REPLICAÇÃO DO DNA

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REPLICAÇÃO DO DNA, REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR), MUTAÇÕES PONTUAIS NO DNA E MECANISMO DE REPARO!
REPLICAÇÃO DO DNA
● A replicação do DNA ocorre num momento preciso do ciclo celular denominado fase S, que sucede outra fase denominada G1. Ainda não são claros os processos que atuam na transição da fase G1 e S. A consequência da replicação do DNA é a divisão celular, quando são geradas novas células-filhas com o mesmo conteúdo genômico da célula precursora. 
PONTOS IMPORTANTES
● A replicação ocorre bidirecionalmente, não unidirecionalmente. Cada estrutura em forma de Y é uma forquilha de replicação (local com muitas ligações A=T por conta de as ligações serem mais fáceis de serem quebradas) e as duas forquilhas de replicação se movem em direções opostas ao longo do cromossomo circular. A replicação é dita como semiconservativa, o que significa que cada célula filha possui metade do DNA genético da célula mãe. 
DNA POLIMERASE E SÍNTESE IN VITRO DO DNA
● DNA iniciador: A DNA polimerase não pode iniciar a síntese da cadeia de DNA de novo. Tem uma necessidade absoluta de um 3’-hidroxil livre em uma cadeia preexistente. A DNA polimerase catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre a extremidade 3’-OH do último nucleotídeo da cadeia do DNA e o 5’-fosfato do deoxinucleotídeotrifosfatado subsequente. A direção da síntese é sempre 5’→3’. A energia para essa reação é proveniente da quebra do trifosfato.
● DNA molde: A DNA polimerase não possui especificidade de sequência, isto é, a enzima requer uma cadeia de DNA molde cuja sequência, por meio das regras do pareamento de bases, dirige a síntese de uma sequência complementar de bases na cadeia sintetizada.
O “PARADOXO DO PONTO DE CRESCIMENTO” E A SÍNTESE DESCONTÍNUA DE DNA
● Os estudos de moléculas de DNA replicantes por meio das autorradiografias e da microscopia eletrônica indicam que as duas cadeias-filhas sintetizadas em cada forquilha de replicação se estendem na mesma direção, ao menos no nível macromolecular. Visto que as cadeias complementares da dupla hélice têm polaridades opostas, isto significa que a síntese está ocorrendo no sentido da terminação 5’ (ou 3’→5’) e da terminação 3’ (ou 5’→3’). No entanto, todas as DNA polimerases conhecidas têm necessidade absoluta de um 3’-hidroxil livre, o que possibilita apenas a síntese 5’→3’. 
● Esse paradoxo existiu por vários anos, enquanto os bioquímicos procuravam por polimerases capazes de realizar a síntese no sentido 3’→5’. Nenhuma polimerase com essa capacidade foi até o momento encontrada. Ao contrário, fortes evidências foram se acumulando indicando que toda síntese ocorre na direção 5’→3’. A resolução desse paradoxo foi pela demonstração que a síntese de uma das cadeias é descontínua.
● No nível molecular, a síntese ocorre em direções opostas. Ambas as cadeias são sintetizadas na direção 5’→3’. As cadeias que evoluem na direção 3’→5’ crescem pela síntese de pequenos segmentos (sintetizados 5’→3’) e pela subsequente reunião desses pequenos segmentos pela enzima DNA ligase.
INICIAÇÃO E PROBLEMA DO “PRIMER”
A COMPLEXIDADE DO SISTEMA DE REPLICAÇÃO COMPLETO
● Inicialmente, as cadeias da dupla hélice parental precisam se separar de forma que cada uma sirva de molde para a síntese de uma nova cadeia. A separação das cadeias e o movimento da forquilha de replicação ocorrem progressivamente com as cadeias sendo temporariamente separadas adiante da forquilha de replicação, enquanto está se move ao longo do cromossomo. Três proteínas diferentes estão envolvidas na separação das cadeias da dupla hélice: 
1. proteínas separadoras de DNA ou helicases − diretamente envolvidas na catálise da separação das duplas hélices; 
2. proteínas ligantes de cadeias simples de DNA (SSBP − Single StrandBindingProteins) − se ligam fortemente às regiões de DNA de fita simples produzidas pela ação das helicases e ajudam a estabilização necessária para a polimerização.
3. Topoisomerases, que catalisam a formação de enrolamentos negativos no DNA, são essenciais para a replicação e supõe-se que desempenham um papel fundamental no processo de desenrolamento, mas seu funcionamento não é conhecido.
