Artigo Nanoemulsões1 (1)

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PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA NANOEMULSÃO CONTENDO UMA NAFTOQUINONA NATURAL
RESUMO
As naftoquinonas naturais, como o lapachol (Lp), têm demonstrado atividades biológicas promissoras. No entanto, essas quinonas apresentam baixa biodisponibilidade sistêmica devido à sua baixa solubilidade aquosa. Para contornar esse problema, as nanoemulsões (NE) formadas por núcleo oleoso são capazes de incorporar moléculas hidrofóbicas, possibilitando sua dispersão em uma fase aquosa. O presente estudo relata o desenvolvimento, caracterização e estabilidade física do NE contendo lapachol. As formulações de NE (F1, F2, F3, F4 e F2-Lp) foram preparadas usando o método de inversão de fase de emulsão (EPI) e caracterizadas em relação ao tamanho de gota, distribuição de tamanho (PDI), potencial zeta e estabilidade física. A formulação escolhida para incorporar lapachol (F2-Lp) apresentou tamanho de gotícula em escala nanométrica com distribuição de tamanho homogênea (PDI <0,2) e potencial zeta negativo (cerca de −30 mV). Além disso, a boa estabilidade física de F2 e F2-Lp foi demonstrada usando centrifugação analítica com detecção fotométrica, onde os perfis de transmissão de luz não mudaram ao longo das dispersões. A nanoemulsão contendo lapachol apresentou aspecto fortemente avermelhado; entretanto, a incorporação desta naftoquinona não alterou os principais parâmetros físico-químicos da formulação NE. O estudo de liberação in vitro demonstrou um perfil de liberação sustentada de NE com cerca de 60% do lapachol liberado em 54 h.
INTRODUÇÃO
As quinonas são compostos onipresentes na natureza e as naftoquinonas são consideradas uma classe importante de substâncias bioativas normalmente extraídas de plantas da família Bignoniaceae.1,2 O lapachol é o composto de quinona mais abundante comumente isolado das árvores da família Ipe (Tabebuia spp.) Encontradas em América do Sul .3,4 O lapachol e seus derivados α- e β-lapachona têm demonstrado diferentes atividades biológicas, como antibacteriana, antifúngica, antiplasmódica, tripanocida, antiinflamatória, antiangiogênica e anticâncer.2,3,5-7. , foi amplamente relatado que após a administração oral de lapachol nos ensaios clínicos de Fase I, esta naftoquinona não apresentou efeito terapêutico, mesmo em altas doses, níveis sanguíneos insatisfatórios foram obtidos.2,3,5
A fim de superar essa limitação, vários sistemas de entrega de drogas foram desenvolvidos para melhorar a absorção oral e a biodisponibilidade de compostos naturais, incluindo formulações nanoestruturadas.8,9 Os sistemas nanoemulsificantes formados por óleo, água e surfactantes têm sido usados ​​para incorporar e entregar muitos medicamentos. Dentre esses sistemas, microemulsões e nanoemulsões são os dois principais carreadores emulsificados formados por nano-gotículas. A microemulsão é uma dispersão termodinamicamente estável de pelo menos dois líquidos imiscíveis, enquanto a nanoemulsão é um sistema sem equilíbrio (metaestável), mas uma dispersão coloidal cineticamente estável de fases líquidas imiscíveis.10-15 Ambos os sistemas nanoemulsionantes podem ser uma dispersão de óleo em -água (O / W) ou água-em-óleo (W / O) dependendo se a fase de óleo (O / W) ou água (W / O) é dispersa como glóbulos finos na formulação.
