artigo processos fermentativo

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Traduz
Revista de Engenharia Bioquímica84 (2014) 28–35
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Revista de Engenharia Bioquímica
Página inicial do jornal :www. Els ev ier . com/ l oc ate / be j
rtigo Ordinário
cumulação de ácido láctico a partir de lamas e resíduos alimentares para melhorar o rendimento 
e AGV enriquecido com ácido propiónico
iang Li, Yinguang Chen∗, Shu Zhao, Dongbo Wang, Xiong Zheng, Jingyang Luo
tate Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of Environmental Science and Engineering, Tongji University, 1239 Siping Road, 
hanghai 200092, China
rtigoinfo abstrato
istoria do artigo:
ecebido em 22 de junho de 2013 
ecebido em forma revisada em 17 
e dezembro de 2013
ceito em 27 de dezembro de 2013 Disponível 
nline em 6 de janeiro de 2014
De acordo com nosso estudo anterior, os ácidos graxos voláteis (AGV) enriquecidos com ácido propiônico, a fonte de
carbono preferida para a remoção biológica de nutrientes de águas residuais, podem ser produzidos pela via do 
ácido lático durante a fermentação em dois estágios de resíduos orgânicos usandoPropionibacterium 
acidipropionici.No presente estudo, uma nova estratégia, baseada na acumulação de ácido láctico a partir de lamas 
e resíduos alimentares, foi introduzida para aumentar significativamente o rendimento de AGV enriquecido com 
ácido propiónico. Primeiro, o efeito de diferentes temperaturas na fermentação em dois estágios foi totalmente 
ido do Inglês para o Português - www.onlinedoctranslator.com
discutido. Foram elaboradas as vantagens e desvantagens da fermentação em diferentes temperaturas. Além disso, 
a via metabólica proposta a 35◦C e 50◦C foi introduzido. Observou-se que controlando inicialmente a temperatura a 
50◦C por 4 h e posteriormente a 35◦C por 2 d, o acúmulo constante e máximo de ácido lático foi obtido no primeiro 
estágio, o que resultou no aumento do rendimento de VFA enriquecido com ácido propiônico no segundo estágio 
ntage
alavras-chave:
cido propiónico
cido lático
emperatura
 
 
 
 
para 15,3 g DQO/L e a porcerocessos anaeróbicos
rocessamento em lote
ermentação
. Introdução
Tem sido amplamente reconhecido que a remoção biológica de 
itrogênio e fósforo é altamente dependente da concentração da fonte de 
arbono do efluente afluente, especialmente VFA[1,2]. VFA pode ser 
roduzido pela fermentação de matéria orgânica, como lodo ativado 
esidual (WAS) e resíduos de alimentos[3,4]. Além disso, o estudo anterior 
emonstrou que a eficiência de remoção de fósforo foi significativamente 
elhorada com o aumento da proporção de ácido propiônico/acético[5]. 
ortanto, é promissor adicionar VFA contendo maior fração de ácido 
ropiônico em vez de ácido acético às águas residuais afluentes que 
arecem de recursos de carbono. Embora esforços extensivos tenham sido 
eitos para converter WAS em VFA contendo ácido acético[6–8], poucas 
eferências relatam os métodos para melhorar a fração de ácido propiônico 
m VFA da fermentação do lodo.
Em nossa descoberta anterior, a adição de substrato de carboidrato à 
ermentação WAS aumentou a porcentagem de ácido propiônico para 
proximadamente 48%.[9]. Recentemente, um método de fermentação em 
ois estágios baseado na via do ácido lático foi observado para melhorar 
inda mais a porcentagem de ácido propiônico em VFA para 68,4%, o que foi
uito maior do que o relatado na literatura[10]. Na primeira etapa, a 
istura de WAS e restos de alimentos foi fermentada para produzir ácido 
ático e, em seguida, na segunda etapaPropionibacterium acidipropionicifoi 
noculado no líquido do primeiro estágio para produzir ácido propiônico[11].
∗Autor correspondente. Tel.: +86 21 65981263; fax: +86 21 65986313.
Endereço de email:yg2chen@yahoo.com (Y. Chen).
369-703X/$ – ver matéria inicial© 2014 Elsevier BV Todos os direitos reservados. 
ttp://dx.doi.org/10.1016/j.bej.2013.12.020
m de ácido propiônico em VFA atingindo 69,9%.
© 2014 Elsevier BV Todos os direitos reservados.
No entanto, havia poucas referências disponíveis sobre a estratégia para 
melhorar o rendimento de VFA enriquecido com ácido propiônico.
De acordo com nossa observação recente, o ácido lático desempenha um 
papel fundamental na fermentação em dois estágios de VFA enriquecido com 
ácido propiônico de WAS e resíduos de alimentos, pois é o substrato direto para a 
produção de ácido propiônico no segundo estágio. Prevê-se que uma maior 
produção de ácido lático no primeiro estágio resultaria em uma maior produção 
de VFA enriquecido com ácido propiônico no segundo estágio. No entanto, o ácido
lático é um produto metabólico intermediário durante o primeiro estágio, que 
pode ser facilmente degradado por microrganismos consumidores de ácido lático 
presentes na WAS ou resíduos alimentares[12].
