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64 Unidade II Unidade II 5 CLASSIFICAÇÕES DO EXAME CITOPATOLÓGICO CÉRVICO-VAGINAL 5.1 Classificação de Papanicolau Em 1941, George Papanicolaou propôs uma nomenclatura citopatológica que procurava expressar se as células observadas eram normais ou não, atribuindo-lhes uma classificação em cinco classes: • classe I: epitélio normal, ou seja, ausência de atipias; • classe II: células atípicas (anormais), mas sem evidência de malignidade, alterações inflamatórias; • classe III: sugestiva, mas não conclusiva de malignidade; • classe IV: fortemente sugestiva de malignidade; • classe V: conclusiva para malignidade. Entretanto, essa classificação não se preocupava com a possibilidade de lesões precursoras, apenas verificava a presença ou a ausência de células malignas. Além disso, não era possível fazer uma correlação com os aspectos histopatológicos (INCA, 2012). 5.2 Classificação de Reagan No final dos anos 1950, James Reagan levou em consideração as alterações histológicas e introduziu o termo displasia para distinguir o epitélio normal de um epitélio cervical anormal (atípico), bem como um carcinoma in situ. E essa classificação foi dividida em: normal, com atipia, displasia leve, moderada, acentuada (que depende do grau de comprometimento da espessura epitelial por células atípicas), carcinoma in situ e carcinoma escamoso (ou adenocarcinoma). No entanto, o diagnóstico continuava inespecífico e não fazia uma correlação adequada com o prognóstico da lesão. 5.3 Classificação de Richart Em 1967, Ralph Richart sugere outra nomenclatura para o diagnóstico citológico das alterações invasivas no epitélio escamoso do colo do útero: Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC), substituindo as displasias e carcinoma in situ, classificado em: • neoplasia intraepitelial cervical grau I (NIC I), que se refere à displasia leve; 65 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA • neoplasia intraepitelial cervical grau II (NIC II), que corresponde à displasia moderada; • neoplasia intraepitelial cervical grau III (NIC III), que está relacionada à displasia severa e carcinoma in situ (INCA, 2012). 5.4 Classificação de Bethesda Devido às discordâncias encontradas entre os diagnósticos citopatológicos e os achados histológicos, em 1988 um grupo de pesquisadores (citologistas, histopatologistas e ginecologistas, entre outros) participaram de uma conferência em Bethesda, Maryland (EUA), ajudando a desenvolver uma nova nomenclatura, designada como Sistema de Bethesda, com objetivo de padronizar as descrições dos achados citopatológicos. O sistema de Bethesda foi revisado algumas vezes, mais precisamente em 1991, em 2001 e em 2014 (SOLOMON et al., 2002; NAYAR; WILBUR, 2015). Esse sistema inclui alterações que se baseiam no acúmulo de dados e nos avanços no conhecimento do processo do câncer cervical. Estabeleceu-se que, para representar o epitélio escamoso, deve-se usar a sigla ASC (do inglês Atypical Squamous Cells), que significa atipia de células escamosas. Muitas vezes podem representar alterações sugestivas de lesão intraepitelial escamosa de baixo grau, no entanto, não apresentam um resultado, quantitativa ou qualitativamente para a interpretação definitiva. Atualmente, ASC é subdividida em dois grupos. São eles: ASC-US (do inglês Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) e ASC-H (do inglês Atypical Squamous Cells Cannot Exclude High-Grade Squamous Intraepithelial Lesions). A sigla ASC-US significa a presença de atipia de células escamosas de significado indeterminado. É comum encontrar no laudo citopatológico cérvico-vaginal o resultado de ASC-US. Entretanto, isso não significa necessariamente que são alterações malignas, pode se tratar do resultado de uma inflamação, e até desaparecer espontaneamente. A sigla ASC-H (do inglês, Atypical Squamous Cells Cannot Exclude High-Grade Squamous Intraepithelial Lesions) representa atipia de células escamosas de significado indeterminado não excluindo lesão de alto grau (INCA, 2012). Pelo sistema de Bethesda, quando são observadas alterações nas células escamosas, é utilizada a sigla LSIL (do inglês Lowgrade Squamous Intraepithelial Lesion), que representa uma lesão intraepitelial escamosa de baixo grau, considerada uma displasia leve e NIC grau I. Ela é causada pela infecção pelo HPV, podendo haver regressão da lesão em um ou dois anos, porém, a evolução da lesão não pode ser excluída (PRADO et al., 2012). Quando essas alterações são caracterizadas por alterações na morfologia da célula, isso é sugestivo de invasão com grande probabilidade de ser uma lesão pré-maligna. Nesse caso, é utilizada a sigla HSIL (do inglês High Grade Cervical Squamous Intraepithelial Lesion), que significa lesão intraepitelial escamosa de alto grau, sendo considerada displasia de moderada à severa (NIC graus I e II). Kulasingam et al. (2006) demonstraram que em mulheres com alteração ASC-US, a prevalência de ocorrer evolução para HSIL e neoplasia uterina é de cerca de 10%. Em uma LSIL, é menos provável que ocorra uma progressão para o carcinoma invasino. No entanto, HSIL pode evoluir para um carcinoma invasivo dependendo da infecção causada por tipos de HPVs oncogênicos (DEMAY, 2005). 66 Unidade II Para representar o epitélio glândular, o termo AGUS (do inglês Atypical Glandular Cells of Undetermined Significance) foi inserido e significa a presença de atipia de células glandulares de significado indeterminado. Essas alterações em células epiteliais glandulares podem compreender células endocerviciais e endometriais, e tais alterações morfológicas significativas podem evoluir para carcinoma in situ (INCA, 2012). Quadro 1 – Evolução da nomenclatura citopatológica e histológica Classificação citológica de Papanicolaou (1941) Classificação histológica da OMS (1952) Classificação histológica de Richart (1967) Sistema Bethesda (2001) Classificação citológica brasileira (2006) Classe I Negativo Negativo Negativo Negativo Classe II Negativo Negativo Alterações benignas Atipias de significado indeterminado Alterações benignas Atipias de significado indeterminado Classe III Displasia leve Displasia moderada Displasia acentuada NIC I NIC II NIC III LSIL HSIL HSIL LSIL HSIL HSIL Classe IV Carcinoma in situ NIC III HSIL Adenocarcinoma in situ HSIL Adenocarcinoma in situ Classe V Carcinoma invasor Carcinoma invasor Carcinoma invasor Carcinoma invasor Fonte: Inca (2016, p. 26). De acordo com Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (Iarc, do inglês, International Agency for research on Cancer), é necessário seguir algumas regras sobre a classificação Bethesda. As principais diferenças entre a classificação de Bethesda de 1991 e de 2001 são: inclusão de tipo de amostra coletada, inclusão de testes complementares utilizados e inclusão de informações sobre qual método automatizado foi utilizado – por exemplo, o teste para identificar o subtipo do HPV (IARC, [s.d.]). Observação A Iarc é uma agência intergovernamental da OMS. Trata-se de uma instituição extremamente importante para todas as questões envolvendo o câncer. Além disso, a categoria “diagnóstico descritivo” foi alterada para “interpretação e resultados”. Nessa classificação é importante indicar qual foi o tipo da amostra utilizada. 