imunofluorescencia direta

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IMUNOFLUORESCÊNCIA 
INDIRETA APLICADA A DOENÇAS 
COM MANIFESTAÇÕES ORAIS
ISABELLA, LYVIA, VICTOR, ANNA TEREZA, MATHEUS, MARCELO, NATALIA E MANUELA
• A descoberta da fluorescência e atribuída a Nicolas Monardes 
• A descrição da opalescência azul surgiu a partir de uma infusão 
de agua e da madeira de uma pequena arvore mexicana 
Microscópio de luz fluorescente: 
• É uma variação do microscópio de luz ultravioleta no qual os 
objetos são iluminados por raio de um determinado comprimento 
de onda
HISTÓRICO:
• Conjunto de fibras óticas: 
• Filtro de excitação seleciona os comprimentos de onda para 
excitar um corante em particular 
• Desviador de feixe dicroico reflete a luz na banda de excitação e 
transmite a luz na banda de emissão iluminação epifluorescencia. 
• Filtro de emissão: controle de qualidade, deixando passar apenas 
comprimentos de onda relevantes emitidos pelo fluocromo.
• A imunofluorescência é uma técnica que permite a detecção e 
localização de antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos 
específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a localização 
dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência. 
• Fluorocromos são moléculas reveladoras que têm a propriedade de 
absorver luz e, quando excitados por uma fonte de luz ultravioleta 
(UV) emitem luz visível (ficam fluorescentes), sendo os mais 
utilizados: 
• Isotiocianato de 
fluoresceína (FITC) 
• Rodamina (TRICT)
O QUE É:
• Técnica de camada simples; 
• É colocado apenas um 
anticorpo e esse é 
conjugado ao fluorocromo, 
ou seja, o antígeno é 
detectado diretamente pelo 
anticorpo primário.
• Técnica de dupla camada; 
• Nessa modalidade de 
imunofluorescência, além do 
anticorpo primário é colocado 
um anticorpo secundário, e 
esse anticorpo secundário está 
conjugado a um fluorocromo, 
ou seja, o antígeno é 
detectado indiretamente.
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
DIRETA (IFD): 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
INDIRETA (IFI): 
• A técnica utilizada na detecção de anticorpos no soro do paciente por 
meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual; 
1. Aplica primeiramente o soro com anticorpos específicos não 
fluorescentes (anticorpo primário); 
2. O anticorpo se liga ao antígeno; 
3. Coloca-se o soro com anticorpos fluorescentes conjugados aos 
fluorocromos (anticorpo secundário); 
4. Por fim, os fluorocromos são excitados por uma fonte de luz ultravioleta 
(UV), emitem luz no espectro visível. Como estão ligados ao anticorpo, 
quando ocorre a reação com o antígeno, é possível a observação da 
reação do complexo imune ao microscópio de fluorescência. 
A IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA 
• É um tipo de microscópio capaz de energizar a amostra, que está 
marcada com anticorpos conjugados a moléculas fluorescentes, 
de captar a luz emitida pela a amostra, tornando assim o resultado 
visível aos olhos.
MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA
• A técnica de IFI utiliza como substrato o epitélio normal. Os 
substratos variam de acordo com os protocolos de cada 
laboratório, sendo o mais utilizado a pele normal humana obtida 
de prepúcio, mama ou pálpebra. Porém pode ser utilizado: 
epitélio de esôfago de macaco ou murinos. 
• IFI tem representado um importante auxílio diagnóstico nas 
doenças autoimunes com repercussão bucal (pênfigos e 
penfigoides) e em outras doenças inflamatórias importantes 
(lúpus eritematoso sistêmico, vasculites e líquen plano).
CONCEITO
• Imunofluorescência: método de identificação de 
material antigênico de natureza bacteriana, virótica ou 
de outra origem em que se empregam anticorpos 
marcados com fluoresceína. 
• Antigeno: substancia que ao ser introduzida no 
organismo provoca a formação de anticorpos.