Neste estudo, o efeito da temperatura na fermentação em dois estágios 
de lodo e resíduos de alimentos foi estudado pela primeira vez. Além disso, a
via metabólica em diferentes temperaturas foi discutida. Em seguida, a nova 
estratégia foi relatada inibindo o consumo de ácido lático e otimizando o 
acúmulo de ácido lático no primeiro estágio. Pela análise do balanço de 
massa de carbono para a nova estratégia, as variações orgânicas na 
primeira etapa foram claramente exibidas. Finalmente, o rendimento de VFA
enriquecido com ácido propiônico foi significativamente aumentado no 
segundo estágio pelo líquido ótimo do primeiro estágio.
2. Métodos
2.1. Microrganismo, meio e cultura, a mistura de lodo e restos de 
comida
P. acidipropioniciATCC 4875 usado neste estudo foi adquirido
da American Type Culture Collection. A bactéria foi
dx.doi.org/10.1016/j.bej.2013.12.020
http://www.sciencedirect.com/science/journal/1369703X
http://www.elsevier.com/locate/bej
http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.bej.2013.12.020&domain=pdf
mailto:yg2chen@yahoo.com
dx.doi.org/10.1016/j.bej.2013.12.020
https://www.onlinedoctranslator.com/pt/?utm_source=onlinedoctranslator&utm_medium=pdf&utm_campaign=attribution
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ultivada em 400 mL de meio sintético no frasco de soro (volume de 
rabalho 500 mL) contendo 5 g/L de hidrolisado de caseína (Fluka), 10 g/
 de lactato de sódio, 10 g/L de extrato de levedura, 2,5 g/LK2HPO4·H2O,
,5 g/L KH2PO4, 0,01 g/L MnSO4, 0,2 g/L MgSO4·7H2O, 0,01 g/L FeSO4·
H2O. O pH inicial foi ajustado para 6,9±0,2 por 3 M hidróxido de 
otássio (KOH) ou 3 M HCl, e o meio foi esterilizado a 121◦C e 15 psig 
or 20 min. Para manter a condição anaeróbica, o frasco de soro foi 
elado com uma tampa de borracha no porta-luvas anaeróbico após a 
noculação. Então, 40 mlP. acidipropionicios inóculos foram inoculados 
o frasco de soro (salvo indicação em contrário, a escala de inoculação 
oi de aproximadamente 10%) e cultivados em um agitador de banho 
e ar (160 rpm) a 30±1◦C por 3 d para uso posterior.
O lodo ativado residual usado no estudo atual foi obtido de uma 
stação municipal de tratamento de águas residuais em Xangai, China, 
 sedimentado por 24 horas. As principais características do lodo 
oncentrado foram as seguintes: pH 6,6±0,3, sólidos suspensos totais 
TSS) 17,52±2,17 g/L, sólidos suspensos voláteis (VSS) 12,12±1,15 g/L, 
emanda de oxigênio químico solúvel (SCOD) 0,29±0,02 g/L, demanda 
uímica total de oxigênio (TCOD) 18,85±0,35g/L. O desperdício de 
omida foi coletado de um restaurante em Xangai e eliminado tecidos, 
auzinhos e ossos. Os restos de alimentos sem esterilização foram 
rmazenados no 4◦C geladeira para os testes repetidos. A característica 
ra TSS 87.62±5,32 g/L, VSS 85,28±3,28 g/L, TCOD 131,21±14,66 g/L, 
COD 41,32±5,11 g/L. Salvo indicação em contrário, a mistura de lodo e 
estos de comida usada para o primeiro estágio de fermentação foi 
dicionada com água da torneira para fazer ademanda total final de 
xigênio químico (TCOD) de 25,0±1,5g/L. A proporção de mistura de 
odo com restos de alimentos foi registrada como razão de massa (g/g) 
e 0,24:1 de acordo com o estudo anterior[10].
.2. Operação do sistema de fermentação de dois estágios
DeFigura 1, o sistema de fermentação de dois estágios inclui: (1) o 
eator de primeiro estágio (volume de trabalho de 3,0 L) para produzir 
cido lático a partir da mistura de lodo e resíduos alimentares; e (2) o 
eator de segundo estágio (volume de trabalho de 1,1 L) para converter
cido lático em VFA enriquecido com ácido propiônico usandoP. 
cidipropionici.O reator de primeiro estágio (agitado mecanicamente a 
00 rpm) foi mantido em pH 8,2±0,4 usando NaOH 5 M ou HCl 5 M. A 
istura de lodo e restos de alimentos (caracterizada como acima) foi 
dicionada ao reator de primeiro estágio, cuja temperatura foi 
ontrolada por equipamento de banho-maria. Após alguns dias de 
ermentação, o líquido da suspensão do primeiro estágio foi obtido 0,9 
 via centrifugação (×3000 g por 5 min). Posteriormente, foi 
utoclavado (121◦C e 15 psig por 20 min) no reator de segundo estágio. 
m seguida, o reator de segundo estágio foi inoculado com 0,1 LP. 
cidipropioniciinóculos (cultivados por 3 d já) seguidos por fluxo de 
itrogênio. A segunda etapa da fermentação foi operada a 30◦C e pH 
,0±0,5 por vários dias.