67 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA Tipos de amostra Os tipos de amostra são: citologia convencional (esfregaço convencional); citologia em meio líquido; entre outros. Entre as diferentes técnicas de preparação, realizadas em meio líquido, esfregaço convencional ou suspensão de células, é fundamental que essa informação esteja presente no relatório final. Adequação da amostra Os tipos de adequação da amostra são descritos a seguir. • Satisfatório para avaliação: descrever a presença ou ausência de células endocervicais/zona de transformação e quaisquer outros indicadores de qualidade. Por exemplo: presença parcial de hemácias, inflamação etc. • Insatisfatório para avaliação: necessário especificaro motivo pelo qual a amostra foi rejeitada ou não processada (ou especificar o motivo, se a amostra foi processada e avaliada e, no entanto, foi considerada insatisfatória para avaliação de anormalidade epitelial). Outra diferença em relação à classificação Bethesda de 1991 é que o termo sobre a “amostra satisfatória, porém limitada” foi excluído, sendo aceitos os critérios segundo os quais a amostra não é considerada satisfatória, por exemplo, quando mais de 75% das células estão prejudicadas por sangue ou inflamação. A expressão “diagnóstico geral”, presente na classificação de Bethesda de 1991, foi alterada para “categorização geral”, sendo opcional esse termo no relatório. Categorização geral (opcional) Sobre a categorização geral (opcional), temos: • negativo para lesão intraepitelial ou malignidade; • outras: importante verificar a interpretação/resultado (por exemplo, presença de células endometriais em mulheres acima de 40 anos de idade); • alteração celular epitelial: quando observar a interpretação e o resultado, deve-se sempre especificar no laudo se é epitélio escamoso ou glandular. A categoria de “modificações celulares benignas” da classificação de Bethesda de 1991 era individualizada e, com a atualização, entraram na categoria “ausência de lesão intraepitelial ou maligna”. 68 Unidade II Interpretação e resultado Quanto à interpretação e resultado, as possibilidades são descritas a seguir. • Negativo para lesão intraepitelial ou malignidade: quando a paciente não possuir a presença de células malignas, sempre descrever o fato na categorização geral acima e/ou na seção de interpretação/resultado do laudo, verificando se apresenta ou não organismos ou outros achados não neoplásicos. • Organismos: — Trichomonas vaginalis; — organismos fúngicos (por exemplo, Candida spp.); — substituição na flora sugestiva de vaginose bacteriana; — bactérias morfologicamente consistentes com Actinomyces spp.; — alterações celulares consistentes com o vírus herpes simples. • Outros achados não neoplásicos: — alterações celulares reativas associadas à inflamação (incluindo reparo típico), radiação e dispositivo intrauterino (DIU); — estado das células glandulares pós-histerectomia; — atrofia. • Outros: — células endometriais (em mulher de 40 anos ou mais); deve-se especificar no laudo se é negativo para lesão intraepitelial. Alterações de células epiteliais Células escamosas Sobre alterações das células escamosas: • células escamosas atípicas: de significado indeterminado, não é possível excluir lesão intraepitelial escamosa de alto grau; 69 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA • lesão intraepitelial escamosa de baixo grau: abrangendo HPV/displasia leve/NIC 1; • lesão intraepitelial escamosa de alto grau: abrangendo: displasia moderada e acentuada, NIC 2 e NIC 3, com características suspeitas de invasão (se houver suspeita de invasão); • carcinoma de células escamosas. Células glandulares No caso das células glandulares, a individualização do adenocarcinoma in situ endocervical realizada dentro de critérios citológicos bem definidos e o desaparecimento da categoria AGC de significação indeterminada (AGUS) são as principais modificações. • Atípicas: células endocervicais (sem outras especificações ou especificar nos comentários); células endometriais (sem outras especificações ou especificar nos comentários); células glandulares (sem outras especificações ou especificar nos comentários). • Atípicas: células endocervicais, possivelmente neoplásicas; células glandulares, possivelmente neoplásicas. • Adenocarcinoma endocervical in situ. • Adenocarcinoma: endocervical, endometrial, extrauterino ou sem outras especificações. Em 2014, foi realizada a revisão de Bethesda, na qual recomendou-se que, quando há presença de células endometriais fora do período menstrual após os 45 anos de idade, é necessário ser relatado devido à possibilidade de alguma anormalidade glandular no endométrio (DEMAY, 2005). Alguns estudos demonstraram o aumento do valor preditivo desse achado em mulheres nessa faixa etária (NAYAR; WILBUR, 2015). Outras neoplasias malignas Outras formas mais comuns de carcinoma malpighiano e de adenocarcinoma endocervical apresentam-se raramente como tumores primitivos do colo uterino, tumores secundários e tumores metastáticos. 5.5 Nomenclatura brasileira para laudos citopatológicos cervicais No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (Inca) e a Sociedade Brasileira de Citopatologia promoveram várias reuniões, congressos e seminários para discutir e propor uma nomenclatura para a classificação citológica brasileira, preferivelmente semelhante ao sistema de Bethesda, vigente até o momento presente. De acordo com a nomenclatura citopatológica e histopatológica ao longo da história da citopatologia, diversas classificações foram descritas para as lesões cervicais encontradas. É importante seguir as normas quanto ao tipo da amostra. 70 Unidade II Saiba mais Por meio do documento indicado a seguir, você pode entender melhor sobre a nomenclatura brasileira para laudos cervicais e as condutas preconizadas. INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER (INCA). Coordenação de Prevenção e Vigilância. Secretaria de Atenção à Mulher. Nomenclatura brasileira para laudos cervicais e condutas preconizadas: recomendações para profissionais de saúde. Rio de Janeiro: Inca, 2006. Disponível em: http://bvsms.saude.gov. br/bvs/publicacoes/Nomenclaturas_2_1705.pdf. Acesso em: 31 maio 2020. 