PESQUISA DE ANTÍGENOS
• Para a detecção de um antígenos, é importante seguir 
os seguintes passos: 
• Incubação do tecido no qual se quer pesquisar o 
antígeno com o anticorpo específico obtido 
(Ac monoclonal - Os pesquisadores podem projetar anticorpos que têm como alvo 
especificamente um determinado antígeno. A partir daí são feitas várias cópias desse 
anticorpo em laboratório, o que são denominados anticorpos monoclonais) 
• Levando à formação de um imunocomplexo 
(Ag e Ac se ligam formando cadeias insolúveis) 
• Lavagem para retirada do excesso de anticorpos não 
ligantes excedentes.
• A preparação é incubada com anticorpos marcados 
com fluorocromos (componente de uma molécula que 
faz com que esta seja fluorescente), específicos para o 
anticorpo monoclonal; 
• Mais uma lavagem é realizada.
• Visualização no microscópio fluorescente. 
• A visualização se da pela ligação dos antígenos 
presentes com os anticorpos monoclonais, formando 
um complexo com os anticorpos marcados
• O QUE SÃO ANTICORPOS: 
• ele são produzidos pelo sistema imunológico, são proteínas 
(imunoglobulinas) que protegem as pessoas contra invasores 
microscópicos como vírus, bactérias, substâncias químicas e toxinas. 
Cada anticorpo produzido reconhece uma estrutura específica de uma 
célula ou partícula invasiva. A estrutura específica reconhecida é chamada 
antígeno. Os anticorpos se ligam aos antígenos, criando complexos 
antígeno-anticorpo (complexos imunes), que servem de sinal para a 
destruição do antígeno pelo sistema imunológico. As ações imunológicas 
que envolvem a ligação antígeno-anticorpo podem ser visualizadas ou 
quantificadas por meio de diferentes marcadores para o antígeno ou para 
o anticorpo. Os exames de anticorpos envolvem a análise de uma 
amostra (geralmente sangue) para mostrar a presença de um anticorpo 
(exame qualitativo) ou para medir a quantidade de um anticorpo (exame 
quantitativo).
PESQUISA DE ANTICORPOS
CLASSIFICAÇŌES
• Existem cinco classes diferentes de imunoglobulinas (IgM, IgG, 
IgE, IgA e IgD). As três imunoglobulinas investigadas com maior 
frequência em exames são IgM, IgG e IgE. Os anticorpos IgM e 
IgG têm ação conjunta na proteção imediata e a longo prazo 
contra infecções e os anticorpos IgE estão associados a alergias.
EXAMES DE IGM E IGG
• O exame sorológico de IgG e IgM serve para detectar o estágio 
de diversas doenças, entre elas a toxoplasmose, rubéola e a 
infecção pelo citomegalovírus e seus resultados podem ser os 
seguintes: 
• IgG negativo (não reagente) e IgM negativo (não reagente): 
nunca entrou em contato com o patógeno (nunca teve a doença 
ou nunca tomou vacina) e está susceptível a ter a doença; 
• IgG negativo e IgM positivo: infecção aguda (dias, semanas); 
• IgG positivo (reagente) e IgM positivo (reagente): infecção 
recente (semanas ou meses); 
• IgG positivo e IgM negativo: infecção antiga (meses ou anos) ou 
sucesso da vacina; a pessoa está protegida para essa doença.
ELISA
• ELISA ou Ensaio de Imunoabsorção Enzimática é um teste 
imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos específicos 
(por exemplo, no plasma sanguíneo). Este teste é usado no diagnóstico 
de várias doenças que induzem a produção de imunoglobulinas, entre 
outras. Neste teste, é necessário fixar o antígeno a uma superfície 
sólida, e então ligar ao antígeno um anticorpo ligado a um marcador 
enzimático. A detecção se completa ao analisar a presença do 
marcador depois de lavar os poços, que - no caso da detecção 
enzimática - vai mudar a coloração do substrato cromogênico 
adicionado a placa de teste.