.3. Efeito da temperatura na fermentação em dois estágios
Conforme mencionado acima, quatro reatores de primeiro estágio foram
perados, respectivamente a 20◦C, 35◦C, 50◦C e 65◦C banho-maria durante 
oda a primeira fase da fermentação. A concentração de ácido láctico em 
ada reator foi ensaiada a cada 12 h durante o curso de tempo de 96 h. O 
eor de AGV na primeira etapa da fermentação foi registrado, 
espectivamente, às 36 h, 60 h e 96 h. Mas após 60 h a fase líquida do 
rimeiro estágio foi obtida e a fermentação do segundo estágio foi 
onduzida por 6 d de acordo com os procedimentos operacionais acima. A 
oncentração do VFA no reator de segundo estágio foi medida todos os dias 
urante todo o segundo estágio de fermentação. Os dados registados são as 
édias de testes em triplicado.
 Bioquímica84 (2014) 28–35 29
2.4. Estudo da via metabólica produtora e consumidora de 
ácido lático
Na co-fermentação de ácido lático de lodo e restos de comida, as 
bactérias consumidoras de ácido lático vieram tanto de WAS quanto de 
restos de comida[10]. É necessário separar dois substratos e investigar o 
desempenho, respectivamente, no consumo de ácido lático em diferentes 
temperaturas. Assim, quatro frascos de soro (600 mL cada) foram inoculados
com 50 mL WAS e 450 mL de águas residuais sintéticas contendo 10 g/L de 
ácido lático, 2,5 g/LK2HPO4·H2O, 1,5 g/L KH2PO4, e o valor do pH foi ajustado 
para 8,2±0,2 adicionando ácido clorídrico 5 M (HCl) ou hidróxido de sódio 5 
M (NaOH). Enquanto isso, outros quatro frascos de soro também foram 
preparados contendo a mistura de 50 mL de resíduos alimentares e 450 mL 
de águas residuais sintéticas como acima. Depois de lavados com nitrogênio,
os frascos de soro foram tampados com rolhas de borracha butílica elástica 
para separar o oxigênio do exterior e colocados nos agitadores de banho-
maria (120 rpm) em diferentes temperaturas: 20◦C, 35◦C, 50◦C e 65◦C. Para 
evitar a recuperação da atividade enzimática do procedimento experimental 
(como centrifugação, lavagem, suspensão, etc.) à temperatura ambiente, um
tempo de fermentação relativamente suficiente de 2 d foi conduzido em 
todos os frascos de soro. Assim, o ácido láctico e VFA foram testados após 2 
d. Simultaneamente, as atividades das principais enzimas formadoras de 
VFA (acetato quinase (AK) e propionil CoA para succinil CoA transferase 
(CoAT)) e enzimas produtoras de ácido lático (lactato desidrogenase (LDH), 
NAD lactato desidrogenase independente (iLDH)) no conjuntos de frascos de 
soro com WAS foram comparados.
2.5. Otimização do acúmulo de ácido lático para melhorar o rendimento de 
VFA enriquecido com ácido propiônico
De acordo com o procedimento da fermentação em dois estágios, quatro
reatores foram inicialmente operados a 50◦C, respectivamente por 1h, 2,5h, 
4h e 5,5h, que foram denominados de R-1h, R-2,5h, R-4h e R-5,5h. Em 
seguida, todos os reatores foram operados a 35◦C por mais 80h. Durante 
este primeiro estágio de fermentação, o ácido lático foi testado a cada 12 
horas. o sp(Eficácia ecífica)iência (Ea) da produção de ácido lático foi 
calculada comoEag/(g×d) = [lático]/[TCOD]× [tempo]. O balanço de massa de 
carbono foi analisado para registrar as variações das matérias 
fermentativas, cujas amostras foram coletadas antes e depois dos 50◦C pré-
tratamento, 48 h e 72 h a 35◦fermentação C. Mas após 48 h da fermentação 
do primeiro estágio, 0,9 L dos líquidos de suspensão do primeiro estágio 
foram obtidos, respectivamente, dos quatro reatores e outros quatro 
reatores do segundo estágio foram conduzidos de acordo. Após 5 d da 
segunda fase de fermentação (ou seja, o conteúdo de VFA era estável), o 
rendimento de VFA dos quatro reatores foi medido e o conteúdo de ácido 
propiônico em VFA foi documentado.