5.5.1 Tipos de amostra Os tipos de amostra são: • citologia convencional; • citologia em meio líquido. No momento da entrada da lâmina no laboratório, para ser analisada, deve-se fazer seu registro e identificação. Se no primeiro momento a lâmina apresentar alguma causa de rejeição, o fato deve ser notificado. Além disso, uma amostra será rejeitada em algumas circunstãncias: quando os dados do paciente forem divergentes do pedido médico; na ausência de amostra e/ou do pedido médico; quando o material biológico não apresentar identificação ou houver erro na identificação da lâmina e/ou do frasco; em caso de lâmina danificada ou ausente; quando a identificação da lâmina e/ou do frasco não se apresentar coincidente com a do formulário por causas alheias ao laboratório. É importante sempre especificar qual foi a causa da rejeição. 5.5.2 Adequabilidade da amostra A adequabilidade da amostra pode ser satisfatória ou insatisfatória. Ao ser examinada, a amostra cérvico-vaginal será classificada como satisfatória ou insatisfatória de acordo com as normas sobre a adequabilidade da amostra. Lembrete No passado, usava-se o termo “satisfatório, porém limitado”, no entanto, tal conceito não é mais utilizado. 71 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA Atualmente, na nomenclatura brasileira são consideradas amostras insatisfatórias aquelas em que a avaliação da leitura estiver prejudicada devido a material acelular ou hipocelular (ou seja, menor que 10% do esfregaço), e por presença de sangue, piócitos, artefatos de dessecamento, contaminantes externos ou intensa superposição celular (maior que 75% do esfregaço). Amostras satisfatórias, por sua vez, são aquelas que apresentam células em quantidade suficiente, bem distribuídas pela lâmina, fixadas e com coloração em ótimo estado para a correta visualização das células, permitindo uma conclusão diagnóstica fidedigna. Podem estar presentes células representativas dos epitélios do colo do útero, como escamoso, glandular (não inclui o epitélio endometrial) e o metaplásico. Como um bom indicador da qualidade do exame, considera-se a presença de células metaplásicas ou endocervicais representativas da junção escamocolunar. Isso ocorre devido ao fato de elas se originarem no local onde se apresenta a maioria dos cânceres de colo do útero. 5.5.3 Material examinado, dentro dos limites de normalidade É um resultado citológico dentro dos limites da normalidade no material analisado, cujo resultado é completamentenormal. 5.5.4 Alterações benignas das células (ativas ou reparativas) Inflamação sem identificação de agente: a presença de alterações nas células epiteliais é caracterizada geralmente pela ação de agentes físicos, que podem ser radioativos, mecânicos, térmicos ou químicos, como certos medicamentos abrasivos ou também a utilização de quimioterápicos. Além disso, a acidez vaginal sobre o epitélio glandular também pode contribuir para a presença de alterações nas células (MALIK et al., 2001), assim como podem ser observadas alterações pelo uso do dispositivo intrauterino (DIU), em células endometriais (AGARWAL et al., 2004). Até mesmo casos especiais como, por exemplo, reações alérgicas ou exsudato linfocitário podem ser observados pela presença de eosinófilos (HALFORD, 2002). 5.5.5 Presença de metaplasia escamosa imatura no resultado A expressão imatura em metaplasia escamosa foi introduzida na nomenclatura brasileira buscando caracterizar esse aspecto como um tipo de reparação (INCA, 2016). 5.5.6 Anormalidades (atipias) celulares A nomenclatura brasileira criou uma categoria separada para todas as atipias em células escamosas (ASC): células escamosas atípicas de significado indeterminado, possivelmente não neoplásicas (ASC-US) e de acordo com a classificação ASC-US de Bethesda. A outra categoria é definida como células escamosas atípicas de significado indeterminado, não podendo excluir lesão intraepitelial de alto grau (ASC-H), como na classificação de Bethesda (INCA, 2012). Para as atipias encontradas em células glandulares ficaram estabelecidas as categorias: células glandulares atípicas de significado indeterminado possivelmente não neoplásica e células glandulares 72 Unidade II atípicas de significado indeterminado em que não se pode excluir lesão intraepitelial de alto grau. Sempre que possível, deve-se mencionar a origem da atipia, seja endocervical, endometrial ou sem outras especificações (nesse caso, quando existe dificuldade em especificar o local de origem da atipia celular). Além disso, introduziu-se a categoria “de origem indefinida” para designar aquelas situações em que não é possível estabelecer com clareza a origem da célula atípica (INCA, 2012). 5.5.7 Anormalidades de células escamosas De acordo com a nomenclatura brasileira de Laudos Citopatológicos cervicais (2012), o termo neoplasia foi substituído por lesão intraepitelial, pois estabelece duas condições de lesão intraepidelial: de baixo e alto grau. A lesão intraepitelial escamosa de baixo grau compreende as alterações citopáticas induzidas pelo HPV, lesão conhecida anteriormente através das classificações da OMS como displasia leve em Richart como NIC 1. A lesão intraepitelial escamosa de alto grau compreende as lesões denominadas previamente pelas classificações da OMS e de Richart como displasia moderada/NIC 2 e displasia acentuada/carcinoma in situ/NIC 3. Além disso, inclui também as lesões intraepiteliais escamosas de alto grau com características suspeitas de microinvasão (lesão intraepitelial de alto grau, não podendo excluir microinvasão) e carcinoma escamoso invasor (INCA, 2012). 5.5.8 Anormalidades de células glandulares endocervicais A nomenclatura brasileira e o sistema de Bethesda incluem a categoria adenocarcinoma in situ (AIS), que reconhece a capacidade de identificação morfológica das anormalidades de células glandulares endocervicais. Quando houver o item “sem outras especificações”, significa exclusivamente adenocarcinomas de origem uterina. No entanto, quando for encontrada alguma neoplasia de origem glandular extrauterina, essa deve ser colocada no setor das outras neoplasias malignas. A revisão de Bethesda (2014) relatou a presença de células endometriais fora do período menstrual e após os 45 anos de idade (NAYAR; WILBUR, 2015). A presença de células endometriais, em amostra citopatológica obtida fora do período menstrual ou de mulher na pós-menopausa, sem uso de terapia hormonal, deve ser investigada mais profundamente, pois pode estar relacionada com anormalidade glandular no endométrio (DEMAY, 2005). De acordo com as diretrizes do Inca (2016), são considerados achados microbiológicos normais, por exemplo: Lactobacillus spp., cocos e outros bacilos que fazem parte da microbiota normal da vagina. E quando a paciente não possui qualquer sintoma da presença de microrganismos, não é considerada infecção. No entanto, se a paciente apresenta alguns sintomas, como odor genital desagradável, corrimento ou prurido na presença de agentes patogênicos, é necessário seguir a rotina de rastreamento citológico e buscar o tratamento médico adequado. A nomenclatura brasileira (INCA, 2012) incluiu a expressão “bacilos supracitoplasmáticos”, que significa a apresentação morfológica de agentes microbianos de difícil distinção pelo exame corado e fixado pela técnica citológica, portanto, são necessários outros testes complementares para identificar esses agentes. 