MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS (1)

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MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS
Os lipídeos são constituídos por um amplo e diversificado conjunto de substâncias orgânicas, delimitadas com base em suas características de solubilidade. Os lipídeos são geralmente insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos, como éter, benzeno e clorofórmio (PHILIPPI, 2014). Além disso, eles são importantes fonte de energia e veículos de nutrien-tes, como vitaminas lipossolúveis e ácidos graxos essenciais (PINHEIRO; PORTO; MENEZES, 2005). Armazenam energia na forma de triglicerídeos e em alguns alimentos como peixes (sardinha e salmão) e fornecem ácidos graxos essenciais, especialmente o ômega 3. Falando em gastronomia, eles fornecem sabor aos alimentos e podem ser encontrados em carnes, leite, óleo de coco, óleo de palma, manteiga de cacau, amendoim, gema de ovo, nozes, castanhas, entre outros (GALISA; ESPERANÇA; SÁ, 2008). Neste capítulo, você vai estudar o papel dos lipídeos no processa-mento de alimentos, compreendendo a importância das suas proprieda-des funcionais, bem como o seu papel na produção alimentícia. Os lipídeos que compõem os alimentos são do grupo dos óleos e das gordu-ras. São constituídos por substâncias orgânicas, determinadas com base na sua solubilidade (PHILIPPI, 2014). São considerados compostos de origem biológica solúveis em solventes orgânicos, como éter, benzeno e clorofórmio e insolúveis em água (GONÇALVES, 2010). São substâncias de origem animal ou vegetal, compostos de produtos de condensação entre glicerol e ácidos graxos, conhecidos como triacilgliceróis. São importantes fontes de energia e veículos de nutrientes, como as vitaminas lipossolúveis e ácidos graxos essenciais (PINHEIRO; PORTO; MENEZES, 2005). O conteúdo total e a composição de lipídeos em alimentos podem variar muito. Os lipídeos têm tido uma ênfase especial na pesquisa e no desenvolvimento de alimentos, uma vez que desempenham um papel importante na qualidade de alimentos. Eles contribuem com atributos como textura, sabor, nutrição e densidade calórica. O estudo dos lipídeos na produção de alimentos está focado na alteração de sua composição, afim de modificar a textura, alterar a composição de ácidos graxos e colesterol, diminuir o conteúdo total de gordura, alterar a biodispo-nibilidade e tornar os lipídeos mais estáveis diante da oxidação. Além disso, a estabilidade física deles é importante para a qualidade do alimento, já que muitos lipídeos existem como dispersões/emulsões, sendo termodinamicamente instáveis (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Para que se efetuem mudanças na composição dos lipídeos, com garantia de produção de alimentos de alta qualidade, o conhecimento básico das suas propriedades químicas e físicas é indispensável. Os óleos são provenientes de alimentos de origem vegetal. São extraídos de sementes de várias plantas e depois refinados para uso dietético, agindo como condutores de calor e agregadores de maciez e sabor. A partir dos óleos, têm-se as margarinas e também a gordura vegetal hidrogenada, utilizada na indústria alimentícia. Já as gorduras são provenientes de alimentos de origem animal, podendo ser consumidas como parte integrante do alimento (carnes, leite ou ovos) ou isoladamente. A banha, o toucinho, a manteiga e o creme de leite são exemplos de alimentos obtidos por meio da separação da gordura dos alimentos (PHILIPPI, 2014).
 A extração de lipídios
A extração de lipídios é uma determinação importante em estudos bioquímicos, fisiológicos e nutricionais dos mais diversos tipos de alimentos e, portanto, deve ser realizada com acurácia. Algumas amostras requerem cuidados especiais para a obtenção da fração lipídica, pois fatores como coextração dos compo-nentes não lipídicos e a oxidação indesejada podem influenciar a qualidade final da fração lipídica (BRUM; ARRUDA; REGITANO-D ́ARCE, 2009). A escolha do melhor método de análise é um passo muito importante, pois, em razão da complexidade de sua constituição orgânica, os alimentos muitas vezes são considerados matrizes difíceis de serem manipuladas, em que os vários componentes dessa matriz podem estar interferindo entre si (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 2008). O conteúdo lipídico é tradicional-mente determinado por métodos gravimétricos por meio da extração com solventes. Existem vários métodos para extração de lipídios e, dentre eles, Soxhlet, hidrólise ácida e Bligh-Dyer são os métodos de extração dominantes para a avaliação do teor de lipídios em alimentos e ingredientes alimentícios (HYVÖNEN, 1996; XIAO; MJOS; HAUGSGJERD, 2012).