• O método utilizado para realizar o teste baseia-se na interação 
antígeno-anticorpo. Geralmente, o ELISA é realizado em placas 
com 96 poços, onde são ligados antígenos, diretamente, ou 
indiretamente, por meio de um anticorpo já selecionado e 
ligado ao poço. É essa ligação e imobilização dos reagente 
que permite que o ELISA fique mais fácil de se realizar. O fato 
de imobilizar os reagentes na placa torna fácil separar os 
materiais que foram fixados e os que não foram durante o 
teste. E essa possibilidadede lavar materiais é o que torna o 
ELISA uma ferramenta poderosa de medição de um composto 
específico com uma preparação básica.
TIPOS DE TESTES
• O ELISA pode ser feito com inúmeras modificações do procedimento básico. 
O passo crucial, fixar o antígeno, pode ser realizado por adsorção direta ou 
indireta por meio de um anticorpo de captura. O antígeno pode ser 
detectado, também, diretamente, pelo anticorpo primário, ou indiretamente, 
pelo anticorpo secundário.
ELISA DIRETO: 
• Corresponde ao procedimento básico do ELISA, ou seja, não utiliza 
anticorpos de captura ou alvos de competição. Basicamente 
corresponde as etapas de: adição de amostra tamponada a placa de 
teste; posterior adição de anticorpo primário acoplado a enzima e 
adição de substrato cromogênico. Dessa forma, conclui-se que a 
denominação de ELISA direto se refere somente a utilização de um 
anticorpo primário, que marca o antígeno diretamente.
ELISA INDIRETO: 
• Faz o uso de dois anticorpos: o anticorpo primário e o anticorpo 
secundário.  Primeiramente, a amostra é preparada com o anticorpo 
primário, que possui especificidade com o antígeno a ser detectado. 
Caso o antígeno a ser procurado esteja presenta na amostra, o 
anticorpo primário irá se ligar ao seu alvo. Em seguida, haverá uma 
lavagem para retirar os anticorpos que não se ligaram ao antígeno 
teste. A seguir, coloca-se os antígenos secundários que possuem 
especificidade apenas para os anticorpos primários. Caso os anticorpos 
primários tenham se ligado ao antígeno, haverá ligação entre anticorpo 
primário e anticorpo secundário e isso que irá permitir a detecção. 
Dessa forma, a característica marcante do ELISA indireto é a utilização 
de anticorpos secundários para um maior nível de especificidade do 
teste.
ELISA SANDUICHE: 
• Um dos formatos mais eficazes é o sanduíche, que é chamado assim 
pois o antígeno fica entre dois anticorpos, o de captura e o de detecção, 
e é usado por ser robusto e sensível ao mesmo tempo.[ Nesse tipo de 
ELISA, primeiramente são ligados ao fundo do placa de teste os 
anticorpos de captura, impedindo que haja outros pontos de ligação 
fortes para o antígeno, é adicionada a amostra de interesse, e caso 
exista antígeno específico procurado, este se liga aos anticorpos de 
captura. Em seguida é feita uma lavagem para a retirada de antígenos 
que não se ligaram aos anticorpos de captura. Posteriormente, são 
adicionados a amostra os anticorpos conjugados a enzima, que farão o 
reconhecimento da presença do antígeno. A seguir é feita uma segunda 
lavagem para a retirada dos anticorpos conjugados que não se ligaram 
a amostra e, por fim, é adicionado o substrato que reagem com a 
enzima, que promove a mudança de cor ou fluorescência.