73 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA Dessa forma, ficam estabelecidos os critérios da Nomenclatura Brasileira para Laudos Citopatológicos Cervicais (INCA, 2012) descrita a seguir. 5.5.9 Alterações em células escamosas Células atípicas de significado indeterminado • Escamosas (ASC): — possivelmente não neoplásicas (ASC-US da classificação de Bethesda); — não podendo excluir lesão intraepitelial de alto grau (ASC-H da classificação de Bethesda). • Glandulares (AGC): — possivelmente não neoplásicas; — não se pode afastar lesão intraepitelial de alto grau. • De origem indefinida: — possivelmente não neoplásicas; — não se pode afastar lesão intraepitelial de alto grau. Alterações em células escamosas • Lesão intraepitelial escamosa de baixo grau - LSIL (compreendendo efeito citopático pelo HPV e NIC grau 1). • Lesão intraepitelial escamosa de alto grau - HSIL (compreendendo NIC graus 2 e 3). • Lesão intraepitelial escamosa de alto grau, não podendo excluir microinvasão. • Carcinoma epidermoide invasor. Alterações nas células do epitélio glandular • Adenocarcinoma in situ. • Adenocarcinoma invasor (pode ser cervical, endometrial, sem outras especificações). 74 Unidade II Outras neoplasias malignas Presença de células endometriais (fora do período menstrual, na pós-menopausa ou acima de 40 anos). Microbiologia • Lactobacillus spp.; • Bacilos supracitoplasmáticos (sugestivos de Gardnerella spp./Mobiluncus spp.); • Outros bacilos; • Cocos; • Candida spp.; • Trichomonas vaginalis; • Sugestivo de Chlamydia spp.; • Actinomyces spp.; • Efeito citopático compatível com o grupo herpes; • Outros a especificar. Lembrete O método de rastreamento do câncer do colo do útero e de suas lesões precursoras é o exame citopatológico. Os dois primeiros exames devem ser realizados com intervalo anual e, se ambos os resultados forem negativos, os próximos devem ser realizados a cada três anos. O início da coleta deve ser aos 25 anos de idade para as mulheres que já tiveram ou têm atividade sexual. Os exames periódicos devem seguir até os 64 anos de idade e, nas mulheres sem história prévia de doença neoplásica pré-invasiva, devem ser interrompidos quando elas tiverem pelo menos dois exames negativos consecutivos nos últimos cinco anos (INCA, 2011a). Para mulheres com mais de 64 anos de idade e que nunca se submeteram ao exame citopatológico, cabe realizar dois exames com intervalo de um a três anos. Se ambos os exames forem negativos, essas mulheres podem ser dispensadas de exames adicionais (INCA, 2011a). 75 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA 6 ACHADOS ENCONTRADOS NO EXAME CITOPATOLÓGICO CÉRVICO-VAGINAL 6.1 Células escamosas atípicas As células da categoria ASC-US, quando são analisadas, sugerem alterações indicativas de lesão intraepitelial escamosa de baixo grau, porém, são quantitativa ou qualitativamente insuficientes para uma interpretação definitiva. Essas células apresentam núcleos com, aproximadamente, 2,5 a 3 vezes a área do núcleo de uma célula intermediárianormal. Geralmente, a relação entre núcleo e citoplasma é discretamente aumentada. Também pode apresentar hipercromasia nuclear e leves irregularidades na distribuição da cromatina ou na forma nuclear, como ilustra a figura a seguir. A primeira imagem, designada pela letra A, representa as células escamosas normais e a seta aponta uma célula intermediária. A imagem B representa a categoria ASC-US e uma das células intermediárias (indicada pela seta) apresenta núcleo hipercromático, aproximadamente 2,5 vezes maior que o núcleo da célula intermediária normal vizinha. A imagem C representa uma lesão intraepitelial escamosa de baixo grau; nessa figura, uma das células intermediárias (indicada pela seta) exibe um núcleo aumentado com três vezes o tamanho do núcleo da célula normal ao lado, hipercromasia e irregularidades da borda nuclear. A) B) C) Figura 15 - Comparação entre células escamosas maduras normais, ASC-US e lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (NIC 1/displasia leve) em esfregaço cervical As células da categoria ASC-H apresentam-se do tamanho de uma célula metaplásica com núcleos que podem ser de 1,5 a 2 vezes maiores que aqueles das células metaplásicas normais. Além disso, há um aumento do núcleo em relação ao citoplasma, que é bem maior do que em uma célula metaplásica normal e pode apresentar leve hipercromasia e irregularidade nuclear (BARROS et al., 2012). Na imagem a seguir, a figura A representa o esfregaço cérvico-vaginal de uma mulher com diagnóstico de ASC-H, em que as células do tipo metaplásico apresentam núcleos aumentados de volume, além de aumento da relação núcleo e citoplasma. Também há alteração da forma dos núcleos e leve hipercromasia nuclear (na seta podem ser visualizadas alterações degenerativas nucleares sobrepostas). Na imagem B, o esfregaço cérvico-vaginal apresenta células de origem metaplásica com aumento nuclear e aumento da relação núcleo e citoplasma, exibindo uma leve hipercromasia nuclear e uma discreta irregularidade da borda nuclear (indicado pela seta). 76 Unidade II A) B) Figura 16 – Características citológicas ASC-H 6.2 Células glandulares atípicas As células glandulares endocervicais atípicas de significado indeterminado provavelmente não neoplásico apresentam características citológicas importantes no esfregaço cérvico-vaginal, como a presença de núcleos aumentados e que podem ser de três a cinco vezes o tamanho do núcleo de uma célula endocervical normal, as células ficam agrupadas em placas ou tiras, havendo ainda aumento entre núcleo e citoplasma e leve hipercromasia nuclear. Entretanto, as células glandulares atípicas de significado indeterminado em que não se pode excluir lesão intraepitelial de alto grau, quando são analisadas, podem apresentar-se em agrupamentos celulares em camadas e rosetas. O citoplasma pode apresentar margens não tão bem definidas. Além disso, os núcleos estão aumentados e com hipercromasia, podendo encontrar mitoses (BARROS et al., 2012). Figura 17 – Células glandulares endocervicais atípicas. Esfregaço endocervical: aglomerado de células atípicas do tipo glandular com núcleos volumosos 77 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA Lembrete A Nomenclatura Brasileira para Laudos Cervicais estabeleceu as categorias diagnósticas de células glandulares atípicas de significado indeterminado possivelmente não neoplásicas e células glandulares atípicas de significado indeterminado em que não se pode excluir lesão intraepitelial de alto grau. Também definiu que, sempre que possível, deve-se mencionar a provável origem da atipia, seja endocervical, endometrial ou sem outras especificações, quando houver dificuldade para se determinar o sítio de origem das células atípicas. 