Soxhlet
O extrator Soxhlet é um instrumento de laboratório, inventado em 1879 por Franz von Soxhlet. Este foi concebido inicialmente para a extração de lipídios de materiais no estado sólido. A extração com esse instrumento é realizada quando o composto desejado tem uma solubilidade limitada num determinado solvente e as impurezas são insolúveis nesse mesmo solvente. Permite uma operação sem necessidade de monitorização constante, na medida em que funciona por forma a usar uma pequena quantidade de solvente, a qual é constantemente reciclada, para dissolver uma grande quantidade de composto. Trata-se de um exemplo do processo contínuo de extração de lipídios a
partir de alimentos. Os óleos/gorduras são extraídos por repetidas lavagens com solvente orgânico, como hexano, éter de petróleo ou éter etílico sob refluxo. Essa técnica é bastante útil nos casos em que o composto puro é parcialmente solúvel em um solvente e as impurezas não. Neste método, a amostra é seca, moída em pequenas partículas e colocada em um cartucho poroso. Ela é colocado na câmara de extração que está suspensa acima do balão que contém o solvente e abaixo de um condensador. O balão é aquecido e evapora o solvente, que se move na fase gasosa em direção ao condensador, o qual é convertido em um líquido que goteja no cartucho que contém a amostra. A câmara de extração é projetada de modo que quando o solvente em torno da amostra for superior à altura máxima do sifão, o líquido transborda para o balão, onde é aquecido, e evapora, completando um ciclo. As mais notáveis vantagens que o método de Soxhlet apresenta são: a amostra está sempre em contato com o solvente, havendo sua constante re-novação; a temperatura do sistema mantém-se relativamente alta, visto que o calor aplicado para o processo de evaporação é constante; é uma metodologia muito simples que não requer treinamento especializado e que possibilita a extração de uma quantidade maior de óleo em relação a outros métodos, sem a necessidade de filtração da miscela após o término da extração, pois a amostra esteve envolta no cartucho durante todo o procedimento (CASTRO; GARCÍA-AYUSO, 1998). Os principais inconvenientes que o método de Soxhlet apresenta são o longo
tempo requerido para a extração e o grande volume de solvente utilizado, o qual não é somente de alto custo, mas também pode ser nocivo à saúde e ao meio ambiente (CASTRO; GARCÍA-AYUSO, 1998)
 
Hidrolise ácida
Outros tipos de determinação de lipídios em alimentos podem ser realizados por meio de hidrólises ácidas ou alcalinas. Um exemplo desse tipo de análise é a metodologia do butirômetro de Gerber, utilizada para determinação de lipídios em leite e seus derivados. O método de Gerber está baseado na pro-priedade que tem o ácido sulfúrico de digerir as proteínas do leite, sem atacar a matéria gorda. A separação da gordura ocorre por centrifugação (diferença de densidade) e o volume de gordura é obtido diretamente, pois o componente mais leve (a gordura) se acumula na parte superior do butirômetro, isto é, na haste graduada dele (BRASIL, 2006). A gordura está presente no leite sob a forma de glóbulos pequenos suspensos em água (emulsão óleo/água). Cada glóbulo é revestido por uma camada de fosfolipídios que previne os glóbulos de se agregarem, por repulsão dos outros glóbulos de gordura e atração de água. O princípio do método de Gerber baseia--se na quebra da emulsão do leite com ácido sulfúrico concentrado (densidade 1,820 a 1,830) e na utilização de uma substânciadesemulsificante, o álcool amílico. A reação ocorre em uma vidraria própria, chamada butirômetro, que é basicamente um bulbo com uma haste comprida e graduada para os teores percentuais de gordura. O ácido sulfúrico dissolve ou decompõe as proteínas e a lactose do leite, aumentando a densidade da fase aquosa. A gordura é então liberada e sua separação acontece pela ação do álcool amílico e pela centrifugação na centrífuga de Gerber. Uma vez que a gordura é totalmente separada, o resultado é obtido por leitura direta na haste graduada do butirô-metro, registrado volumetricamente e indicado como percentagem de massa (BRASIL, 2014). Também existem modificações do método de Gerber que permite a análise de produtos que não sejam de origem lácteas, uma delas é a modificação que permite quantificar a gordura presente em tecidos musculares e produtos de tecidos. A diferença do método convencional está na densidade dos reagentes e no preparo da amostra, sendo que esta deve ficar em banho 60 a 65 °C em ácido para separar a proteína do lipídio. Após a digestão, a amostra é centrifugada em um butirômetro calibrado com escala volumétrica. A gordura separada é medida diretamente no butirômetro. Esse método é preciso, pois a leitura é feita diretamente no butirômetro e a manipulação realizada na amostra é mínima. 