ELISA POR COMPETIÇÃO: 
• Nesse formato, junto com a amostra é adicionado antígeno semelhante 
ao que se procura nela, mas com o marcador (enzima). Assim, na 
amostra, antígeno com marcador - adicionado artificialmente - e 
antígeno sem marcador - procurado no teste - irão competir pelos 
anticorpos de captura. Na fase de detecção, após a lavagem da amostra 
e retirada dos antígenos que não se ligaram aos anticorpos de captura 
presentes na placa, se o sinal (mudança de cor) estiver reduzido 
significa que antígenos procurados no teste se ligaram, comprovando 
sua presença em grande concentração na amostra. Entretanto, se a 
mudança de cor for acentuada, é menor a concentração do antígeno 
teste, que competitivamente não conseguiu se ligar aos anticorpos de 
captura.
• Devido, principalmente à subjetividade de leitura, impossibilidade 
de automação e a necessidade do microscópio de fluorencência, 
essa técnica está cada vez menos sendo utilizada, e está sendo 
substituida por testes imunoenzimáticos. 
• Imunofuorescência direta: Possibilita a detecção de vírus, 
parasitas, antígenos de tumor em amostras clínicas, por meio de: 
fezes, urina, secreções. Utilizando um anticorpo marcado com 
fluorocromos. 
MODALIDADES
VANTAGENS: 
• Alta especificidade; 
• Possibilita a detecção de proteínas intracelulares e de sua localização; 
DESVANTAGENS: 
• Alto custo do microscópio de fluorescência; 
• Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja 
identificar ou localizar; 
• Subjetividade da leitura
Imunofluorescência indireta: 
• É utilizada para detecção de várias doenças infecciosas, 
como aids, as hepatites e complexos em doenças auto-
imunes. Esse teste é feito no soro do paciente por meio 
de antígenos fixados em uma lamina.
VANTAGENS: 
• Sensibilidade; 
• Especificidade; 
• Simples padronização e execução; 
• O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes; 
DESVANTAGENS: 
• Necessidade do microscópio de fluorescência; 
• Subjetividade na leitura; 
• Não automação;
CLASSES DOS PRINCIPAIS ANTÍGENOS PRESENTES 
NOS TECIDOS (PELE E MUCOSA) DE PACIENTES 
PORTADORES DE PÊNFIGOS E PENFIGOIDES 	
 	
• Os pênfigos são doenças relativamente raras caracterizados pela 
formação de bolhas na pele e, às vezes, também nas 
mucosas (como boca, garganta, olhos, nariz e região genital de 
homens e mulheres).	
• São consideradas doenças autoimunes, desencadeadas porque 
o sistema imunológico produz, de forma equivocada, anticorpos 
contra estruturas da pele, que são responsáveis pela união entre 
as células (como se fosse um “cimento”).	
•
• Esses anticorpos chegam na pele e nas mucosas por meio da 
circulação, se ligam a partes desse “cimento” e o danifica, fazendo 
com que as células se separem. Após essa separação há passagem 
de líquido e formação das bolhas. Essas bolhas acabam se 
rompendo após algum tempo (horas a dias, dependendo do local 
e do tipo de pênfigo) e deixam feridas na pele e nas mucosas, que 
demoram bastante para fechar, e às vezes não fecham. Não se 
sabe o que leva a formação desses anticorpos. Não são doenças 
hereditárias, ainda que haja alguns genes envolvidos. Não há 
fatores do ambiente, da alimentação, ou mesmo emocionais que 
sejam responsáveis pelo surgimento dos pênfigos. Alguns 
medicamentos podem, raramente, desencadear essas doenças.	
•
• É muito importante lembrar que, como outras doenças 
autoimunes, os pênfigos não são doenças contagiosas. Podem 
aparecer em qualquer idade (crianças, jovens, adultos e idosos), 
mas são mais frequentes em pessoas a partir dos 40-50 anos, 
tanto homens como mulheres. É diagnosticada no mundo todo, 
mas existe um tipo específico de pênfigo, conhecido como “fogo 
selvagem”, que é mais frequente no Brasil, sobretudo em áreas 
rurais.
