Experimento 6 Bioquímica G3 corrigido

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS
DE
RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Bioquímica Experimental
PROF. DR. ARTHUR H.C. DE OLIVEIRA
Cinética enzimática: Efeito de inibidores sobre a
velocidade de reação
Daniela Brunelli Teada – n° USP 11014416
Suzane Ap. Alves Pires– n° USP 10408201
Ribeirão Preto – SP
2021
André
Nota
9,0/9,0
1. OBJETIVO
Estudar a influência de inibidores da atividade da enzima, pelo inibidor fosfato de
sódio em diferentes concentrações, no reação de catálise da fosfatase ácida. Observar o
efeito do inibidor fosfato de sódio na velocidade da reação com a enzima fosfatase
ácida, bem como determinar o tipo de inibição e calcular a constante de dissociação (Ki).
2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a análise, foi utilizado o inibidor fosfato de sódio com as concentrações 0,5;
1,5 e 3,0 mmol/L, utilizando os volumes de tampão, água, pNFF, fosfato e enzima. Os
dados do protocolo estão descritos na tabela a seguir.
Tabela 1. Absorbância em diferentes concentrações de substrato e inibidor.
Nº Tubo [pNFF] A410nmsem inibidor
A410nm
0,5 mM
A410nm
1,5 mM
A410nm
3,0 mM
1 0,05 0,105 0,051 0,021 0,009
2 0,07 0,132 0,056 0,028 0,015
3 0,1 0,171 0,064 0,039 0,021
4 0,15 0,233 0,081 0,058 0,024
5 0,2 0,280 0,111 0,068 0,036
6 0,4 0,387 0,211 0,109 0,060
7 0,5 0,445 0,256 0,164 0,073
8 1,0 0,515 0,308 0,180 0,139
9 2,0 0,571 0,427 0,301 0,192
10 5,0 0,615 0,583 0,357 0,378
André
Nota
2,0/2,0
Para a determinação da atividade da enzima é necessário saber a concentração
de p-nitrofenolato formado, utilizamos a Lei de Lambert-Beer, o cálculo é feito para o
tubo 1 sem inibidor. Sendo assim, teremos:
0,105 = 17600.1.C
C = 5,966.10-6 mol/L
Transformando para μmol (÷10-6): C = 5,966 μmol/L
O volume final em que a absorbância foi lida foi de 2 mL, refere-se a 1 mL do
experimento e 1 mL de NaOH. Portanto, para calcular o número de mols de pNF-,
temos:
n = C.V
n = 5,966 μmol/L. 2.10-3 L
n = 0,0119 μmol
Para a determinação da velocidade da reação, em que a velocidade é igual a
quantidade de produto formado dividido pelo tempo de reação (30 min.).
v = n/t
v = 0,0119 μmol / 30min
v = 3,967.10-4 μmol/min
Assim, a atividade enzimática em U/mg é calculada, onde a atividade da enzima é
a razão da velocidade no tubo e massa da enzima que foi adicionada em miligramas.
Atividade = v / m
Atividade = (3,967.10-4 μmol/min) / 1.10-6 mg
Atividade = 39,67 U/mg
André
Realce
10
⇒ n = Cμmol x 2,0 mL x𝐶 = 
𝐴
17600 𝑀−1𝑐𝑚−1 𝑥 1 𝑐𝑚
1 𝐿
1000 𝑚𝐿
v = ⇒ ( ) =𝑛30
𝑈
𝑚𝑔
𝑣
10.10−6 𝑚𝑔
A partir do exemplo apresentado acima, calculou-se a atividade da enzima em
U/mg para cada um dos tubos, apresentados os dados abaixo:
Tabela 2. Atividade enzimática nos tubos sem adição de inibidor.
Tubo [pNFF](mmol/L) A410 C (μmol/L)
n (μmol)
em 2 mL
v
(μmol/min) (U/mg)
1 0,05 0,105 5,97 0,0119 3,98.10-4 39,7
2 0,07 0,132 7,50 0,0150 5,00.10-4 50,0
3 0,1 0,171 9,72 0,0194 6,48.10-4 64,8
4 0,15 0,233 13,2 0,0265 8,83.10-4 88,3
5 0,2 0,280 15,9 0,0318 1,06.10-3 106
6 0,4 0,387 22,0 0,0440 1,47.10-3 147
7 0,5 0,445 25,3 0,0506 1,69.10-3 169
8 1,0 0,515 29,7 0,0585 1,95.10-3 195