2.6. Métodos analíticos
O ácido lático foi medido por cromatografia líquida de alta eficiência
(Agilent 1200, EUA) equipada com detector de índice de refração 
(RID-10A) e Bio-Rad Aminex HPX-87 (300×7,8 mm) coluna analítica. 5 
mM (mmol/L) H2ENTÃO4foi usado como fase móvel a uma taxa de fluxo 
de 0,6 mL/min. O volume de injeção foi de 20 -L. O equivalente COD de 
ácido láctico foi de 1,08 g COD/g ácido láctico. O método para o ensaio 
de VFA foi documentado anteriormente[10]. O teor de VFA foi calculado 
como a soma dos ácidos acético, propiônico, n-butírico, iso-butírico,n-
ácido valérico e ácido isovalérico. O extrato celular para o ensaio de 
enzimas formadoras de AGV e enzimas formadoras de ácido lático foi 
preparado da seguinte forma: 50 mL da mistura de fermentação foram 
retirados de cada frasco de soro, que foi centrifugado, lavado e 
ressuspenso em 15 mL de Tris 30 mM/ HCl (pH 7,4). A suspensão foi 
sonicada a 35 kHz e 4◦C por 30 min para quebrar as células. Para 
remover os detritos, 2 mL da mistura foram centrifugados a 10.000 rpm 
em 4◦C por 30 min. O sobrenadante
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DQO/L a 35◦C com um grande desvio e esgotado rapidamente para 
zero menor que 36
intervalo de tempo de 24 h 
alcançado de forma estável t
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Figura 1.A configuração do sistem
oi então obtido na forma de extratos celulares, que foram mantidos 
esfriados em gelo antes de serem utilizados para ensaio de atividade 
nzimática. Acetato quinase (AK) é uma das principais enzimas para a 
rodução de ácido acético, e propionil CoA para succinil CoA transferase 
CoAT) desempenha um papel importante na formação de ácido propiônico. 
 lactato desidrogenase (LDH) e a lactato desidrogenase independente de 
AD (iLDH) estiveram envolvidas no metabolismo do ácido lático. De acordo 
om a literatura, as enzimas foram medidas da seguinte forma[9,13]. AK: 300
L da mistura de reação continha 81 mM de acetato de potássio, 4 mM de 
TP, 4 mM de MgCl2, 1,6 mM de fosfoenolpiruvato, 0,04 mM de NADH, 0,4 U/
L de lactato desidrogenase, 0,4 U/mL de piruvato quinase, 160 L de extrato
elular. CoAT: 250 -L da mistura de reação continha 100 -L da mistura de 
eação 1 (250 mM Tris-HCl, 1 mM de malato de sódio e 2,5 mM de NAD), 10 
L da mistura de reação 2 (220 U/mL de malato desidrogenase, 35 U/ mL de 
itrato sintase e tampão fosfato de potássio 100 M pH 6,8), 10 -L de acetato 
e sódio 1,5 M, 30 -L de succinil CoA 55 mM, 40 -L de água destilada e 60 -L 
e extrato celular. LDH: 200 -L da mistura de reação continha 50 mM de 
uccinato de sódio, 10 mM de piruvato de sódio, 3 mM de 1,6 frutose 
ifosfato, 0,1 mg/mL de NADH, 100 -L de extrato celular. iLDH: 200 -L da 
istura de reação continha 60 mg/L de brometo de 3-(4,5-dimetil-2-
iazolil)-2,5-difenil tetrazólio (MTT), 0,1 mM de fosfato de potássio,120 mg/L 
e metossulfato de fenazina (PMS ), 30 mM de ácido DL-lático e 100 L de 
xtrato celular. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a 
uantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 mol de substrato por 
inuto. A atividade enzimática específica foi definida como a unidade de 
tividade enzimática por 100 mg de VSS[14]. O TSS foi calculado a partir dos 
esíduos orgânicos secos (forno de 105◦C) do filtro e VSS foram medidos 
pós os resíduos orgânicos secos queimados por forno elétrico de meffle. A 
QO total foi testada após diluição adequada da mistura orgânica, e a DQO 
olúvel foi testada a partir da fase líquida após processo centrífugo (10.000 
pm por 15 min em 4◦C) das amostras de mistura. SS e COD foram testados 
e acordo com os métodos padrão[15].
.7. Análise de balanço de massa de carbono
Para a análise da massa de carbono, o SCOD residual foi calculado 
omo o SCOD menos os orgânicos, incluindo ácido lático e VFA, que se 
efere a outras matérias orgânicas potenciais para fermentação. O 
COD residual foi documentado como TCOD menos todo o SCOD, o que
mplica o carbono insolúvel no sistema de fermentação.
 Resultados e discussão
.1. Efeito da temperatura na primeira etapa da fermentação
Figura 2(a) representa a variação do ácido láctico durante 96 h da primeira 
ase da fermentação. O ácido lático foi acumulado gradativamente a 20◦C, e 
stabilizou em 11,2±0,5 g COD/L de 48 h a 60 h, o que foi semelhante aos nossos 
chados anteriores[10]. Depois disso, o ácido lático foi degradado gradualmente. 
o entanto, o ácido lático foi produzido rapidamente para 7,5±1,5 g
rmentação em dois estágios.
Figura 2.Efeito da temperatura no primeiro estágio de fermentação em (a) a 
concentração de ácido lático e (b) a concentração individual de VFA (acético (A), 
propiônico (P), iso-butírico (iso-B),n-butírico (n-B), isovalérico (iso-V) en-valérico (n-V)). As 
barras de erro representam desvios padrão de testes em triplicado.
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Figura 3.Fermentação de segundo estágio produzida a partir dos líquidos do primeiro estágio em 
X. Li e outros. / Revista de Eng
aso foi semelhante aos 65◦C que ocorreu o atraso da produção de 
cido lático. Mas o platô da concentração de ácido lático foi de apenas 
0,2±0,5 g DQO/L.