• Há dois tipos principais de pênfigo: pênfigo vulgar e pênfigo 
foliáceo. O pênfigo vulgar são bolhas que geralmente começam nas 
mucosas, principalmente na boca (gengiva, lado de dentro das 
bochechas, língua, céu-da-boca, até a garganta), mas também 
podem surgir dentro do nariz e na região genital. O paciente pode 
passar alguns meses tendo bolhas e feridas somente nessas 
mucosas. A partir daí, surgem as bolhas na pele, principalmente no 
couro cabeludo, costas, peito e depois no corpo todo. O pênfigo 
foliáceo, como dito acima, é o tipo é mais comum no Brasil do que 
em outros países, ocorrendo principalmente nas áreas rurais, onde é 
também chamado de “fogo selvagem”. Nessa forma de pênfigo, as 
bolhas e feridas não aparecem nas mucosas, somente na pele. 
• Além dos pênfigos, há um outro grupo de doenças autoimunes que 
resulta na formação de bolhas na pele e nas mucosas: 
os penfigoides. O principal deles se chama penfigoide bolhoso, 
que afeta principalmente os idosos. A doença é caracterizada pelo 
surgimento de bolhas grandes e muito firmes e que demoram 
muitos dias para romper. 
• Pênfigo Foliáceo é uma doença bolhosa autoimune em que 
divisões na epiderme superficial resultam em erosões 
cutâneas. (Exclusivo de pele. Lembrar que não expressa 
manifestações em mucosa oral)	
• Desmogleína 1: (A desmogleína 1 é uma proteína que nos 
humanos é codificada pelo gene DSG1.)
• Pênfigo Vulgar é caracterizado por autoanticorpos IgGdirecionados contra desmogleína-1 e desmogleína-3 de caterinas 
dependentes de cálcio	
 
• Pênfigo Vegetante	
• Desmogleína 3 e 1	
 	
•
• Pênfigo Paraneoplásico é uma doença autoimune associada a uma 
neoplasia. Caracteriza-se por uma erupção mucocutânea 
polimórfica, tendo como diagnósticos diferenciais o pênfigo vulgar, 
eritema multiforme, síndrome de Stevens Johnson e líquen 
plano.  Desmogleínas 1 e 3 e desmoplaquinas. 
• Penfigoide Cicatricial (penfigoide benigno de mucosa)	
• Penfigoide Bolhoso é uma doença cutânea autoimune crônica 
que causa lesões bolhosas pruriginosas generalizadas em 
pacientes idosos. O envolvimento da membrana mucosa é raro. 
O diagnóstico é por biopsia cutânea e testes de 
imunofluorescência da pele e soro. Corticoides tópicos e 
sistêmicos são inicialmente usados.	
•
SINTOMAS E TRATAMENTOS 	
• Para se confirmar totalmente o diagnóstico, é necessário fazer 
uma biopsia de pele. Para isso, o médico irá aplicar uma 
anestesia local (por meio de injeção) e retirar um pequeno 
pedaço de pele, e em seguida dará um ou dois pontos no local. 
Esse fragmento de pele será enviado a um laboratório de 
patologia, e lá, um médico patologista irá examiná-lo no 
microscópio para verificar o tipo de bolha e o nível onde ela se 
forma dentro da pele (mais superficial, no caso do pênfigo 
foliáceo, um pouco mais abaixo, no caso do pênfigo vulgar, e 
ainda mais profunda, no caso do penfigoide bolhoso).	
•
• O tratamento dessas doenças bolhosas autoimunes é realizado à 
base de corticosteroides orais em altas doses. Em alguns casos, é 
necessário acrescentar um outro medicamento, da classe 
dosimunossupressores. Todos esses medicamentos são 
utilizados para que o organismo pare de produzir os anticorpos 
que atacam a pele e fazem surgir as bolhas. Isso ocorre de forma 
lenta e gradual, e por essa razão, o tratamento é bastante 
prolongado, geralmente durando anos. Em casos graves, 
excepcionalmente, pode ser necessário internar o paciente para 
administrar os medicamentos por via intravenosa para que sua 
ação seja mais rápida. 