9 2,0 0,571 32,4 0,0649 2,16.10-3 216
10 5,0 0,615 34,9 0,0699 2,33.10-3 233
Tabela 3. Atividade enzimática nos tubos com adição de inibidor (0,5 mM).
Tubo [pNFF](mmol/L) A410 C (μmol/L)
n (μmol)
em 2 mL
v
(μmol/min) (U/mg)
1 0,05 0,051 2,90 0,00579 1,93.10-4 19,3
2 0,07 0,056 3,18 0,00636 2,12.10-4 21,2
3 0,1 0,064 3,64 0,00727 2,42.10-4 24,2
André
Nota
2,0/2,0
4 0,15 0,081 4,60 0,00920 3,07.10-4 30,7
5 0,2 0,111 6,31 0,0126 4,20.10-4 42,0
6 0,4 0,211 12,0 0,0240 7,99.10-4 79,9
7 0,5 0,256 14,5 0,0291 9,70.10-4 97
8 1,0 0,308 17,5 0,0350 1,17.10-3 117
9 2,0 0,427 24,3 0,0485 1,62.10-3 162
10 5,0 0,583 30,6 0,0611 2,04.10-3 204
Tabela 4. Atividade enzimática nos tubos com adição de inibidor (1,5 mM).
Tubo [pNFF](mmol/L) A410 C (μmol/L)
n (μmol)
em 2 mL
v
(μmol/min) (U/mg)
1 0,05 0,021 1,19 0,00239 7,95.10-5 7,95
2 0,07 0,028 1,59 0,00318 1,06.10-4 10,6
3 0,1 0,039 2,22 0,00443 1,48.10-4 14,8
4 0,15 0,058 3,30 0,00659 2,20.10-4 22,0
5 0,2 0,068 3,86 0,00773 2,58.10-4 25,8
6 0,4 0,109 6,19 0,0124 4,13.10-4 41,3
7 0,5 0,164 9,32 0,0186 6,21.10-4 62,1
8 1,0 0,180 10,2 0,0204 6,82.10-4 68,2
9 2,0 0,301 17,1 0,0342 1,14.10-3 114
10 5,0 0,357 20,3 0,0406 1,35.10-3 135
Tabela 5. –Atividade enzimática nos tubos com adição de inibidor (3,0 mM).
Tubo [pNFF](mmol/L) A410 C (μmol/L)
n (μmol)
em 2 mL
v
(μmol/min) (U/mg)
1 0,05 0,009 0,51 0,00102 3,41.10-5 3,41
2 0,07 0,015 0,85 0,00171 5,68.10-5 5,68
3 0,1 0,021 1,2 0,00239 7,95.10-5 7,95
4 0,15 0,024 1,4 0,00273 9,09.10-5 9,09
5 0,2 0,036 2,04 0,00409 1,36.10-4 13,64
6 0,4 0,060 3,4 0,00682 2,27.10-4 22,73
7 0,5 0,073 4,1 0,00829 2,76.10-4 27,65
8 1,0 0,139 7,9 0,0158 5,26.10-4 52,65
9 2,0 0,192 10,9 0,0218 7,27.10-4 72,73
10 5,0 0,378 21,5 0,0429 1,43.10-3 143,18
Assim, pode-se construir o gráfico com os duplos inversos pelo tipo de inibição,
para essa construção foi feito o cálculo do inverso dos valores das velocidades e da
concentração de [pNFF].
Gráfico 1. Gráfico de duplos inversos.
Legenda: série 1 - sem inibidor, série 2 - inibidor a 0,5 mM, série 3 - inibidor a 1,5 mM e série 4 inibidor a
3,0 mM.
A partir do gráfico 1 concluímos que a inibição que ocorre é competitiva, devido
ao aumento da concentração do inibidor que resulta em linhas com um intercepto no
eixo 1/Vmáx, com inclinações diferentes, vmáx, constante, e com o valor de KM aumentando
conforme se aumenta a concentração de inibidor.
Segundo a literatura, era para ser possível notar que o fosfato (inibidor) e o pNFF
competem pelo mesmo sítio ativo da fosfatase ácida, sendo então uma questão de
inibição competitiva, em que se aumentasse a concentração do inibidor, seria
transformada uma menor quantidade de substrato em produto. Utilizando e relacionando
André
Nota
2,0/2,0
a equação de Michaelis-Menten, com a representação de Lineweaver-Burk, temos a
seguinte equação:
Podemos relacionar essa equação com as equações da reta, sendo que o termo
Kmapp/Vmáx é o coeficiente angular, e o 1/Vmáx é o coeficiente linear. Desse modo com
essa relação pode-se calcular:
Equação da reta obtida para a cada uma das bateria de tubos.
Sem inibidor:
y = 107975x + 409,77
 1𝑉
𝑚á𝑥
= 409, 77 ⇒ 𝑣
𝑚á𝑥
= 0, 00244 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 
 