As nanoemulsões também foram denominadas por mini-emulsão, emulsão submicrônica, emulsões translúcidas e emulsão ultrafina. A fase interna ou dispersa da nanoemulsão é composta de gotículas muito pequenas com tamanhos inferiores a 300 nm.10,13,14 Por causa de seu pequeno tamanho de gotícula, a aparência da nanoemulsão pode diferir significativamente de dispersões translúcidas (r <50 nm) para aquelas leitosas opaco. Outro fenômeno importante com respeito a pequenas gotículas de nanoemulsão é o aumento substancial da estabilidade gravitacional fornecida para este tipo de dispersão coloidal em comparação com emulsões convencionais ou dispersões grosseiras. Desse modo, quando o raio da gota é menor que 100 nm, o movimento browniano domina as forças gravitacionais, evitando o desenvolvimento de instabilidade física, como creme ou sedimentação, bem como floculação de glóbulos no armazenamento.11,15 Além disso, os fármacos lipofílicos contidos em pequenas gotículas de óleo ( r <100 nm) têm sua biodisponibilidade aumentada devido ao aumento significativo da pressão de Laplace e da concentração local de soluto na fase aquosa muito próximo à superfície do glóbulo.11
Nesse sentido, o objetivo principal deste estudo foi desenvolver uma formulação de nanoemulsão contendo uma naftoquinona natural (lapachol). As formulações coloidais projetadas foram obtidas usando um método de preparação de baixa energia, isto é, método de inversão de fase de emulsão (método EPI), e a influência dos tipos de óleo e surfactante foi avaliada no diâmetro médio das gotículas, distribuição de tamanho e potencial zeta. Além disso, a nanoemulsão carregada de lapachol foi avaliada em relação à sua estabilidade física e liberação in vitro desta naftoquinona.
EXPERIMENTAL
Materiais
Óleo mineral (MO), monolaurato de polioxietileno-20 sorbitano (SML-20) e monooleato de sorbitano (SMO) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). Triglicerídeos de cadeia média (MCT), óleo de mamona hidrogenado POE-40 (HCO-40) e isoestearato de sorbitana (SIS) foram gentilmente fornecidos pela Croda do Brasil Ltda (Campinas, SP, Brasil). O Lapachol (Lp) foi fornecido pelo Grupo de Pesquisa em Química Aplicada à Farmácia da UNIVASF.
Preparação de nanoemulsão
As nanoemulsões de óleo em água (O / W) (NE) foram preparadas usando o método de inversão de fase de emulsão.16 Ambas as fases de óleo e aquosa foram preparadas separadamente, a fase orgânica foi obtida pela mistura de surfactantes e óleos sob agitação moderada enquanto a fase aquosa consistia de solução tampão de fosfato (PBS pH 7,4). As nanoemulsões foram preparadas adicionando lentamente fase aquosa à fase orgânica e os sistemas resultantes mantidos em agitação contínua. Dispersões coloidais foram formadas de óleos (MCT e MO), surfactantes (HCO-40, SML-20, SIS e SMO) e solução tampão de fosfato, como pode ser visto na Tabela 1. Concentração da fase orgânica e peso de surfactante para óleo razão foram mantidos constantes em 10,0% em peso e 1,0, respectivamente. As nanoemulsões foram otimizadas por meio de um estudo de formulação em que a influência dos pares de tensoativos (HLB final 12) e do tipo de óleo (Tabela 1) foram avaliados nas principais propriedades físico-químicas da gota emulsificada. Todas as formulações foram preparadas em triplicata (n = 12) e armazenadas a 4 ± 2 ° C. NE carregadas com lapachol (F2-Lp) foram preparadas pela adição de diferentes quantidades (0,1, 0,6, 1,0 e 1,25 mg mL-1) de esta naftoquinona em fase oleosa e usando o mesmo procedimento para preparar nanoemulsão F2 sem carga.
Tabela 1 Composição (% em peso) de formulações de nanoemulsão descarregadas (NE) preparadas pelo método de inversão de fase de emulsão
* MCT: triglicerídeos de cadeia média, MO: óleo mineral, HCO-40: óleo de rícino hidrogenado POE-40, SML-20: monolaurato de sorbitano POE-20, SIS: isostearato de sorbitano, SMO: monooleato de sorbitano e AP: fase aquosa (PBS pH 7,4).