REPLICAÇÃO: RESUMO
● Como as fitas polinucleotídicas são unidas apenas por pontes de hidrogênio, elas são facilmente separáveis. No momento da replicação, essas ligações se rompem e a dupla-hélice abre-se, com o auxílio de enzimas denominadas DNA-helicases, liberando seus terminais para ligarem-se a novos nucleotídeos específicos. Cada fita dirige e serve de molde para a síntese de uma nova fita, por complementaridade do pareamento de bases, a partir de nucleotídeos presentes no núcleo da célula. O princípio do pareamento complementar de bases estabelece que uma base não pareada atraia um nucleotídeo livre somente se ele lhe for complementar. Os nucleotídeos são unidos por ação da enzima DNA-polimerase, sendo ligados à fita molde por novas pontes de hidrogênio, com o auxílio de outra enzima, a DNA-ligase. A DNA-polimerase também faz um procedimento de revisão de leitura, no qual um nucleotídeo recém-adicionado é conferido para que haja certeza de sua complementaridade à base da fita-molde. Caso negativo, esse nucleotídeo é removido e substituído pelo nucleotídeo complementar correto. Tal procedimento reforça a precisão da replicação do DNA. No caso de não haver esse reparo, caracteriza- se uma mutação.
● A duplicação do DNA é passível de se iniciar, ao mesmo tempo, em vários pontos da fita, podendo ser uni ou bidirecional. O ponto no qual ela se origina é denominado forquilha de replicação, origem de replicação ou ponto de crescimento. O primeiro passo na replicação do DNA ocorre quando uma helicase rompe as pontes de hidrogênio, mantendo junto um par de bases,em um sítio de iniciação. Outra enzima, conhecida como primase, atrai nucleotídeos de RNA complementares para formar uma pequena sequência de RNA denominada iniciador de RNA, desencadeador ou primer, no início de cada segmento de DNA a ser duplicado. Esse iniciador de RNA é necessário, pois o DNA não pode iniciar uma nova fita de ácido nucleico por si próprio. O iniciador de RNA atrai a DNA-polimerase, que então reúne os nucleotídeos complementares às bases da fita-molde de DNA. A nova fita de DNA começa a crescer, à medida que se formam as ligações de hidrogênio entre as bases complementares. O iniciador de RNA é removido enzimaticamente, sendo substituído pelas bases corretas do DNA. As ligações necessárias entre os nucleotídeos da nova fita de DNA são realizadas cataliticamente pelas ligases.
● Na forquilha de replicação, cada uma das fitas de DNA serve como molde para a síntese do novo DNA. Antes, nessa região, a dupla-hélice é desenrolada por um sistema enzimático. Como as fitas parentais não são paralelas, a replicação do DNA só pode prosseguir continuamente em uma das fitas, na direção 5'-3', denominada fita de replicação contínua. Ao longo da fita 3'- 5', chamada fita de replicação descontínua, o novo DNA se forma por meio de pequenos segmentos de mil a 2 mil bases em procariotos e de 200 bases em eucariotos, chamados fragmentos de Okazaki (esses fragmentos depois são ligados pela DNA-ligase), em homenagem ao seu descobridor. Na fita de replicação descontínua, é necessário um pequeno segmento de RNA como iniciador. Esse iniciador é produzido por uma RNA-polimerase, denominada primase. A seguir, uma exonuclease (sentido 5’ – 3’) remove o iniciador de RNA, o DNA é inserido nessa lacuna pela DNA-polimerase I e, finalmente, os segmentos de DNA são unidos pela DNA-ligase. A enzima responsável pela síntese de DNA (DNA-polimerase III) é complexa, compreendendo diversas subunidades.
● Na replicação unidirecional, a forquilha de replicação parte da origem e prossegue ao longo do DNA. Na bidirecional, formam-se duas forquilhas de replicação e elas partem da origem, uma em direção à outra, até se encontrarem.
ANOTAÇÕES:
✛ Replicação do DNA acontece na fase S e é semiconservativa (isso permite estudar a antecedência do material genético, visto que há conservação deuma parte da linhagem da célula mãe). 
✛ A bolha de replicação é basicamente o local de início da replicação por ser mais fácil “desmontar”, já que são áreas ricas em Timina e Adenina, que possuem ligações duplas mais fáceis de quebrar. 
✛ A abertura da dupla fita promove a quebra das pontes de Hidrogênio, função da DNA helicase. As topoisomerases atuam relaxando e desenrolando a molécula de DNA. 
✛ Proteínas ligadoras de fita simples – atuam na desbridização (renelamento = renaturação) entre as fitas, mantendo-as separadas para poder usar cada fita como molde. 
✛ DNA polimerase atua polimerizando moléculas de DNA a parte dos monômeros – nucleotídeos. 
✛ A ponte de H é formada sozinha entre as fitas, só basta aproximar as fitas. No entendo, a DNA polimerase é responsável pela formação das ligações “fosfodiester” entre nucleotídeos de uma mesma fita. 
✛ Polimerase I – remoção do primer / Polimerase II – mecanismo de reparo.