6.3 Graduação das lesões cérvico-vaginais 6.3.1 Lesão intraepitelial escamosa de baixo grau Na lesão intraepitelial escamosa de baixo grau, as células escamosas superficiais e intermediárias observadas nos esfregaços cérvico-vaginais apresentam citoplasma abundante apesar das atipias nucleares. Além disso, também há boa maturação celular, os núcleos com mais de três vezes o tamanho do núcleo de células intermediárias normais, binucleação e multinucleação são comuns, assim como coilocitose, com cavidade perinuclear vazia circundada por citoplasma denso e nítido aumento do tamanho nuclear. Figura 18 - Lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL). Esfregaço cérvico-vaginal, coilócito eosinofílico típico, com halo perinuclear (seta) 78 Unidade II Saiba mais O documento indicado a seguir trata das diretrizes brasileiras para o rastreamento do câncer do colo do úero. Trata-se de uma leitura de grande importância. INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER (INCA). Coordenação Geral de Ações Estratégicas. Divisão de Apoio à Rede de Atenção Oncológica. Diretrizes brasileiras para o rastreamento do câncer do colo do útero. Rio de Janeiro: Inca, 2011. Disponível em: http://189.28.128.100/dab/docs/publicacoes/ geral/diretrizes_rastreamento_cancer.pdf. Acesso em: 31 maio 2020. 6.3.2 Lesão intraepitelial escamosa de alto grau (NIC 3/carcinoma in situ) A lesão intraepitelial escamosa de alto grau acomete as células mais profundas (intermediárias, parabasais e basais) do epitélio estratificado pavimentoso não queratinizado. Essas células podem ser observadas no esfregaço cérvico-vaginal isoladas em grupos ou agregados tipo sincício. Além disso, podem apresentar células parabasais com núcleo aumentado, contornos nucleares irregulares, com anisocariose e anisocitose em uma população homogênea de células. Quando observadas do ponto de vista citológico, são caracterizadas por apresentar células do tipo metaplásico imaturas ou que parecem com as células de reserva, células ovais ou redondas. Há um aumento em relação a núcleo e citoplasma e também um aumento do volume nuclear, além de irregularidades marcadas na borda do núcleo e citoplasma delicado, denso ou queratinizado, com presença de pequenos vacúolos. Figura 19 – Lesão intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL). Esfregaço cérvico-vaginal, presença de células parabasais com núcleo aumentado e contornos irregulares 79 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA 6.4 Neoplasias malignas cérvico-vaginais 6.4.1 Carcinoma escamoso (epidermoide) invasor A evolução do carcinoma escamoso ocorre a partir de etapas precursoras. Por exemplo, a lesão intraepitelial escamosa de baixo grau pode progredir com o tempo para lesão intraepitelial escamosa de alto grau, e, finalmente, as células neoplásicas podem romper a membrana basal invadindo o estroma subjacente e, consequentemente, evoluindo para o carcinoma invasivo. Entretanto, essas etapas não são necessariamente obrigatórias, e alguns tumores parecem não se iniciar como lesões de baixo grau, mas acabam evoluindo desde o início de lesões de alto grau. O quadro a seguir mostra as características citológicas apresentadas entre o carcinoma in situ e o carcinoma escamoso invasivo em uma amostra cérvico-vaginal. Quadro 2 – Principais características citológicas encontradas no carcinoma in situ e carcinoma escamoso invasivo Anormalidades Carcinoma in situ Carcinoma escamoso invasor Citoplasma Mais escasso Mais abundante Núcleo Aumentado + Aumentado ++ Cromatina Regular Irregular Nucléolo Ausente Frequente Diátese Ausente Presente Fonte: Barros et al. (2012, p. 143). O carcinoma escamoso (epidermoide) invasor acomete todas as células epiteliais, normalmente em abundância no esfregaço cérvico-vaginal. Além disso, essas células podem descamar sozinhas ou em arranjos (sincícios), apresentando tamanho variável, com seu formato ovalado, esférico, alongado ou bizarro. Os citoplasmas normalmente configuram uma coloração cianofílica e às vezes eosinofílica. Os núcleos adaptados ao formato da célula e a cromatina densa, hipercromática e grosseiramente granular são critérios da malignidade da amostra. A membrana nuclear espessa e com deposição de cromatina e os nucléolos estão presentes. A presençade mitoses atípicas pode ser vista na amostra, também podem ser evidenciados inflamação acentuada e material necrótico, como: sangue, fibrina, células inflamatórias, restos celulares, material proteináceo denominado diátese tumoral, que é uma característica do carcinoma invasivo (LIMA, 2012). 80 Unidade II Figura 20 – Carcinoma escamoso (epidermoide) invasor. Esfregaço cérvico-vaginal, presença de células malignas pleomórficas isoladas ou em aglomerados pouco coesos Figura 21 – Carcinoma escamoso invasor. Esfregaço cérvico-vaginal, presença de células malignas pleomórficas, isoladas ou agrupadas e às vezes queratinizadas ou necróticas, com formas bizarras (seta) 6.4.2 Adenocarcinoma endocervical in situ O adenocarcinoma in situ ocorre em células endocervicais (epitélio cilíndrico simples) causando alterações nessas células, mas sem invasão tecidual. Quando é analisado o esfregaço cérvico-vaginal, observa-se que as células apresentam formato cuboides ou ainda paliçadas (tiras ou arranjos) em aglomerados, às vezes sobrepostas como rosetas ou arranjos glandulares que correspondem aos conjuntos circulares de células com núcleos periféricos e citoplasma voltado em direção ao centro. A perda do padrão em favo de mel é evidente e raramente encontramos células anormais isoladas. Contudo, ocorre aumento da celularidade na forma de amplos agrupamentos epiteliais e o citoplasma das células é cianofílico e mal definido. Os núcleos são hipercromáticos e volumosos, com variação de tamanho e muitas vezes apresentam cromatina granular, com nucléolo único ou ausente. Além disso, possuem as bordas franjadas (plumagem) devido à protrusão nuclear (LIMA, 2012). 