relatório de micro - fungos 2

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uNIVERSIDADE VILA VELHA
Joana Lutzke DONDONI E JOYCE DANIELA FRANCISCO BITTENCOURT
CARACTERIZAÇÃO MACROSCÓPICA DAS COLÔNIAS DE FUNGOS E CARACTERIZAÇÃO MICROSCÓPICA PELA TÉCNICA DE MICROCULTIVO
VILA VELHA
2017
uNIVERSIDADE VILA VELHA
Joana Lutzke DONDONI E JOYCE DANIELA FRANCISCO BITTENCOURT
CARACTERIZAÇÃO MACROSCÓPICA DAS COLÔNIAS DE FUNGOS E CARACTERIZAÇÃO MICROSCÓPICA PELA TÉCNICA DE MICROCULTIVO
Relatório de microbiologia apresentado a universidade Vila Velha como exigência parcial para obtenção de nota com objetivo na aprovação em microbiologia na medicina veterinária.
Orientador: Marcus Alexandre Vaillant Belt
VILA VELHA
2017
1- INTRODUÇÃO:
Microbiologia é o estudo de organismos microscópicos nos seus variados aspectos como morfologia, fisiologia, reprodução, genética, taxonomia e também interação com outros seres e meio ambiente. Deriva de três palavras gregas: Micro (pequeno), bio (vida) e logia (estudo).
Os cientistas acreditam que os microrganismos foram originados há mais de 4 bilhões e anos, porém a microbiologia é uma ciência nova. Os microrganismos foram observados pela primeira vez há 300 anos, entretanto estudos significativos surgiram há apenas 100 anos. Dentre os microrganismos estudados estão vírus, bactérias, algas e fungos. Alguns esses são nocivos à saúde de animais, humanos e plantas, além disso, são responsáveis pela deterioração de tecidos, madeiras e metais. Contudo, são importantes, pois realizam alterações no ambiente e são essenciais para manutenção da vida, como por exemplo, microrganismos simbióticos.
Além da área farmacológica e médica, a microbiologia também tem grande importância na área industrial, alimentícia, genética e agricultura. Os microrganismos abordados ao longo desse trabalho serão os fungos. A micologia é o estudo dos fungos, que são seres eucariontes, divididos em unicelulares (leveduras) e multicelulares (bolores e cogumelos). Inicialmente eram considerados como vegetais, porém possuem um conjunto de características que os diferem de plantas, como por exemplo, não sintetizam clorofila ou qualquer pigmento. E possuem, também, características semelhantes aos animais, como a presença de quitina na parede da maioria das espécies de fungos e possuem capacidade de armazenar glicogênio. Hoje eles são classificados no reino Fungi. 
São seres ubíquos, ou seja, estão em todos os lugares, encontram-se em vegetais, animais, no homem, em detritos e em abundância no solo. A dispersão desses fungos na natureza é feita por várias vias: animais, homem, insetos, água e, principalmente, pelo ar. Os fungos trazem tanto benefícios quanto malefícios. Entre seus benefícios estão a produção de antibióticos; são os maiores decompositores do planeta, degradando a matéria orgânica na natureza e disponibilizando nutrientes para os próximos níveis tróficos; biotransformação, auxiliam através da fermentação a produção de queijos, cervejas, vinhos, pães etc; micorrizas, associação mutualistica entre fungos e raizes de plantas; controle biológico, eliminacão de pragas em plantações; entre outros.
De 250.000 espécies de fungos, há 150 patogênicos. Entre seus maleficios estão as micoses, que é quando o fungo que está no organismo do animai causando alguma lesão. Existem as intoxicações, que através da ingestão de toxinas fúngicas, geralmente o fungo não está mais presente, provoca doenças no animal. E por fim as alergias, nas quais são causadas pela presença do fungo que vai gerar uma resposta imune exacerbada e o próprio corpo vai gerar lesões. Além de provocar biodeterioração, por exemplo, mofos em roupas, paredes, objetos e alimentos. Por esses motivos dá-se a importância da caracterização e classificação dos fungos conforme espécie, para escolher o melhor tratamento e controle biológico.