Figura 2(b) explicou a variação de AGV durante a primeira etapa da 
ermentação. O ácido acético foi o AGV majoritário (cerca de 85,7%) do 
eator operado a 20◦C, e a concentração de VFA foi de 2,8 g DQO/L em 
0 h. Obviamente, a concentração de VFA foi maior no reator operado a
5◦C durante todo o tempo de fermentação em comparação com 
utros reatores. Os teores majoritários de VFA foram ácido acético e 
ropiônico, que totalizaram aproximadamente 44,3% e 48,7% em 60 h 
e fermentação. No entanto, a concentração de VFA em 60 h foi de 
penas 2,3 g e 2,4 g DQO/L em 50◦C e 65◦C. É notável que a 
orcentagem de ácido butírico aumentou para 35,1% e 48,5%, 
espectivamente.
É amplamente reconhecido que a fermentação mesófila e 
ermofílica tem vários benefícios, incluindo a melhoria da solubilidade 
os compostos orgânicos e o aumento das taxas de reação química e 
iológica[16,17]. Portanto, o aumento da temperatura de 20◦C a 65◦C 
celerou as etapas de hidrólise, o que levou à concentração máxima de 
cido lático a 50◦C emFigura 2(a). Não foi necessário aumentar ainda 
ais a temperatura para 65◦C. A glicoamilase foi inibida a 60◦C na 
resença de lactato[18], o que poderia explicar o atraso de 24 h na 
rente e menor concentração final de ácido láctico a 65◦C do que em 50◦
. No entanto, para atingir o ácido lático máximo, o primeiro estágio 
ermentando inteiramente a 50◦C foi demorado (quase depois de 72 h) 
 consumiu energia. A rápida depleção de ácido láctico a 35◦C pode ser 
evido à rápida produção de VFA deFigura 2(b). No entanto, o grande 
esvioFigura 2(a) em 35◦C indicou a dificuldade de preservar a 
oncentração máxima de ácido láctico, pois foi rapidamente convertido 
m VFA emFigura 2(b). Pode haver duas razões para isso. Uma delas 
ra que a co-fermentação de restos de comida e lodo a 35◦C pode ser 
acilmente influenciado pela ligeira mudança das circunstâncias, como 
 variação do pH e a composição dos resíduos alimentares[12,19]. A 
utra razão, que será discutida a seguir, foi que as atividades 
icrobianas produtoras de ácido lático e AGV foram ambas as mais 
ltas, o que explica a rápida variação dos compostos orgânicos.
.2. Efeito da temperatura de fermentação do primeiro estágio na fermentação do 
egundo estágio
Fig. 3explicou o desempenho da segunda etapa da fermentação dos 
uatro líquidos acima obtidos às 60 h na primeira etapa. EmFig. 3(a), a 
oncentração de ácido propiônico dos líquidos operados a 20◦C e 50◦C não 
eve diferença significativa (P valor = 0,13 > 0,05), que estava em boa 
oncordância emFigura 2(a) que o ácido lático foi semelhante entre si em 60 
. Entretanto, em ambos os líquidos operados a 50◦C e 65◦C, havia uma 
ração de ácido butírico (cerca de 7% e 13% em VFA) inicialmente do líquido 
e primeira fase (verFigura 2(b)), o que rendeu a porcentagem de ácido 
ropiônico apenas 63,5% e 61,9% (verFig. 3(b)). Concentração de ácido 
ropiônico do líquido operado a 35◦O C manteve-se em torno de 4,5 g DQO/
 até o segundo estágio, que foi todo proveniente do líquido do primeiro 
stágio (Figura 2(b)). Portanto, o desempenho ruim ocorreu no segundo 
stágio se nenhum ácido lático existisse no líquido do primeiro estágio. O 
esempenho da fermentação do segundo estágio foi altamente dependente 
a concentração de ácido lático, bem como do AGV restante do líquido do 
rimeiro estágio. Porque o VFA do primeiro estágio se somaria a parte da 
oncentração de VFA do segundo estágio. Para obter uma fermentação 
atisfatória no segundo estágio, é necessário preservar o ácido lático no 
rimeiro estágio. Portanto, com base na presente tecnologia de 
ermentação em dois estágios, o sucesso da fermentação no segundo 
stágio dependia muito do tempo adequado de fermentação do primeiro 
stágio, quando o ácido lático atingia a concentração máxima.
diferentes temperaturas. Todos os líquidos do primeiro estágio foram buscados após 60 h da fermentação 
do primeiro estágio. a: concentração de ácido propiônico; b: porcentagem de ácido propiônico em VFA. As 
barras de erro representam desvios padrão de testes em triplicado.
