DNA específico utilizando 
a enzima Taq DNA polimerase, 
sequências iniciadoras específicas 
(primers) e variações de temperatura 
controladas.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Taq DNA polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus,
a qual é uma bactéria encontrada
sobrevivendo a altas temperaturas em
geisers no Yellow Stone National Park.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
 Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida
durante 45 minutos a 95°C.
• É importante deixar claro que o excesso de enzima
também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo
inclusive inibi-la.
Taq DNA polimeraseReação em Cadeia da Polimerase (PCR)
• Equipamento de PCR (tornará os
ciclos possíveis
• Fita de DNA que se deseja amplificar
• TAQ polimerase (fará o papel da
DNA polimerase)
• Oligonucleotídeos de DNA, servirá
como iniciadores (são sintetizados por
métodos químicos)
• dNTPs (desoxirribonucleosídeos
trifosfatados)
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
O que é necessário para que a técnica aconteça
OH
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
Etapas da PCR
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Desnaturação
Anelamento
Extensão
94ºC
35-65ºC
72ºC
Taq polimerase
Primers 
Tampão
Água
94ºC
DENATURAÇÃO
72ºC
EXTENSÃO
35-65ºC
ANELAMENTO
ETAPAS DA PCR
1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas
(Termociclador)
25-40 (35) CICLOS
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP 
(nucleotideos)
Análise
dos dados
Luz Ultravioleta
Fotodocumentação
Termociclador
Reação:
DNA
Enzima Taq
Primer
Nucleotídeos
Tampão
Água
Eletroforese
em gel de agarose
+
Brometo de Etídeo
Reação
de PCR
+
Tampão 
Corado
(Loading Buffer)
Marcador
de pares
de base
(pb)
300
200
100
400
500
600
1400
1300
400 400 400
600 600
100 100 100 100
FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%
UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb
TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE 
DNA AMPLIFICADOS
• Após 30 ciclos, para 
cada 1 molécula de 
DNA terá-se 2
30 
• Ou 2x2x2x2x2 (30x)
• 1.073.741.824
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
• Seleção de primers
– Sintetizados quimicamente
– 15 a 25 pb
– Define limites de alvos a 
amplificar
– Serve como ponto de inicio 
para replicação
– Permite a copia de duas 
cadeias simultâneas do 
DNA.
Reação em Cadeia da Polimerase(PCR)
Primers
Pesquisa: Natália Romão (EMBRAPA)
• Seleção de primers
– Banco de dados: International Nucleotide Sequence 
Database (www.insdc.org)
– GenBank (NCBI, NIH)
– European Molecular Biology Laborstory (EMBL)
– DNA Databank of Japan (DDBJ)
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Primers