Vamos analisar cada uma das afirmações sobre o desenho de primers para PCR convencional e PCR em tempo real (qPCR): 1. Evitar regiões com alta homologia entre diferentes genes ou isoformas é uma regra essencial no desenho de primers tanto para PCR convencional quanto para qPCR, a fim de garantir a especificidade da reação. - Correto. Isso é fundamental para evitar amplificações não específicas. 2. Para evitar a formação de dímeros de primers, é importante que as extremidades 3' dos primers não sejam complementares entre si, já que isso pode comprometer a eficiência da amplificação. - Correto. Dímers de primers podem comprometer a reação. 3. A presença de um GC clamp (uma sequência rica em guanina e citosina nas últimas bases da extremidade 3' dos primers) pode ajudar a melhorar a estabilidade da ligação do primer ao DNA-alvo, sendo recomendada tanto para PCR convencional quanto para qPCR. - Correto. O GC clamp é benéfico para a estabilidade da ligação. 4. Na qPCR utilizando SYBR Green, o design de primers deve evitar regiões repetitivas e incluir uma análise rigorosa de temperatura de melting (Tm) para evitar a amplificação inespecífica, já que o SYBR Green se liga a qualquer DNA de fita dupla. - Correto. Isso é importante para garantir a especificidade. 5. Em qPCR utilizando sondas como TaqMan, o primer deve ser desenhado de modo que a sinalização fluorescente ocorra apenas após a hidrólise da sonda pelo avanço da polimerase, garantindo a especificidade da detecção do alvo. - Correto. Isso é essencial para a detecção específica. Agora, todas as afirmações estão corretas. Vamos verificar a sequência correta: - A afirmação 2 é a primeira a ser considerada. - A afirmação 1 pode vir em seguida. - A afirmação 3 é a terceira. - A afirmação 5 é a quarta. - A afirmação 4 é a última. Portanto, a sequência correta é: 2, 1, 3, 5, 4. A resposta correta é: 2, 1, 3, 5, 4.