3.3. Estudo da via metabólica produtora e consumidora de 
ácido lático
Emtabela 1, estudo metabólico elaborou o desempenho do 
consumo de ácido lático de WAS em diferentes temperaturas. Pode-se 
notar que o consumo de ácido lático foi de 98,4% aos 20◦C. Quando a 
temperatura subiu para 35◦C, foi observado consumo completo. No 
entanto, a taxa de consumo foi notavelmente reduzida para apenas 
2,4% em 50◦C e 2,3% aos 65◦C sem diferença significativa (Pvalor >0,05), 
que consistia com os achados emFigura 2(b). A medição das atividades 
relativas de enzimas é um método alternativo para avaliar a atividade 
microbiana[14,20]. Os ácidos acético e propiônico foram as principais 
composições dos AGV emtabela 1. Assim, apenas as enzimas chave 
relativas às duas gerações de VFA e ácido láctico foram medidas. A 
enzima formadora de VFA a 50◦C foi muito menor do que em 35◦C, o 
que poderia explicar que apenas 1,3 g COD/L VFA foi gerado a partir do 
ácido lático. Portanto, a temperatura a 50◦C foi bom para o acúmulo de 
ácido lático. No entanto, a atividade da LDH para o ácido lático
32 X. Li e outros. / Revista de Engenharia Bioquímica84 (2014) 28–35
tabela 1
Consumo de ácido lático, produção de AGV e atividade das enzimas em diferentes temperaturasa.
Unid Eficiência do consumo 
de ácido lático (%)
produção VFA
(g DQO/L)b
Atividade de AK
(U/100 mg VSS)
Atividade de CoAT
(U/100 mg VSS)
Atividade de LDH
(U/100 mg VSS)
Atividade de iLDH
(U/100 mg VSS)
T =20±1◦C
T =35±1◦C
T =50±1◦C
T =65±1◦C
98,4±1.2
100
2.4±0,2
2.3±0,2
5.6±0,4
8.4±0,71.3±0,2
1.1±0,2
2.871
7.214
1.387
1.297
3.531
7.113
1.004
0,456
4.473
8.343
5.291
4.400
0,198
0,111
0,002
0,002
aOs dados são as médias de testes duplicados e seus desvios padrão. Para uma comparação clara, a unidade de atividade enzimática foi expressa como U/100 mg VSS, que foi multiplicado por 100 a 
p
,9±2,3% propinônico, 6,8±0,1% de ácido butírico a 35◦C; 53.3±2,1% acético, 26,5±0,8% 
p , 18,2±0,5% butírico, 7,7±0,1% de ácido valérico a 65◦C.
p
t
á
p
 
a
A
r
e
f
f
f
m
p
l
c
e
l
i
F
i
d
18
15
12
9
6
50℃(1h)+35℃(3d)
50℃(2,5h)+35℃(3d)
50℃(4h)+35℃(3d)
50℃(5,5h)+35℃(3d)
3
0
0 20
Tempo de fermentação da primeira etapa (h)
40 60 80
3
p
m
C
l
f
n
a
R
D
m
f
F
d
Co
nc
en
tr
aç
ão
 d
e 
ác
id
o 
lá
ct
ic
o 
(g
 D
Q
O
/L
)
artir dos dados absolutos.
bForam 41,8±1,3% acético, 58,2±2,1% de ácido propinônico a 20◦C; 32.3±1,1% acético, 60
ropinônico, 20,2±0,8% de ácido butírico a 50◦C; 48.2±1,3% acético, 25,9±0,9% propinônico
rodução em 35◦C exibiu o maiortabela 1, o que foi consistente com a 
emperatura ideal para o crescimento bacteriano láctico [21,22]. Mas o 
cido lático era consumido assim que era produzido a 35◦C, que 
rejudicou o acúmulo de ácido lático.
Nenhuma depleção de ácido lático foi observada a partir da fermentação de resíduos
limentares únicos em diferentes temperaturas (dados complementares, Tabela S1). 
lém disso, ocorreu um leve aumento de ácido lático em quatro temperaturas. Os 
esíduos alimentares, enriquecendo os hidratos de carbono disponíveis, são assim uma 
spécie de substância produtora de ácido láctico favorável. Portanto, a maior parte do 
enômeno de consumo de ácido lático foi exibida a partir do WAS.
A via metabólica proposta de produção e consumo de ácido lático 
oi mostrada emFig. 4 [13,23]. Obviamente, as matérias fermentativas 
oram primeiro convertidas em proteínas, polissacarídeos (ou 
onossacarídeos) e depois em piruvato. O ácido lático foi produzido a 
artir do piruvato, que envolveu um equilíbrio químico com o ácido 
ático. A produção de AGV a partir do piruvato foi assumida para 
ompetir com a produção de ácido láctico. Como a seta azul mostrada 
m Fig. 4, a temperatura ótima para intensificar a produção de ácido 
ático era de 35◦C em vez de 50◦C. Mas é essencial empregar 50◦C para 
nibir severamente o consumo de ácido láctico (as setas vermelhas em
ig. 4). Portanto, é interessante explorar o novo método de 
mplementação de pré-tratamento a 50◦C antes da fermentação a 35◦C 
urante a primeira etapa da fermentação.