81 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA Figura 22 – Adenocarcinoma in situ. Esfregaço cérvico-vaginal, presença de células endocervicais atípicas com forma colunar preservada, núcleos volumosos e alongados, com cromatina densa, formando uma roseta 6.4.3 Adenocarcinoma endocervical invasivo O exame histopatológico é fundamental para distinguir o adenocarcinoma in situ do adenocarcinoma invasivo, principalmente no caso de dúvida. Entretanto, existem algumas características do adenocarcinoma invasivo importantes que são observadas nos esfregaços: pleomorfismo nuclear, bordas nucleares espessas e irregulares, cromatina irregularmente distribuída, presença de nucléolos mais proeminentes e diátese tumoral (quando presente indica invasão). Contudo, as células apresentam uma formação arquitetural paliçada ou colunar das células endocervicais (epitélio cilíndrico simples) e podem apresentar aglomerados papilar ou glandular; mitoses são mais frequentes. O citoplasma claro pode apresentar vacúolos discretos e escassos (BARROS et al., 2012). Figura 23 – Adenocarcinoma invasor. Esfregaço cérvico-vaginal, presença de células colunares atípicas, dispostas em agregados irregulares. Enorme desorganização e dispersão celular 82 Unidade II 6.4.4 Adenocarcinoma endometrial O adenocarcinoma endometrial ocorre predominantemente em mulheres pós-menopausadas, com incidência entre 55 e 65 anos de idade. Os principais fatores de risco estão relacionados à obesidade, infertilidade, diabete e prolongado estímulo estrogênico. Entre as mulheres diagnosticadas com adenocarcinoma endometrial, aproximadamente 90% delas apresentam sangramento (BARROS et al., 2012). O adenocarcinoma endometrial acomete as células endometriais (epitélio cilíndrico simples). As características citológicas do adenocarcinoma endometrial observado no esfregaço são células isoladas ou distribuídas em pequenos conjuntos, citoplasma escasso, cianofílico e vacuolizado. Também pode haver variação do tamanho nuclear, perda da polaridade nuclear, hipercromasia moderada com a cromatina irregularmente distribuída, podendo ainda ser evidenciada a presença de nucléolos, que é proporcional ao aumento do grau da lesão. Contudo, em cerca de um terço dos casos pode ser vista a presença de diátese tumoral (BARROS et al., 2012). A figura a seguir representa o esfregaço cérvico-vaginal de uma mulher com diagnóstico de adenocarcinoma de endométrio, podendo-se observar um grupo de células glandulares atípicas, quando comparamos com as células endocervicais normais (no pontilhado). Figura 24 – Adenocarcinoma endometrial Observação O resultado de AIS (adenocarcinoma in situ) no espécime de excisão indica a histerectomia simples, exceto nas pacientes com prole incompleta, para as quais a conização poderá ser considerada suficiente. Na eventualidade de margens comprometidas no espécime cirúrgico e mulher com prole completa, uma nova excisão deverá ser realizada, sempre que possível, para excluir doença invasiva. No diagnóstico de câncer, a mulher deve ser encaminhada para unidade terciária (alta complexidade). 83 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA 6.5 Outros métodos diagnósticos complementares à citopatologia cérvico-vaginal 6.5.1 Citologia em meio líquido A citologia em meio líquido é uma metodologia desenvolvida na década de 1990 para realização de exames citopatológicos com o intuito de rastrear o câncer do colo do útero. Essa técnica surgiu para resolver algumas limitações da citologia convencional, como sobreposição celular ou baixa representatividade celular no esfregaço, causadas por uma coleta inadequada ou até mesmo amostra insuficiente. Diante disso, foi desenvolvido um sistema que retém apenas as células epiteliais e remove artefatos, sangue ou muco. Consequentemente, essa metodologia aumenta a sensibilidade, a especificidade e melhora a eficiência no manejo de amostras e também a produtividade do laboratório. Outro aspecto importante é a possibilidade de realizar testes complementares, como de biologia molecular, no mesmo material encaminhado para o estudo citológico. O procedimento técnico da citologia em meio líquido consiste na suspensão e na centrifugação de células provenientes do material coletado em líquido fixador, obtendo-se uma fina camada de células sobre a lâmina. Com menor quantidade de matriz de fundo, a citologia em meio líquido também foi chamada de citologia de monocamada ou camada fina. As principais vantagens são: melhor preservação celular e distribuição das células analisadas; redução da quantidade de muco, exsudato inflamatório e hemácias; diminuição do tempo de leitura; possibilidade de se repetir o teste da amostra sem a necessidade de coletar uma nova amostra; utilização para testes de biologia molecular para vírus como o HPV, Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae, entre outros microrganismos patogênicos; e diminuição do número de amostras insatisfatórias para avaliação. As desvantagens são o alto custo de equipamentos, manutenção e treinamento técnico. Novas tecnologias na citologia em meio líquido permitem métodos não automatizados como liqui-prep e gel hidroalcoólico, entre outros, além de métodos automatizados como o ThinPrep (Hologic, Inc.), BD SurePath (Becton, Dickinson and Co.) e GynoPrep (THARMAC GmbH), que permitem padronização da coleta das amostras, coloração e preparo da lâmina. Dessa forma, há um excelente controle de qualidade dos testes (BARROS et al., 2012). ThinPrep (Pap test) O método ThinPrep (Pap test), em português “preparado fino”, é um exame de Papanicolau em que, logo após a coleta da amostra cérvico-vaginal (através do uso de uma escova para coletar as células presentes dentro do canal endocervical e de uma espátula para coletar células da ectocérvice), as células são colocadas em um frasco de meio líquido preservante e depois são homogeneizadas. Posteriormente, é realizado o preparo da lâmina microscópica da citologia em base líquida, que pode ser feita com equipamentos semiautomatizados (ThinPrep Processor 2000) ou completamente 84 Unidade II automatizados (ThinPrep Processor 5000/5000 Auto Loader). Depois, há um processo de filtragem do líquido para impedir que artefatos, hemácias, células inflamatórias e elementos de obscurecimento sejam transferidospara a lâmina. No final, temos a transferência do material em uma única camada fina de células. Figura 25 – Representação da lâmina citológica obtidas através do método ThinPrep SurePath (BD Sure Path Pap test) BD SurePath (Prep Mate e Prep Stain) são equipamentos automatizados que permitem o processamento e a coloração das amostras cervicais. Mas, antes de processar a amostra, é necessário utilizar um kit de coleta contendo uma escova endocervical específica que, após a coleta da amostra cérvico-vaginal, é colocada em um recipiente com líquido preservante, que mantém as células por um mês sem refrigeração, em temperatura ambiente (15 ºC a 30 ºC), ou por seis meses em temperatura de 2 ºC a 8 ºC. Depois de fazer a coleta, utiliza-se o equipamento PrepMate que automatiza o processo de enriquecimento inicial da mistura e distribuição da amostra; posteriormente, a coloração da lâmina é realizada pelo equipamento automatizado PrepStain. No fim, obtemos resultados padronizados e de alta qualidade na citologia em meio líquido. Ele proporciona alta produtividade processando 96 lâminas não coradas a cada 64 minutos e 48 lâminas coradas a cada 60 minutos. Após esse tempo, a lâmina pronta já pode ser analisada. 