Análise de tamanho de partícula e índice de polidispersidade
O diâmetro hidrodinâmico das gotículas de nanoemulsão e o índice de polidispersidade (PdI) das formulações foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons (PCS) a 25 ° C e ângulo de espalhamento de 173 ° (Zetasizer® Nano ZS, Malvern PCS Instruments, UK). As amostras foram obtidas diluindo 20 µL com 2 mL de água ultrapura. Os valores relatados são a média ± SEM de três lotes diferentes de cada dispersão coloidal.
Medição de potencial zeta
O potencial zeta (ζ) das nanoemulsões foi medido por mobilidade eletroforética usando um aparelho Zetasizer® Nano ZS (Malvern PCS Instruments, UK). O modelo de Smoluchowski foi usado para estimar o potencial ζ da mobilidade eletroforética. As análises foram realizadas a 25 ° C, e as amostras foram devidamente diluídas (1/100)com água ultrapurificada e o pH medido. Os valores relatados são a média ± SEM de três lotes diferentes de cada dispersão coloidal.
Estudos de estabilidade
Os estudos de estabilidade foram realizados pelo método de centrifugação analítica com detecção fotométrica em 880 nm (LUMiSizer® 611, LUM GmbH, Alemanha). As amostras de nanoemulsões descarregadas ou nanoemulsões contendo lapachol foram incorporadas à célula de policarbonato e equilibradas a 25 ° C antes da análise. As medições foram realizadas a 3.500 rpm por 3,5 h, resultando em migração acelerada das gotículas dispersas e integração dos perfis de transmissão dentro de uma região selecionada da célula de retenção, permitindo obter informações sobre a estabilidade da emulsão por seis meses.
Quantificação de lapachol em nanoemulsão e eficiência de incorporação
A concentração de lapachol foi determinada usando um método espectrofotométrico de UV. Para estabelecer a linearidade do método proposto, três curvas de calibração foram construídas em oito níveis de concentração na faixa de 2,0-9,0 µg mL-1 (n = 24). A análise de regressão do mínimo quadrado foi feita para os dados (y = 0,1337x + 0,0304, r = 0,9986) e para todas as análises espectrofotométricas a lei de Beer foi obedecida. A quantidade de lapachol nas nanoemulsões foi determinada solubilizando uma quantidade conhecida de formulação em etanol. A concentração de lapachol nesta solução etanólica foi determinada por espectroscopia de UV conduzida em espectrofotômetro Even UV / VIS (Ionlab, Paraná, Brasil) com detecção em 280 nm. O conteúdo de lapachol livre foi determinado medindo o fármaco não incorporado presente em um ultrafiltrado claro obtido através da separação da fase aquosa usando um procedimento de ultrafiltração / ultracentrifugação (Microcon Ultracel YM-100, Millipore, Irlanda) a 10.000 rpm por 1 h, a 4 ° C (Eppendorf, Centrifuge 5430 R, Hamburgo, Alemanha). Todas as análises foram realizadas em triplicado e a eficiência de incorporação (IE%) de lapachol na nanoemulsão foi calculada a partir da seguinte Equação 1:
IE(%)=[(TLC−FLC)÷ThLC]×100 (1)
onde TLC é a concentração total de lapachol; FLC, concentração de lapachol livre; ThLC, concentração teórica de lapachol.
Liberação in vitro de lapachol da nanoemulsão
Os experimentos de liberação de lapachol in vitro foram realizados utilizando a técnica de diálise. Uma alíquota da formulação F2-Lp ou lapachol livre (dispersão hidroalcoólica 10% v / v) foi colocada dentro de um saco de diálise (membrana de celulose, peso molecular cut-off 14.000, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), selado , e imerso em um recipiente contendo 150 mL de solução tampão de fosfato 10 mM (pH 7,4). O sistema de liberação foi mantido a 37 ± 1 ºC, sob agitação magnética (100 rpm). Alíquotas de um mililitro foram retiradas do meio de dissolução em intervalos de tempo pré-determinados, substituídas por solução tampão fresca (PBS) e analisadas quanto à liberação de lapachol por espectrofotometria UV a 280 nm. O perfil de liberação de lapachol foi expresso como a quantidade cumulativa de lapachol liberado (média ± SEM) e plotado em função do tempo. Os experimentos foram realizados em triplicata para ambas as amostras.