.4. Otimização do acúmulo de ácido lático com diferentes tempos de 
ré-tratamento
A otimização do novo método de acúmulo de ácido lático foi 
ostrada emFig. 5. Quando a mistura foi inicialmente pré-tratada a 50◦
 por 1 e 2,5 h (ou seja, de R-1 h e R-2,5 h), a concentração de ácido 
ático atingiu 16,2±0.9 e 14.1±0,6 g DQO/L após 35 h e 36 h de 
ermentação a 35◦C. Sem reservas, o ácido lático diminuiu rapidamente 
o último tempo de fermentação. O ácido lático de R-1 h foi esgotado 
ntes de 60 h de fermentação. No entanto, o ácido lático em R-4 h e 
-5,5 h foi acumulado até o platô máximo de 16,6±0,5 e 15,3±0,4 g 
QO/L após 33 h e 44 h. O ácido lático máximo obtido em R-4 h foi 
uito maior do que o do método anterior[10]e os 50 inteiros◦ensaio de 
ermentação C. Embora
lodo
+
Desperdício de comida
Proteína
Polissacarideo
Aminoácido
piru
Monossacarídeo
Fosfoenolpiruvato
Para intensificar a produção de ácido láctico a 35 °C Par
inibir severamente a produção de AGV a 50 °C
igura 4.Via metabólica proposta para produção e consumo de ácido lático aos 35 anos◦C e 50◦C
as referências a cores nesta legenda de figura, o leitor deve consultar a versão web deste artig
Figura 5.Efeito de diferentes tempos de pré-tratamento a 50◦C no acúmulo de ácido lático durante a 
primeira etapa da fermentação. As barras de erro representam desvios padrão de testes em triplicado.
a concentração máxima de ácido láctico de R-1 h e R-4 h foram semelhantes 
emFig. 5, o tempo de fermentação adequado para R-1 h para obter a 
concentração máxima de ácido lático seria facilmente afetado pela alteração 
da composição dos resíduos alimentares, variação do pH, etc.[24]. Em 
contraste, foi mais prático aplicar R-4 h, porque o ácido lático reteve na 
concentração máxima por um tempo relativamente longo.
Existem duas forças que afetam a eficiência específica do acúmulo 
de ácido lático (Ea), que são a força da produção de ácido láctico (eup) e 
a do consumo de ácido láctico (euc). Quandoeupé mais forte do queeuc, 
ocorreu o acúmulo de ácido lático. Durante esta fase, o acúmulo de 
ácido lático exibiu um aumento linear, que exibiu pelo modelo cinético 
de regressão linear em(
Fig. 6(de Anúncios)). O valor da eficiência específicaEafoi calculado como: 
Ea g/(g×d) = [lático]/[TCOD]× [tempo] e marcado emFig. 6. O
Ácido acético
AK
vato LHD iLHD Ácido lático
Casaco AK: Acetato quinase
LDH: Lactato desidrogenase iLDH: 
LDH independente de NAD CoAT: 
Propionil CoA- succinil CoA
transferase
Ácido propiónico
a 
. Apenas as principais enzimas testadas neste estudo são rotuladas. (Para interpretação 
o.)
X. Li e outros. / Revista de Engenharia Bioquímica84 (2014) 28–35 33
a b
16
14
12
10
8
6
4
2
0
16
14
12
10
8
6
4
2
0
R-1h R-2,5h
R2= 0,9989Ea=0,38 g/ g·d R2= 0,998Ea=0,41 g/ g·d
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Tempo (h) Tempo (h)
c d
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
R-4h R-5,5h
R2= 0,9965Ea=0,52 g/ g·d R2= 0,9918Ea=0,44 g/ g·d
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50
Tempo (h) Tempo (h)
F imeira
a
A
a 
t
á
c
c
f
r
a
processo em alta
comparado com isso
lodo que era
3
t
f
t
c
A
S 
d
R
R
P
F
d
4
d
p
r
Co
nc
en
tr
aç
ão
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ác
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o 
lá
ct
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Co
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 d
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ác
id
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(g
CO
D
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)
Co
nc
en
tr
aç
ão
 d
e 
ác
id
o 
lá
ct
ic
o 
(g
CO
D
/L
)
Co
nc
en
tr
aç
ão
 d
e 
ác
id
o 
lá
ct
ic
o 
(g
CO
D
/L
)
igo(. 6.Láctico)acúmulo de ácido em diferentes tempos pré-tratados a 50◦C durante a pr
g/(g×d) = [lático]/[TCOD]× [tempo].
ltíssimaEafoi obtido em R-4 h, que indicou a maior eficiência para o 
cúmulo de ácido lático. A diminuição deEaem R-5,5 h referiu que maior
empo de pré-tratamento (5,5 h) suprimiu a atividade de produção de 
cido lático. E a diminuição deEaem R-1 h e R-2,5 h foram devidos ao 
urto tempo de pré-tratamento, que não conseguiu suprimir o 
onsumo de ácido lático. Além disso, a força deeup
oi equilibrado paraeucem R-4h e R-5,5h após 40h, que se referiam à 
etenção de ácido lático. Enquanto em R-1 h e R-2,5 h,eucfoi dominado 
pós 35 h e assim ocorreu a depleção de ácido láctico.