𝐾
𝑀
𝑉
𝑚á𝑥
 = 107975 µ𝑚𝑜𝑙.𝑚𝑖𝑛𝐿.µ𝑚𝑜𝑙 𝑥 
0,001 𝑚
µ 𝑥 0, 00244 
µ𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛 ⇒ 𝐾𝑀 = 0, 264 𝑚
Com inibidor 0,5 mM:
y = 260245x + 773,87
 1𝑉
𝑚á𝑥
= 773, 87 ⇒ 𝑣
𝑚á𝑥
 = 0, 00129 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 
 
𝐾
𝑀
𝑉
𝑚á𝑥
= 260245 µ𝑚𝑜𝑙.𝑚𝑖𝑛𝐿.µ𝑚𝑜𝑙 𝑥 
0,001 𝑚
µ 𝑥 0, 00129 
µ𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛 ⇒ 𝐾𝑀 = 0, 336 𝑚
Com inibidor 1,5 mM:
y = 600702x + 697,15
 1𝑉
𝑚á𝑥
= 697, 15 ⇒ 𝑣
𝑚á𝑥
 = 0, 00144 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 
 
𝐾
𝑀
𝑉
𝑚á𝑥
= 600702 µ𝑚𝑜𝑙.𝑚𝑖𝑛𝐿.µ𝑚𝑜𝑙 𝑥 
0,001 𝑚
µ 𝑥 0, 00144 
µ𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛 ⇒ 𝐾𝑀 = 0, 865 𝑚
Com inibidor 3,0 mM:
y = 1345016,14x + 626,9
 1𝑉
𝑚á𝑥
= 626, 9 ⇒ 𝑣
𝑚á𝑥
 = 0, 00160 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1 
 
𝐾
𝑀
𝑉
𝑚á𝑥
= 1345016, 14 µ𝑚𝑜𝑙.𝑚𝑖𝑛𝐿.µ𝑚𝑜𝑙 𝑥
0,001 𝑚
µ 𝑥0, 00160
µ𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛 ⇒ 𝐾𝑀 = 2, 152 𝑚𝑚𝑜
Os valores de KM aparente KMapp encontrados para cada bateria de tubos foram
reunidos na tabela 6. Em seguida, preparou-se uma curva dos valores de KMapp em
função da concentração de inibidor, que está registrada no gráfico 2.
Tabela 6. Valores de vmáx e KMapp encontrados em cada método.
Concentração do inibidor KMapp (mmol/L)
Sem inibidor 0, 264
0,5mM 0, 336
1,5 mm 0, 865
3,0 mM 2,152
Dos dados apresentados acima foi plotado o gráfico abaixo:
Gráfico 2. Kmapp x [fosfato].
Com os dados do gráfico acima de Kmapp x concentração de fosfato, obtemos a
seguinte equação de reta dos pontos que é y = 0,6477x + 0,0947
Sabendo que o valor da constante de dissociação do complexo enzima-inibidor
(Ki) pode ser determinado por:
Ki = 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎𝑟𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑔𝑢𝑙𝑎𝑟
Ki = = 0,1460,09470,6477
Ki = 0,146 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝐿
André
Nota
2,0/2,0
3. CONCLUSÃO
A prática realizada permitiu observar o efeito do inibidor fosfato de sódio nas
reações enzimáticas realizadas, diante da interferência observada podemos validar a
ideia de que a inibição sofrida pela enzima fosfatase ácida tem o caráter competitivo,
isto é, o inibidor possui uma estrutura semelhante ao do substrato, e consequentemente
consegue substituir o substrato no sítio catalítico da enzima, formando um complexo
enzima-inibidor, interferindo na atividade enzimática. Conclui-se que conforme se
aumenta a concentração do inibidor, ocorre aumento no valor de KM, porém o vmáx
permanece constante, indicando que a inibição é do tipo competitiva.
4. BIBLIOGRAFIA
LEHNINGER, T. M., NELSON, D. L. & COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 6ª Edição, 2014. Ed.
Artmed.
SKOOG; WEST; HOLLER; CROUCH. Fundamentos de Química Analítica. Trad. 8ª Edição
Norte-Americana. Editora Thomson.
VOET, D. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2013. 4 a ed.
André
Nota
0,5/0,5