Análise estatística
Todas as experiências foram realizadas em triplicado e os dados são expressos como o valor médio ± SEM. A análise estatística foi realizada por One-way ANOVA seguida por comparações de pares de Tukey usando o Prism GraphPad Software. A significância estatística foi fixada em p <0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Preparação de nanoemulsão contendo lapachol e caracterização
Os sistemas de liberação de drogas coloidais baseados em nanoemulsões são usados ​​para transportar moléculas bioativas lipofílicas e dispersá-las em meio aquoso.10-12 O lapachol é uma naftoquinona natural que tem solubilidade em água limitada e baixa biodisponibilidade 3,5 e por isso deve ser incorporado ao gotículas oleosas da emulsão O / W para melhorar seu perfil farmacocinético. Diante dessa possibilidade, quatro diferentes formulações de nanoemulsão sem carga (F1-F4) foram previamente preparadas e seus principais parâmetros físico-químicos analisados ​​(Tabela 2). A inversão de fase de emulsão ou inversão de fase catastrófica foi usada como um método de baixa energia para preparar nanoemulsões, este método envolve a adição de uma fase aquosa em uma mistura de óleos e surfactantes a temperatura constante. Inicialmente, a influência dos tipos de óleo e surfactante foi investigada no tamanho de gota, distribuição de tamanho de partícula (PdI) e potencial zeta da fase de óleo dispersa.
Tabela 2 Resultados da caracterização físico-química de nanoemulsões descarregadas (F1-F4) e nanoemulsões carregadas de lapachol (F2-Lp).
a Média ± SEM (n = 3).
b p <0,05 em comparação com as formulações F3 e F4.
c Formulação contendo lapachol a 1 mg mL-1, p> 0,05 em comparação com F2.
Tanto o tamanho da gota quanto o PdI eram altamente dependentes do surfactante e co-surfactante presentes nas formulações coloidais. Os menores tamanhos de gotículas (<100 nm) foram obtidos nas formulações preparadas com surfactantes HCO-40 e SIS em comparação àquela preparada com SML-20 e SMO (p <0,05). Além disso, as formulações F1 e F2 demonstraram uma distribuição de tamanho de gotícula estreita (PdI <0,2), enquanto as formulações F3 e F4 tiveram as distribuições de tamanho mais ampla (PdI ≥ 0,4) compreendendo uma distribuição bimodal com gotículas maiores e mais polidispersas (Figura 1). Por outro lado, o tipo de óleo (MCT e MO) não demonstrou influência no tamanho de gota e PdI (p <0,05) para todas as formulações de NE. A aparência das formulações NE variou muito de translúcida ou ligeiramente turva a opaca e a formulação F2 foi a preparação mais translúcida com forte reflexão azulada (Figura 2). Para todas as formulações de nanoemulsão desenvolvidas, foram observadas cargas superficiais altamente negativas (Tabela 2). Estes valores de potencial zeta negativo contribuem para a estabilidade de armazenamento da nanoemulsão, uma vez que as forças repulsivas excedem as forças atrativas entre as gotas e tal repulsão gota-gota evita a coagulação e / ou coalescência da fase dispersa das emulsões.
Figura 1 Distribuições de tamanho de partícula das nanoemulsões descarregadas (F1-F4).