Extrato alcoólico
De acordo com Cecchi (2003), Bligh e Dyer, em 1959, sugeriram um método para extrair gordura a frio que utiliza uma mistura de três solventes: cloro-fórmio, metanol e água. Por meio da mistura dos três solventes em diferentes proporções, são formadas duas fases distintas, uma de clorofórmio, em que há os lipídios, e outra de metanol e água, contendo os compostos não lipídicos. A fase de clorofórmio é então separada num balão para a gordura ser quantificada. Esse método apresenta diversas vantagens:
· Extrai todas as classes de lipídios. 
· Pode ser usado em amostras úmidas ou secas. 
· Preserva os lipídios, pois não usa calor. 
· Simplicidade do material.
Por outro lado, o método apresenta uma grande probabilidade de erros,
em razão da grande quantidade de manipulação na amostra. O método Bligh-Dyer pode ser usado para alimentos secos ou para produtos com altos teores de água (como peixes e vegetais verdes), ou ainda em escala micro, isto é, a análise é feita em tubos de ensaio com a vantagem de propor-cionar maior precisão na análise e reduzir gastos pelo gasto menor de solvente. Tanto no método de Soxhlet quanto no Bligh-Dyer a gordura é quantificada por meio de métodos gravimétricos, em que se realiza a evaporação do solvente com o lipídio num balão, finaliza a remoção do solvente por aquecimento em estufa e, pela diferença do peso do balão vazio e do balão com a gordura, obtêm-se a quantidade de gordura extraída.
A extração de óleo com solvente é um processo de transferência de constituintes solúveis (o óleo) de um material inerte (a matriz graxa) para um solvente com o qual a matriz se acha em contato. Os processos que ocorrem são meramente físicos, pois o óleo transferido para o solvente é recuperado sem nenhuma reação química.1 A extração de lipídios é uma determinação importante em estudos bioquímicos, fisiológicos e nutricionais dos mais diversos tipos de alimentos e, portanto, deve ser realizada com acurácia. Algumas amostras requerem cuidados especiais para a obtenção da fração lipídica, pois fatores como co-extração dos componentes não-lipídicos e a oxidação indesejada podem influenciar a qualidade final da fração lipídica. Os procedimentos clássicos idealizados por Soxhlet em 1879, com refluxo de solvente por muitas horas, devem ser evitados, já que favorecem as reações de peroxidação e de hidrólise,2 podendo comprometer resultados analíticos posteriores, como a quantificação de certos componentes lipídicos. Um dos procedimentos de extração mais versáteis e efetivos, que supera as dificuldades mencionadas acima, é a metodologia de Bligh & Dyer,3 uma versão simplificada do procedimento clássico usando clorofórmio-metanol proposto por Folch et al..4 Outra vantagem apresentada pelos métodos baseados na mistura binária clorofórmio e metanol é a capacidade de extraírem tanto os lipídios neutros e os lipídios polares eficientemente. Diversos estudos mostraram que, dependendo do tipo de tecido que será analisado, a escolha do método de extração influencia significantemente no resultado final.2,5-7 A insolubilidade dos lipídios em água torna possível sua separação das proteínas, carboidratos e da água nos tecidos. Como os lipídios têm uma grande faixa de relativa hidrofobicidade, é praticamente inviável a utilização de um único solvente universal para a extração dos lipídios.5 Lipídios neutros estão ligados covalentemente e podem ser extraídos dos tecidos por solventes apolares, enquanto lipídios polares, os quais estão ligados por forças eletrostáticas e pontes de hidrogênio, requerem solventes polares capazes de quebrar tais ligações e liberá-los.