Com relação a sua morfologia são classificados em quatro tipos: Leveduras (unicelulares), bolor, cogumelo (ambos multicelulares) e há fungos que podem crescer ora bolor, ora levedura, dependendo do ambiente, temperatura e nutrientes do meio. Esses fungos são classificados como Dimórficos.
Os fungos se desenvolvem em meios especiais de cultivo, formando colônias de dois tipos: leveduriforme e filamentosas. As colônias levedurifomes, em geral, são pastosas ou cremosas e caracterizam o grupo das leveduras. Como dito acima, são fungos unicelulares, em que a própria célula cumpre as funções vegetativas e reprodutivas. As estruturas microscópicas mais comuns são os blastoconídios, que possuem forma arredondada ou ovulada. Por brotamento da célula-mãe, formam-se os brotos ou as células-filha.
As colônias filamentosas que identificam os bolores podem ser algodonosas, aveludadas, pulvurulentas, com os mais variados tipos de pigmentação. Esses organismos são constituídos fundamentalmente pelas hifas, que podem ser septadas ou não-septadas. O conjunto de hifas dá-se o nome de micélio e eles possuem especializações, como micélio vegetativo que se desenvolve no interior do substrato e é um elemento de sustentação e absorção de nutrientes. Acima tem o micélio aéreo que podem diferenciar-se ou formar estruturas de reprodução – micélio reprodutivo. Essas estruturas têm origem sexuada ou assexuada e são de importância fundamental na identificação morfológica da maioria das espécies fúngicas.
Os conídios representam o modo mais comum de reprodução assexuada e é a estrutura responsável pela dispersão dos fungos na natureza. Os conídios podem ser hialinos ou pigmentados e apresentam formas diferentes, esféricos, fusiformes, cilíndricos, piriformes etc., com parede lisa ou rugosa, formados por uma única célula ou ter septos em um ou dois planos, apresentando-se isolados ou agrupados.
Na clínica médica veterinária, isolar esses microrganismos faz parte do diagnóstico, e uma vez classificados e caracterizados com as informações supracitadas, a escolha do tratamento médico adequado. As técnicas laboratoriais pra caracterizar os microrganismos variam desde uma microscopia simples à análise de material genético encontrado na célula.
Visto isso, no presente trabalho iremos apresentar método de inoculação, caracterização macroscópica, microscópica, utilizando método de microcultivo e utilização do microscópio de luz.
2 – OBJETIVO:
O objetivo do trabalho apresentado é o cultivo e a caracterização macroscópica da colônia, de acordo com a sua coloração, forma, borda, elevação, aspecto e pregueamento. Além da caracterização microscópica dos fungos conforme sua morfologia, tudo isso a fim de identificar o possível gênero do fungo.
3 – MATERIAIS:
Os materiais que se utilizou para inoculação, preparo e caracterização das colônias e fungos estão descritos abaixo:
· Materiais de Biossegurança ( EPI’s);
· Ágar Sabourd;
· Alça bacteriológica;
· Bico de Bunsen;
· Lâmina de vidro para microscopia;
· Lamínula;
· Microscópio de luz;
· Corante Azul de Lactofenol;
· Kit câmara úmida (Placa de Petri, Palito de dente e Algodão).
4 – METODOLOGIA:
A metodologia do experimento foi realizada quando o professor Marcus Alexandre instruiu os alunos na aula prática de Microbiologia Geral para a caracterização macroscópica e microscópica de fungos com base na técnica de microcultivo.
Inicialmente, cada dupla de alunos recebeu uma placa de Petri contendo uma cultura fúngica já anteriormente inoculada e incubada em Ágar Sabourad dextrose (que facilita o crescimento fúngico) em aerobiose numa faixa de temperatura entre 22 e 28°C por um período de 3 a 5 dias.
A partir dessa cultura fúngica foi feito primeiramente a caracterização macroscópica das colônias a partir de critérios de: cor (tanto do verso, quanto do reverso), forma (circular, irregular), borda (regular, irregular, radial, rizóide), elevação (plana, elevada, convexa, monticular), aspecto (aveludado, algodonoso, farináceo e presença ou não de pregueamento (visualizado pelo reverso) e/ou gotas de orvalho (visualizado pelo verso). Essa caracterização macroscópica compreende uma identificaçãoinicial e à olho nu da colônia, permitindo um primeiro direcionamento para a identificação completa dos fungos, necessitando-se assim de uma caracterização microscópica para resultados mais específicos.