Figura 2 Fotoimagens de formulações NE descarregadas preparadas usando um método de emulsificação de baixa energia
O mecanismo de desenvolvimento da nanoemulsão usando o método EPI é baseado na adição progressiva (contínua) de água à fase orgânica com formação inicial da emulsão A / O e conforme mais água é adicionada, uma emulsão múltipla (O / A / O) é formada. Com mais adição de água ao sistema, ocorre uma inversão de fase catastrófica que resulta na dispersão O / A contendo pequenas gotículas de óleo como internas.16 A capacidade de solubilização de óleo em preparações emulsionadas pode ser aumentada usando uma combinação de diferentes surfactantes. Além disso, o tipo de surfactante tem sido considerado um fator determinante para obter uma dispersão fina em óleo usando um método de emulsificação de baixa energia. Com relação aos surfactantes, essas moléculas anfifílicas podem afetar a formação de pequenas gotículas devido à sua geometria molecular e consequente empacotamento crítico.16-18 O parâmetro de empacotamento de um surfactante está relacionado à sua geometria molecular e reflete a relação entre a área do grupo da cauda (porção hidrofóbica ) e a área do grupo principal (porção hidrofílica). Tal parâmetro impacta a formação de monocamadas de surfactante na interface óleo-água a partir de gotículas de emulsão O / W, uma vez que um determinado surfactante tende a ter uma curvatura ótima. Por exemplo, a formação de emulsão O / W é favorecida quando surfactantes com p <1 são usados ​​e monocamadas de surfactante adotando uma curvatura positiva, isto é, com grupos de cabeça hidrofílicos apontando para fora. Portanto, os resultados obtidos usando HCO-40 e SIS nas formulações podem ser explicados devido à formação demonocamada compacta desses surfactantes nas fronteiras óleo-água com baixa tensão interfacial criando uma microemulsão bicontinua que se quebra em gotículas de óleo muito finas.
Tendo em vista estes resultados, a formulação F2 foi escolhida para incorporar diferentes concentrações de lapachol. Lapachol foi adicionado na fase orgânica até dissolução completa após adição da fase aquosa sob agitação contínua. Concentrações crescentes de lapachol (0,1 a 1,25 mg mL-1) na formulação F2 foram avaliadas em relação à solubilização desta quinona na fase oleosa. Após a preparação das nanoemulsões contendo lapachol, apenas na concentração mais alta desta naftoquinona (1,25 mg mL-1) foram observados cristais amarelos no fundo do recipiente de vidro, como resultado da expulsão do lapachol do núcleo oleoso, portanto, concentração de lapachol em 1,0 mg mL -1 em nanoemulsão foi usado em outros experimentos neste estudo.
Uma formulação de nanoemulsão com cor laranja avermelhado forte foi obtida após a adição de lapachol à formulação F2 (Figura 3). Não houve diferença significativa entre as formulações F2 e F2-Lp (p> 0,05) em relação aos valores de tamanho, PdI e potencial zeta. Assim, a incorporação de lapachol na nanoemulsão não alterou os principais parâmetros físico-químicos desta dispersão coloidal como pode ser visto na Tabela 2. Além disso, a estabilidade física da formulação F2-Lp não foi afetada pela incorporação de naftoquinona e seu perfil de estabilidade permaneceu semelhante ao um obtido para a formulação F2 sem carga em ensaio de centrifugação analítica (Figura 3), portanto, para ambas as amostras (F2 e F2-Lp), os perfis de transmissão de luz medidos não mudaram durante todo o tempo de análise.
Figura 3 Fotoimagens de (a) NE contendo lapachol a 1 mg mL-1 (F2-Lp) e (b) F2 NE sem carga. Resultados da formulação F2-Lp de distribuição de tamanho de gota (canto superior direito) e centrifugação analítica com LUMiSizer® (imagem inferior).
Estudo de estabilidade
O estudo de estabilidade acelerado foi realizado para formulações de NE usando centrifugação analítica com detecção fotométrica. Os perfis de transmissão das formulações NE são mostrados na Figura 3 para a formulação contendo lapachol e na Figura 4 para NE descarregado. Este estudo é baseado na taxa de separação de gotas, ou seja, floculação e formação de creme, durante altas velocidades centrífugas e medidas de intensidade de infravermelho próximas transmitidas de amostras. A cinética do processo de separação de gotículas é caracterizada pela forma e progressão dos perfis de transmissão de luz medidos em função do tempo e da posição ao longo de todo o comprimento da amostra. A variação da transmissão de luz ao longo das amostras reflete a separação de fase da dispersão; portanto, um aumento na transmissão significa um comportamento de migração de gotículas.20,21 Como pode ser observado na Figura 4, houve diferenças significativas nos perfis de transmissão de luz entre as formulações de NE. Para perfis obtidos de formulações F1 e F2 descarregadas, não houve diferença significativa na transmissão e os perfis de transmissão de luz para a formulação F2 não mudaram com 80% de transmissão ao longo da dispersão durante todo o tempo de análise. Por outro lado, as formulações F3 e F4 descarregadas demonstraram forte variação de transmissão de luz (Figura 4) entre o primeiro e o último perfis. Inicialmente, F3 e F4 apresentavam cerca de 5% de transmissão (primeiros perfis vermelhos) ao longo das formulações e rapidamente essa transmissão atingiu valores superiores a 85%. Estes resultados indicam que ambas as formulações F3 e F4 eram dispersões instáveis ​​caracterizadas por alta velocidade de flotação com um movimento significativo para cima das gotas de óleo que resulta na formação de creme. A melhor estabilidade física das formulações F1 e F2 pode ser explicada principalmente devido à estabilidade gravitacional das nanoemulsões, ou seja, gotículas menores (<90 nm) nessas dispersões podem estar sob influência do movimento browniano apenas.11 Depois disso, a dispersão mais estável foi considerada F2 formulação.