85 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA Figura 26 – Representação da lâmina citológica obtidas através do método BD SurePath™ A leitura automatizada para o rastreamento de alterações do colo de útero é realizada através do sistema BD FocalPoint GSImaging System e BD FocalPoint GS Review Station. Por meio de um computador, todas as imagens das células das lâminas são digitalizadas, avaliadas e quantificadas em algoritmos que identificam tanto alterações em células escamosas como em glandulares, atribuindo uma pontuação (0,0 a 1,0). O equipamento também armazena todos os dados das lâminas e depois localiza e indica os locais com anormalidade significativa. Rastreando 240 lâminas em 24 horas, trata-se de um método eficaz que aumenta a exatidão do exame. 6.5.2 Reação de cadeia de polimerase (PCR) A maioria das técnicas utilizadas na rotina clínica consegue diagnosticar as lesões cervicais, no entanto, não permitem detectar a presença do vírus. Para determinar o genótipo do vírus são necessários outros métodos complementares, como reação em cadeia da polimerase (PCR), hibridização in situ, captura híbrida e citometria de fluxo, entre outros. O método de PCR foi criado em 1983 por Kary Mullis. Representa uma técnica de biologia molecular in vitro que gera um milhão de cópias a partir de uma única molécula de DNA, na presença da enzima DNA polimerase após amplificação de 30 ciclos. A reação de PCR se baseia no anelamento e na extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos utilizados como iniciadores (primers) que delimitam a sequência de DNA de fita dupla alvo da amplificação. O avanço das técnicas de biologia molecular permitiu o conhecimento dos genomas de muitos tipos de HPVs, e o método de PCR mostra-se excelente e o mais sensível para a identificação da genotipagem do vírus existente nas amostras cérvico-vaginais, auxiliando na resolução do diagnóstico citopatológico e histopatológico das lesões precursoras do câncer do colo de útero e proporcionando um tratamento mais apropriado para cada paciente. 86 Unidade II 6.5.3 Captura híbrida A Captura Híbrida 2 (CH2) é o método molecular utilizado para a detecção de HPV. Essa técnica baseia-se na hibridização de DNA do HPV em questão com sondas de RNA específicas contra os tipos de HPV considerados de baixo risco e alto risco oncogênico em amostras cérvico-vaginais. Após a desnaturação, há a hibridização, captura dos híbridos, reação dos híbridos com o conjugado e, posteriormente, a detecção dos híbridos através de quimioluminescência (BAGARELLI; OLIANI, 2004). Quando o resultado da captura híbrida for negativo e as técnicas de PCR apresentarem resultado positivo, deve-se considerar o resultado da PCR, pois as técnicas de PCR são realizadas com iniciadores (primers) específicos para a detecção dos tipos de HPV de baixo e alto risco (RODRIGUES et al., 2009). 6.5.4 Imuno-histoquímica A técnica de imuno-histoquímica é realizada através da reação antígeno-anticorpo, e a detecção pode se dar pelo método direto ou indireto. O método direto detecta um anticorpo marcado conjugado que reage com o antígeno que está presente na amostra do tecido através da detecção do cromógeno por meio da enzima catalizadora que está ligada ao anticorpo. Já no método indireto, um anticorpo primário não marcado reage com o antígeno presente no tecido de um segundo anticorpo ligado a uma enzima catalizadora, se liga ao complexo primário, resultando em um tecido marcado com a coloração específica do cromógeno (CAPELOZZI, 2009). Histologicamente o condiloma imaturo é uma lesão que ocorre devido à proliferação de células escamosas imaturas com atipia citológica e está a associada à infecção pelo HPV, geralmente pelos tipos de HPV de baixo risco, 6 e 11. A definição diagnóstica de condiloma imaturo é dada pelo estudo histopatológico, muitas vezes sendo necessários testes complementares como a imuno-histoquímica para os marcadores p16 e CK 17 (BARROS et al., 2012). Alguns estudos demonstraram o uso de marcadores p16 e Ki-67 para auxíliar no diagnóstico histopatológico e como marcadores prognósticos das lesões intraepiteliais do colo uterino. Além disso, sugerem que p16 melhora a concordância diagnóstica de NIC 2 ou lesões mais graves, mas não obtém o mesmo resultado de forma significativa na categoria de NIC 3 ou lesões mais graves (REUSCHENBACH et al., 2014). Resumo O câncer de colo de útero é uma doença que atinge muitas mulheres em todo o mundo, com incidência elevada em países menos desenvolvidos. No Brasil representa um grande problema de saúde pública. A doença tem uma evolução lenta e assintomática, e a principal causa é a infecção pelo HPV. Na perspectiva de diminuir a incidência e a mortalidade pelo câncer de colo do útero, o Ministério da Saúde implantou programas voltados à saúde da mulher com foco na prevenção do câncer do colo uterino, através 87 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA de diagnóstico precoce e a profilaxia, com a vacina contra HPV inserida no calendário nacional de vacina para os jovens. Para o rastreamento das lesões precursoras do colo do útero e prevenção, o principal método utilizado é o exame de Papanicolau. Esse método consiste em analisar as células provenientes da ectocérvice (células escamosas superficiais, intermediárias, parabasais e basais) e da endocérvice (células endocervicais e endometriais) do colo uterino, particularmente da nova junção escamocolunar (células metaplásicas), pois esse é o local em que se origina a maioria das neoplasias. O exame citopatológico depende de uma boa técnica de coleta, na qual todos os epitélios devem estar representados, fixados, corados e com adequada quantidade de células na amostra. Além disso, o recebimento e o processamento da amostra devem ser realizados com qualidade, para que se possa ter uma boa interpretação das alterações citopatológicas. Dessa maneira, é possível detectar não somente lesões precursoras e câncer, mas também auxiliar na detecção de infecções sexualmente transmissíveis. Uma das principais queixas em consultas ginecológicas é a vulvovaginite, uma inflamação no trato genital feminino que pode ocasionar, por exemplo, a candidíase, a vaginose bacteriana, causada por Gardnerella vaginalis, e a tricomoníase, causada pelo protozoário Trichomonas vaginalis. É de extrema importância para o estudante da área o conhecimento e a diferenciação sobre as células, identificando corretamente a presença de agentes microbiológicos nas amostras. O exame preventivo do Papanicolau é essencial, pois ajuda no rastreamento do câncer do colo de útero, sendo importante na detecção das alterações citopatológicas e favorecendo um diagnóstico precoce e tratamento adequado. Além disso, é necessário conscientizaras mulheres com ações educativas e programas de prevenção para mostrar a importância de fazer o exame regularmente, visto que um diagnóstico precoce aumenta a probabilidade de cura. Exercícios Questão 1. (Enade 2016) No diagnóstico clínico-molecular, a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real pode ser utilizada para a avaliação da carga viral ou bacteriana, para a determinação da resistência a antibióticos e, até mesmo, para o prognóstico de tumores malignos. A figura seguinte apresenta ciclos de amplificação de amostras por PCR em tempo real, sendo (A) uma amplificação de um determinado segmento gênico que identifica um determinado marcador tumoral em células neoplásicas e (B) uma amplificação do mesmo segmento gênico em células não neoplásicas. 