Para a caracterização microscópica foi feita a técnica de microcultivo. Essa técnica consiste em permitir a visualização microscópica dos fungos a partir do microcultivo de esporos fúngicos. Os passos dessa técnica constituem-se em:
1. Ágar Sabourad foi cortado em pequenos círculos a partir de um tubo de ensaio levemente flambado no bico de Bussen;
2. O ágar cortado foi colocado em uma lâmina para microscópio de luz a partir do auxílio de uma alça bacteriológica flambada antes e após o procedimento;
3. Coleta de uma pequena porção de esporos fúngicos pela alça bacteriológica, que foram colocados na superfície do ágar que fora cortado;
4. A alça bacteriológica foi novamente flambada no bico de Bussen;
5. Foi colocada uma lamínula em cima da lâmina com ágar e os esporos;
6. A lâmina foi posta numa câmara úmida, composta por palitos de dente (para manter a lâmina acima da placa) e um pedaço de algodão molhado (para manter o ambiente úmido) numa placa de Petri.
Depois da incubação por alguns dias, esse microcultivo foi utilizado para a observação da microscopia. Para isso, a lamínula foi descolada do ágar onde foi feito o microcultivo do fungo (a partir do auxílio de uma pinça de dissecação) e pressionada em cima de outra lâmina com uma gota do corante azul de lactofenol.
Logo em seguida foi feita a observação da lâmina no microscópio de luz. A observação pela objetiva de 40x já foi o suficiente para a identificação das estruturas fúngicas, não sendo assim necessária a visualização na objetiva de imersão.
Os resultados obtidos serão posteriormente aqui discutidos.
5 - RESULTADOS:
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5. 
5.1. Características macroscópicas:
· Cor (verso): Marrom;
· Cor (anverso): Marrom;
· Forma: Circular;
· Borda: Regular;
· Elevação: Plana;
· Aspecto: Farináceo.
5.2. Características microscópicas:
Presença de hifas septadas hialinas, com conidióforo que formava uma dilatação em sua extremidade (vesícula), de cuja superfície havia formação de uma fileira de fiálides, que originavam cadeias de conídios pigmentados.
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1. Micélio Vegetativo 2. Micélio Aéreo 3. Micélio Reprodutivo 4. Conidióforo 5. Fiálide 6. Conídio 7. Hifas 8. Septo 
6 - DISCUSSÃO:
Em meios especiais de cultivo, os fungos podem se apresentar em forma de colônias leveduriformes (unicelulares) ou filamentosas (multicelulares). A colônia do fungo do presente trabalho trata-se de uma colônia filamentosa, também chamada de bolor. 
Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte básico a hifa, que pode ser septada ou não septada (cenocítica) (ANVISA, 2004), e o seu conjunto é chamado de micélio.
Quando os bolores se desenvolvem no ágar ou em outras superfícies sólidas, há formação de hifas, denominadas hifas vegetativas, que crescem sobre ou por entre a superfície do meio de cultura, e também hifas que se projetam por sobre a superfície do meio, chamadas de hifas aéreas (MURRAY et al, 2009).
A partir da hifa formam-se esporos, para propagação das espécies. Na grande maioria dos fungos, os esporos podem ser chamados de conídios, pois nascem diretamente delas ou sobre estruturas ligas a elas (ANVISA, 2004).
O segmento de hifa que sustenta a cabeça de frutificação com conídios, é denominada conidióforo. Sendo que este pode ser dividido em segmentos secundários, produtores de esporos, chamada de fiálides. (KONEMAN et al, 2001).
Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificação de um fungo, pois a classificação de filamentosos é feita, em regra, pelas características morfológicas, tanto macroscópicas (cor, aspecto, textura da colônia, etc.), quanto microscópicas (forma e cor da hifa, presença ou não de septos, tipo e arranjo de esporos, etc.), além da velocidade de crescimento (lenta, moderada ou rápida) (ANVISA, 2004).