Figura 4 Perfis de transmissão NIR normalizados obtidos com NE descarregado (F1-F4) por análise de estabilidade forçada durante a centrifugação analítica com LUMiSizer®. O primeiro e o último perfis registrados são mostrados em vermelho e verde, respectivamente
Quantificação de lapachol e liberação in vitro da nanoemulsão
Como esperado, o lapachol foi incorporado à fase oleosa de NE com eficiência de cerca de 90% (0,9 mg mL-1). A fim de avaliar a incorporação do lapachol na fase oleosa da formulação NE, o ensaio do perfil de liberação foi realizado utilizando o experimento de diálise in vitro. Neste estudo, NE contendo lapachol (F2-Lp) e lapachol livre (dispersão hidroalcoólica) foram comparados em relação à quantidade cumulativa dessa naftoquinina liberada por tempo. Como pode ser visto na Figura 5, o lapachol foi liberado da dispersão hidroalcoólica muito rapidamente, isto é, o lapachol livre foi liberado 4 vezes mais rápido do que o lapachol incorporado em NE. A liberação inicial da explosão foi observada para lapachol livre nas primeiras 2 h com 75,6% (± 5,18%) da quantidade total de naftoquinona liberada. Por outro lado, para F2-Lp apenas uma lenta liberação de lapachol foi observada em PBS (pH 7,4) com menos de 50% liberado nas primeiras 12 h. O perfil cinético do lapachol de F2-Lp apresentou efeito burst de 38,7% (± 7,26%) após as primeiras 7 horas de experimento. No final de 54 h de experimento, apenas 58,7% (± 2,54%) de lapcahol foram liberados de F2-Lp. Esses resultados estão de acordo com Cavalcanti et al.22 que demonstraram que apenas 60% da β-lapachona foi liberada dos lipossomas após 24 h de experimento e cerca de 80% da β-lapachona livre foi liberada nas primeiras 3 h.
Figura 5 Perfil de liberação in vitro de lapachol da formulação F2-Lp preparada usando o método EPI. O resultado mostrado na inserção representa a liberação in vitro de lapachol livre da dispersão hidroalcoólica. Todos os resultados foram relatados como média ± SEM (n = 3)
CONCLUSÕES
Incorporamos com sucesso o lapachol na nanoemulsão O / W. As formulações de nanoemulsão foram preparadas pelo método de inversão de fase de emulsão e a formulação mais estável foi obtida usando surfactantes HCO-40 e SIS. A nanoemulsão de lapachol apresentou tamanho de gota em torno de 70 nm, com distribuição de tamanho homogênea (PdI <0,2), e potencial zeta negativo. A boa estabilidade física da nanoemulsão contendo lapachol foi confirmada por centrifugação analítica na qual a transmissão de luz não se alterou ao longo da dispersão coloidal. Além disso, o perfil de liberação in vitro de lapachol da nanoemulsão demonstrou uma liberação sustentada dessa quinona. Portanto, as emulsões submicrônicas podem ser consideradas sistemas de entrega promissores aplicados a drogas de ocorrência natural.