.5. Análise de massa de carbono para a primeira etapa da fermentação com diferentes 
empos de pré-tratamento
A análise de massa de carbono emFig. 7explicou a conversão da matéria 
ermentativa durante a primeira etapa da fermentação com diferentes 
empos de pré-tratamento a 50◦C. Não houve diferença significativa na 
omposição da matéria orgânica após 50◦C pré-tratamento (ou seja, poucos 
GV e ácido láctico foram produzidos). No entanto, um ligeiro aumento de 
COD foi observado com o aumento do tempo de pré-tratamento. Após 48 h
e fermentação a 35◦C, SCOD foi transferido para ácido láctico em R-2,5 h, 
-4 h e R-5,5 h. Mas o ácido lático permaneceu apenas 6,9±0,9 g COD/L em 
-1 h após 48 h, e VFA foi então produzido para 6,2±0,6 g DQO/L. 
osteriormente, às 60 h em R-1 h, o ácido lático foi esgotado e 13,8±
inalmente, foram produzidos 0,9 g COD/L de VFA. Em R-2,5 h, o ácido lático 
iminuiu gradativamente após 35 h, e 2,3 g DQO/L de VFA foi observado em 
8 h em R-2,5 h. No entanto, menos VFA foi produzido em R-4 h e R-5,5 h 
urante toda a fermentação a 35◦C, e o ácido lático representaram a maior 
arte da SCOD.
Ao usar estratégias de pré-tratamento, a hidrólise aprimorada de 
esíduos contendo polissacarídeos complexos pode ser alcançada[25,26].
 etapa da fermentação.Earepresentou a eficiência específica do acúmulo de ácido lático: ENeste estudo, o pré-tratamento termofílico a 50◦C melhorou o processo 
de hidrólise. Embora outros estudos tenham observado que o VFA do 
Figura 7.Análise do balanço de massa de carbono da fermentação do primeiro estágio usando diferentes 
tempos de pré-tratamento a 50◦C. Os dados relatados são as médias de testes triplicados. As barras de erro 
representam desvios padrão de testes em triplicado.
34
 
[
[
[
[
[ 
[
[
[
 
[
[
[
[
[
matéria-prima para produção deeu-ácido láctico, Environ. ciência Tecnol. 33 (1999) 
198-200.
Figura 8.Efeito da diferença de tempo de pré-tratamento do líquido do primeiro estágio na concentração 
de VFA após 5 d de fermentação do segundo estágio. Os dados relatados são as médias de testes em 
t
a
c
l
l
[
á
á 
f
i
l
3
d
f
s
s
c
f
C
±
e 
7
á
a
a
4
i 
f
p
5
i
a
r
n
riplicado. Os dados de controle foram encaminhados de[10].
 substância da fermentação em duas etapas foi o resíduo alimentar, 
aracterizado por alto teor de carboidratos, que foi convertido em ácido 
ático na primeira etapa. Além disso, propionibacterium alimentado por 
actato foi considerado menos produtivo quando a temperatura aumentou
29]. Portanto, o pré-tratamento a 50◦C inibiu a atividade do consumo de 
cido lático, o que levou a uma menor produção de AGV e assim reteve o 
cido lático em R-4 h e R-5,5 h. No entanto, a capacidade de formação de VFA
oi recuperada em R-1 h e R-2,5 h devido ao tempo de pré-tratamento 
nsuficiente, o que resultou em alta produção de VFA e diminuição de ácido 
ático.
.6. Desempenho da segunda etapa da fermentação usando líquidos com 
iferentes tempos de pré-tratamento
Após 48 h da primeira etapa de fermentação, os quatro líquidos 
oram inoculados comP. acidipropionicie fermentado nos reatores de 
egundo estágio.Fig. 8denotou o rendimento de VFA nos reatores de 
egundo estágio após 5 d do segundo estágio de fermentação. As 
oncentrações de VFA derivadas de R-1 h a R-5,5 h de pré-tratamento 
oram respectivamente 12,1±0,5, 12,4±0,5, 15,3±0,7, 13,6±0,6 g DQO/L. 
orrespondentemente, as concentrações de ácido propiônico foram 7,2
0,2, 8,6±0,3, 10,7±0,5, 9,4±0,4 g DQO/L. O teste de controle de nosso 
studo anterior exibiu 10,4 g COD/L VFA, que continha ácido propiônico
,1 g COD/L[10]. Assim, o rendimento máximo do VFA enriquecido com 
cido propiônico do segundo estágio no segundo estágio foi alcançado 
 partir de R-4 h, o que foi melhorado em 47,1% em relação ao estudo 
nterior.
. Conclusão
Ambas as vantagens e desvantagens foram ilustradas no 
nteiramente mesofílico (35◦C) ou termofílica (50◦C) aplicando a primeira
ase de fermentação. O ácido lático foi consumido assim que foi 
roduzido a 35◦C, a eficiência da produção e consumo de ácido lático a 
0◦C é relativamente menor do que em 35◦C. Por fermentação 
nicialmente a 50◦C por 4 h e mais a 35◦C por 2 d, o ácido lático foi 
cumulado sem consumo na primeira etapa, o que levou ao 
[endimento máximo de 15,3 g DQO/L AGV (69,9% de ácido propiônico) 
a fermentação da segunda etapa.
g jornal84 (2014) 28–35
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e 
Desenvolvimento de Alta Tecnologia da China (863) (2011AA060903), 
pela National Science Foundation of China (51178324 e 51278354) e 
pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais.
Apêndice A. Dados suplementares
Os dados complementares associados a este artigo podem ser consultados, na
versão online, emhttp://dx.doi.org/10.1016/j.bej.2013.12.020.
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