•
CASOS ODONTOLOGICOS 
PENFIGOIDE DA MEMBRANA MUCOSA 
• Penfigoide da membrana mucosa (PMM) é a designação dada a 
um grupo heterogêneo de doenças autoimunes crônicas raras 
que tendem a causar lesões bolhosas gradualmente progressivas 
e ascendentes das mucosas, muitas vezes com cicatrizes e 
morbidade subsequentes.	
• Caracterizam-se pela perda de aderência entre as células e a 
epiderme
• Pênfigo - IFI- intercelular, intraepitelial
LIQUEN PLANO ORAL
• O líquen plano é uma doença inflamatória mucocutânea, ou seja 
capaz de atingir a pele, mucosas e também anexos , como cabelos e 
unhas. 
• Trata-se de uma condição benigna, porém de longa duração e muito 
incômoda por causa de seus sintomas. A causa exata ainda é 
desconhecida. 
• Algumas hipóteses sobre suas causas são aventadas, como: 
imunológica, psicogênica, neurológica, infecciosa 
ou ainda causada por metais 
pesados como ouro e mercúrio.
• Os principais sinais e sintomas de líquen plano incluem: 
• Lesões orais 
• O líquen plano oral é uma forma de líquen plano e pode ou não estar 
associada a lesões de pele. As manifestações são mais comuns na 
mucosa oral , porém pode afetar qualquer outra mucosa do corpo 
• Pode se apresentar de várias formas, dentre elas: bolhosa, em placa, 
hipertrófica ( placa mais grossa), papulosa, erosiva 
• Pode ser doloroso 
• São localizados nas laterais da língua, parte interna da bochecha e 
gengiva 
• Se apresentam como manchas azuis esbranquiçadas 
• Formam linhas em forma de uma rede
• Os principais objetivos do tratamento para líquen plano 
consistem em reduzir os sintomas, acelerar a cura e promover 
melhora na qualidade de vida do paciente. Ele inclui: 
• Medicamentos anti-histamínicos, para aliviar a coceira 
• Medicamentos orais que acalmem o sistema imunológico, como 
corticóides e em casos mais graves como ciclosporina 
• Medicamentos orais da classe dos retinoides 
• Corticosteroides tópicos 
• Injeções de corticosteroides na lesão 
• Terapia com luz ultravioleta com UVA ou UVB
LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO ORAL
• O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES ou apenas lúpus) é uma 
doença inflamatória crônica de origem autoimune, cujos sintomas 
podem surgir em diversos órgãos de forma lenta e progressiva (em 
meses) ou mais rapidamente (em semanas) e variam com fases de 
atividade e de remissão.  
• São reconhecidos dois tipos principais de lúpus: o cutâneo, que se 
manifesta apenas com manchas na pele (geralmente avermelhadas 
ou eritematosas e daí o nome lúpus eritematoso), principalmente 
nas áreas que ficam expostas à luz solar (rosto, orelhas, colo (“V” do 
decote) e nos braços) e o 
sistêmico, no qual um ou 
mais órgãos internos 
são acometidos. 
• Embora a causa do LES não seja conhecida, sabe-se que fatores 
genéticos, hormonais e ambientais participam de seu 
desenvolvimento. Portanto, pessoas que nascem com 
susceptibilidade genética para desenvolver a doença, em algum 
momento, após uma interação com fatores ambientais 
(irradiação solar, infecções virais ou por outros micro-
organismos), passam a apresentar alterações imunológica.
CONCLUSÃO
• A imunofluorescência é um importante instrumento auxiliar no 
diagnóstico das dermatoses bolhosas autoimunes e desordens 
inflamatórias, com base que seus achados clínicos e 
histopatológicos podem não ser determinantes. Consiste em um 
método laboratorial permitido, que requer profissionais técnicos 
experientes, e detecta imunocomplexos ou circulantes, que 
podem estar envolvidos na patogênese de tais enfermidades 
cutâneas.