88 Unidade II 403632282420161284 383430262218141062 393531272319151173 37332925211713951 0,0 0,6 1,2 0,2 Threshold Ciclos (A) (B) Fl uo re sc ên ci a 0,8 1,4 0,4 1,0 1,6 Figura 27 A partir das informações apresentadas, conclui-se que: A) O Ct (ciclo threshold) pode ser determinado pela intersecção da linha do limiar de detecção da reação threshold com a linha da amplificação gênica de cada amostra. B) O aumento da fluorescência indica que a amplificação da sequência alvo está ocorrendo, pois a cada ciclo, durante a desnaturação da dupla fita, ocorre liberação da fluorescência. C) A linha paralela ao eixo referente ao número de ciclos, na altura em que se inicia a fase exponencial da amplificação gênica, denominado threshold, representa falsos sinais positivos por contaminação das amostras por DNA genômico. D) A análise comparativa das duas amostras deve ser realizada a partir da estabilização da amplificação, que ocorre na fase platô, sendo alcançada no ciclo 28 para a amostra A, e no ciclo 40, para a amostra B. E) O maior Ct (26) é observado no início da fase exponencial de amplificação em células não neoplásicas (B) e indica maior expressão comparativamente às células neoplásicas (B), que apresentam Ct = 17, não sendo esta sequência alvo um bom marcador tumoral. Resposta correta: alternativa A. Análise das alternativas A) Alternativa correta. Justificativa: o Ct marca o ciclo a partir do qual a fluorescência pode ser detectada acima da fluorescência de ruído. Portanto, para se obter o Ct em um gráfico de fluorescência emitida versus o número de ciclos, é necessário observar em qual ciclo, no eixo x, o valor da fluorescência atingiu o limiar (eixo y), ou seja, a partir de qual ciclo a fluorescência detectada pelo equipamento pode ser considerada 89 CITOPATOLOGIA E CITOLOGIA CLÍNICA inequivocamente originária das sequências de DNA amplificadas durante a reação. Na alternativa, o valor limiar de fluorescência (eixo y) é denominado “linha do limiar de detecção da reação threshold” (o que é uma redundância, uma vez que a tradução do termo threshold é exatamente “limiar”). O número de ciclos de PCR (eixo x) é denominado “linha da amplificação gênica de cada amostra”. B) Alternativa incorreta. Justificativa: para que haja emissão da fluorescência, não é necessário que ocorra desnaturação da dupla fita, mas somente a incorporação de fluoróforos à fita complementar sintetizada pela Taq polimerase. C) Alternativa incorreta. Justificativa: a linha paralela ao eixo referente ao número de ciclos, na altura em que se inicia a fase exponencial da amplificação gênica, é denominada limiar ou threshold e indica o valor de fluorescência a partir do qual é possível detectar sinais específicos, ou seja, acima do ruído de fundo e, portanto, sinais referentes à fluorescência emitida pelos fragmentos de DNA amplificados durante a reação. D) Alternativa incorreta. Justificativa: a análise comparativa das duas amostras deve ser realizada durante a fase log, ou fase exponencial, que ocorre a partir do ciclo 17 até o ciclo 26 na amostra A e a partir do ciclo 26 até o ciclo 37 na amostra B. E) Alternativa incorreta. Justificativa: o maior Ct (26) é observado no início da fase exponencial de amplificação em células não neoplásicas (B) e indica menor expressão do gene alvo em comparação às células neoplásicas (Ct=17). Lembre-se de que quanto menor o Ct, maior o número de sequências alvo na amostra original. Questão 2. (Iades 2016) Acerca da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), assinale a alternativa correta. A) Três ciclos de reação produzem oito cópias da sequência alvo de DNA, quatro das quais possuem os mesmos comprimentos e correspondem exatamente a uma ou outra fita da sequência original. As outras fitas contêm DNA extra que está além da sequência original, replicado nos primeiros ciclos. B) O molde original para a reação de PCR pode ser tanto DNA ou RNA, de modo que tanto uma cópia de DNA genômico quanto um cDNA pode ser obtido por PCR. C) A técnica de PCR vem sendo atualmente substituída pela utilização de anticorpos contra proteínas da capa viral para detectar a presença de infecções virais em amostras humanas, devido ao fato de esta última compreender um método de detecção mais sensível. 90 Unidade II D) A amplificação de qualquer sequência de DNA pela técnica de PCR requer que as amostras biológicas estejam bastante preservadas, inviabilizando a realização do teste em amostras muito antigas, como fósseis. E) A PCR é uma técnica muito sensível e tem diversas aplicações em biologia, inclusive na medicina forense. Uma de suas vantagens é que a polimerase amplifica segmentos de DNA confiáveis, mesmo em grandes segmentos (maiores que 2 Kb), fazendo com que essa técnica seja amplamente utilizada na identificação da impressão digital de DNA. Resposta correta: alternativa B. Análise das alternativas A) Alternativa incorreta. Justificativa: três ciclos de reação produzem oito cópias da sequência alvo de DNA, porém os comprimentos não são iguais. A replicação é semiconservativa, em que uma fita é o molde (antiga) que irá formar a fita nova. B) Alternativa correta. Justificativa: a Reverse Transcriptase-PCR (rtPCR) utiliza RNA como molde e a enzima Transcriptase reversa, capaz de sintetizar o chamado DNA complementar (cDNA), que será posteriormente amplificado. C) Alternativa incorreta. Justificativa: as reações enzimáticas vêm sendo substituídas pelas moleculares, como a técnica de PCR, que utiliza anticorpos contra proteínas da capa viral para detectar a presença de infecções virais em amostras humanas devido ao fato de esta última compreender um método de detecção mais sensível. D) Alternativa incorreta. Justificativa: os marcadores STR, por exemplo, têm justamente a vantagem de conseguir amplificar amostras mais degradadas pelo curto comprimento do fragmento de análise. E) Alternativa incorreta. Justificativa: uma das limitações da Taq polimerase é que ela só amplifica fragmentos menores que 2kb (2.000 pares de base).