O primeiro aparelho para extração dos lipídios em matrizes graxas foi desenvolvido por Franz von Soxhlet em 1879,8 que ressaltou a importância do grau de trituração da amostra quanto à duração e eficácia do processo. No processo de liberação extrativa, levam-se em conta três etapas principais: a penetração do solvente no tecido; a formação de uma miscela intracelular e, a difusão do extrato na miscela externa.9 Consiste no tratamento sucessivo e intermitente da amostra imersa em um solvente puro (éter de petróleo, éter dietílico ou n-hexano), graças à sifonagem e subseqüente condensação do solvente aquecido dentro do balão que está na base do aparelho.8 As mais notáveis vantagens que o método de Soxhlet apresenta são a amostra está sempre em contato com o solvente, havendo sua constante renovação; a temperatura do sistema mantém-se relativamente alta, visto que o calor aplicado para o processo de evaporação é constante; é uma metodologia muito simples que não requer treinamento especializado e que possibilita a extração de uma quantidade maior de óleo em relação a outros métodos, sem a necessidade de filtração da miscela após o término da extração, pois a amostra esteve envolta no cartucho durante todo o procedimento.10 O uso de um único solvente não é recomendável para a extração dos lipídios de tecidos animais. A mistura de solventes ideal para extração da matéria graxa de tecidos deve ser suficientemente polar para removê-la das associações com as membranas celulares ou com lipoproteínas, sem que ocorra reação química.6 Pesquisadores, como Folch et al.,4 reconheceram estas características intrínsecas da extração de lipídios e desenvolveram um método usando uma mistura de clorofórmio e metanol, seguida pela adição de solução de cloreto de potássio, visando uma melhor separação das fases. Bligh e Dyer3 modificaram o método de Folch et al.4 e propuseram um "método rápido para extração e purificação dos lipídios totais". Apesar de algumas desvantagens, como a toxidez dos solventes usados e a indesejável extração dos contaminantes não-lipídicos da fase orgânica, os métodos de Folch et al.4 e Bligh e Dyer3 são largamente utilizados, tanto como propostos originalmente, quanto modificados.6,11-18 Uma das vantagens do método desenvolvido por Bligh e Dyer3 é a formação de um sistema bifásico a partir das proporções de solventes adicionados durante o processo de extração. A formação desse sistema bifásico está baseada na teoria do equilíbrio líquido-líquido de três componentes (clorofórmio/metanol/água). A determinação das solubilidades de cada componente pode ser avaliada através de um diagrama ternário de solubilidade de dois líquidos parcialmente miscíveis entre si (clorofórmio e água) com um terceiro (metanol), completamente miscível nos outros dois. Nos últimos anos diversos pesquisadores realizaram trabalhos16,17,19-23 em que o objetivo foi encontrar o método mais eficiente para a obtenção da fração lipídica desejada e determinar sua composição. Além disso, também buscaram métodos que não alterassem a qualidade do óleo e utilizassemsolventes menos tóxicos que a mistura clorofórmio e metanol.3,4,12 No entanto, devido à alta eficiência que este sistema apresenta na extração de lipídios polares e apolares, nenhuma mistura alternativa testada recentemente tem obtido o êxito esperado, ou seja, uma eficiência equivalente ao sistema que utiliza um solvente clorado. Em um trabalho realizado,18 verificou-se que o método de Soxhlet, usando diferentes solventes como éter de petróleo, metanol, n-hexano, diclorometano:hexano (1:4) e acetona:hexano (1:4), separadamente em cada extração, foi conveniente para extração da fração lipídica de amostras sólidas que continham alto teor de lipídios, tais como chocolate em pó, margarina, leite em pó e ração para frango. Os métodos de Bligh e Dyer,3 usando clorofórmio-metanol-água, e Bligh e Dyer, modificado,15 utilizando isopropanol-ciclo-hexano-água, foram mais adequados para extração de amostras líquidas, tais como leite, ovos e plasma humano. As amostras extraídas com metanol, tanto por Soxhlet como por Bligh e Dyer,3 apresentaram um alto rendimento em óleo, já que o metanol possui um poder de solvatação superior ao dos outros solventes usados, extraindo os lipídios e os não-lipídios da matriz em estudo. Gandhi et al.24 buscaram solventes alternativos para extração de óleo de soja, haja vista que o n-hexano é o solvente universal usado para extração dessa oleaginosa. Foram utilizados os solventes puros n-hexano, n-heptano, n-propanol, isopropanol e etanol, além da aplicação de sistemas de solventes aquosos (90:10 n-propanol) e azeótropos como, por exemplo, n-hexano + isopropanol (78+22), em períodos de extração crescentes até 10 h. Os pesquisadores concluíram que n-heptano, n-propanol, isopropanol e etanol foram igualmente efetivos na extração, quando comparados com o n-hexano. As misturas de solventes aquosos também foram eficientes com a vantagem de requerer um menor volume de solvente, porém com o inconveniente de demandar maior energia para remoção da água do solvente.
Extraction methods and quality of the lipid fraction of vegetable and animal samples
Aelson Aloir Santana BrumLia Ferraz de ArrudaMarisa Aparecida Bismara Regitano-d´Arce https://doi.org/10.1590/S0100-40422009000400005
Nichelle, Pryscila Gharib. Bromatologia [recurso eletrônico] / Pryscila Gharib
Nichelle, Fernanda Robert de Mello ; [revisão técnica: Ana Amélia Machado Duarte, Sandra Maria Pazzini Muttoni]. – Porto Alegre: SAGAH, 2018.
ISBN 978-85-9502-780-0