A partir da técnica de microcultivo, que consistiu na incubação dos esporos da colônia de fungos filamentosos em uma câmara úmida por cerca de 5-7 dias em temperatura ambiente, propiciou-se o crescimento do fungo. A câmara úmida é um recipiente com água retida em algodão, que tem como objetivo garantir o desenvolvimento do microrganismo sem que ocorra a desidratação da lâmina.
Após essa técnica foi usado o corante azul de lactofenol. Nesse corante, a presença de fenol mata os microrganismos e o ácido lático preserva as estruturas fúngicas. A visualização e preservação de fungos através deste corante são excelentes, uma vez que não ocorre plasmólise ao matar os organismos. O azul de lactofenol ou azul de algodão, como também é chamado, é um corante diferencial para quitina e celulose, elementos da parede celular dos fungos.
Com isso, foi feita a visualização do fungo em questão em microscopia de luz, observando-se que se tratava de um fungo filamentoso com hifas septadas hialinas, com conidióforo que formava uma dilatação em sua extremidade (vesícula), de cuja superfície havia formação de uma fileira de fiálides, que originavam cadeias de conídios pigmentados.
Essas informações microscópicas somadas às informações macroscópicas anteriormente verificadas, como a coloração marrom em seu verso e marrom no anverso, forma circular, borda regular, elevação plana e aspecto farináceo, nos permite caracterizar o fungo em questão como possivelmente pertencente ao gênero Aspergillus sp.
Em cultivo, a espécie de Aspergillus se apresenta com desenvolvimento rápido (3 à 5 dias) de colônia granulosa, podendo ser amarela, verde-amarelada, castanho-amarelada ou verde, com borda definida (KONEMAN, 2001). 
Seus principais representantes são o Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger e Aspergillus flavus. 
O Aspergillus terreus possuem colônias de cor camurça, marrom ou marrom alaranjada e, com frequência pode-se observar pregas radiais originadas no centro da colônia. Já o Aspergillus fumigatus, suas colônias variam entre granulosas e algodonosas, se apresentando na cor esverdeada, cinza-esverdeada ou marrom-esverdeada. Enquanto, o Aspergillus niger apresenta uma superfície bem característica, coberta por conídios negros-azeviche. Por fim, as colônias de Aspergillus flavus são granulares a lanosas e apresentam coloração amarela ou marrom-amarelada (KONEMAN, 2001).
Sendo assim, a colônia de fungos do trabalho em questão trata-se, possivelmente, de um crescimento micológico de Aspergillus terreus.
O gênero Aspergillus sp (Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavus e A. niger) é o mais citado na literatura como fungo oportunista, especialmente em pacientes transplantados de medula óssea e neutropênicos. A inalação de esporos é a via mais comum de transmissão e os surtos de aspergilose são associados a reformas e construções, dentro e ao redor de hospitais. Doença pulmonar e, mais raramente, sinusite, são as manifestações de aspergilose (ANVISA, 2004). 
7 - CONCLUSÃO:
Conforme resultados apresentados e discutidos acima, conclui-se que o microcultivo, caracterização macroscópica e microscópica são de suma importância para identificação do gênero do fungo.
Como os fungos trazem benefícios e malefícios, saber o gênero do fungo será muito importante para determinar qual procedimento seguir diante da identificação dele. Os fungos benéficos serão direcionados, como por exemplo, na produção de antibióticos, biotransformação, controle biológico, etc. Já os maléficos serão direcionados para uma forma de tratamento que seja mais eficaz dependendo do seu gênero.
O fungo identificado nesseestudo foi o Aspergillus terreus, sendo de fundamental importância para a área médica, devido ao seu potencial patogênico.
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
KONEMAN, Elmer W. et al. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 5 ed. Rio de Janeiro: Medsi, 2001.
ANVISA. Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica: Módulo VII. 2004. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_7_2004.pdf>. Acesso em: 06 maio 2017. 
MURRAY, Patrick R. et al. Microbiologia médica. 6 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2010.
PELCZAR, Michael Joseph; CHAN, Eddie Chin Sun,; KRIEG, Noel R. Microbiologia: conceitos e aplicações : volume 1. 2. ed. São Paulo, SP: Makron Books, 2009.
QUINN, P. J et al. Microbiologia veterinária e doenças infecciosas. Porto Alegre: Artmed, 2007.