✛ A atividade da polimerase sempre será no sentido 5’ – 3’ e as fitas são antiparalelas, o que explica a polimerização bidirecional. 
✛ A desoxirribonucleico não possui -OH livre, mas sim -H. Entretanto, a ribonucleico possui 3` - OH livre. Para iniciar a polimerização é preciso do 3’ – OH, mas o DNA não tem. Então, a primase adiciona o “primer” (10 nucleotídeos) de RNA, que no último nucleotídeo tem um 3’ – OH livre para iniciar a replicação. Depois esse primer é removido, é utilizado só para iniciar a replicação. 
✛ A fita líder + fita alterada (fragmento de okazaki... vai precisar de vários primers) – a DNA ligase vai juntar os fragmentos. Lembrando que nesses fragmentos, a DNA-ligase vai juntar através de ligações fosfodiéster. 
✛ DNA polimerase III possui mecanismo de correção de erro (sentido 3’ – 5’ - exonuclease, vai e volta para corrigir erro na fita descontínua). 
MUTAÇÃO GÊNICA (mutações pontuais)
● As mutações gênicas podem ser de três tipos: porsubstituição de base (SNPs), por perda ou deleção de base (indels), eadição ou inserção de base (Indels).
● As mutações por substituição apresentam denominaçõesdiferentes, de acordo com o tipo de bases que envolvem.Quando a substituição abrange bases do mesmotipo, isto é, substituição de uma purina por outra purinaou de uma pirimidina poroutra de igual tipo, ela é denominadatransição. Exemplos: purina → purina – ACG(treonina) → GCG (alanina); pirimidina → pirimidina –ACA (treonina) → AUA (isoleucina).
● Quando a substituição envolve bases de tipos diferentes,isto é, troca de uma purina por uma pirimidina, ouvice-versa, a mutação chama-se transversão. Exemplos:purina → pirimidina – AAG (lisina) → ACG (treonina); pirimidina→ purina – UGC (cisteína) → UGG (triptofano).
● Quando a substituição de base ocasiona a troca deum aminoácido, é denominada mutação com sentidotrocado ou incorreto (missense, em inglês) e seuefeito sobre a proteína depende da natureza da substituiçãodo aminoácido. A substituição do aminoácido nacadeia polipeptídica pode levar a uma proteína alterada, com redução ou perda da sua atividade biológica, ou pode acarretar também uma proteína semelhante à normal, sem qualquer efeito funcional. Se a substituição fizer surgir um dos três códons terminais (UAA, UAG e UGA), finalizando prematuramente a síntese proteica, ela se chama mutação sem sentido (nonsense, em inglês). Na maioria dos casos, a cadeia polipeptídica é encurtada e provavelmente não conserva sua atividade biológica normal.
· Conforme seu efeito, as substituições também se classificam em:
a. Diretas – Substituições de base que resultam na troca do aminoácido original para um novo aminoácido. Exemplo: UUU (fenilalanina) →UUA (leucina).
b. Reversas – Responsáveis pelo processo inverso, quando ocorrem no mesmo ponto. Exemplo: UUA (leucina) →UUU (fenilalanina).
c. Silenciosas (mutação sinônima) – Quando a mudança implica um códon sinônimo, que não altera o aminoácido. Exemplo: UUU (fenilalanina) →UUC (fenilalanina). Isso decorre de um motivo: o código genético é degenerado, mais de um códon para produzir um mesmo aminoácido. 
d. Neutras – Quando a substituição de base resulta em troca de aminoácido, mas isso não afeta a atividade da proteína.
● OBS 1: Depende do local onde a mutação ocorre: região codante ou não-codante (regiões sem função, regiões regulatórias e RNAs funcionais)
● OBS 2: Mutações sem sentido (nonsense): O códon para um aminoácido é trocado por um códon de término (STOP). Quanto mais próximo da região 3’, menor o impacto na função ou estrutura da proteína.
● OBS 3: Mutações não-sinônimas (missense): O códon para um aminoácido é trocado por um códon para outro aminoácido. EX., Substituição não-conservativa – anemia falciforme – Ac. Glutâmico por Valina
● OBS 4: Mutações de matriz de leitura (frameshift): A adição ou deleção de um único par de bases na sequência muda a matriz de leitura no processo de tradução em região codante. 
● OBS 5: Mutações tem maior probabilidade de ocorrência em regiões não-codantes. Porém, podem conter sequências promotoras e reguladoras, além daquelas que dão origem aos RNAs funcionais.
● Podem ocorrer, ainda, mutações no DNA não codificador, que podem ser inócuas fenotipicamente, a menos que ocorram em sequências do DNA relacionadas com a regulação dos genes estruturais ou na junção da emenda entre íntrons e éxons. As mutações nas sequências reguladoras podem afetar o nível da expressão gênica, enquanto as mutações na junção da emenda podem causar perda de sequências codificadoras (perda de éxons) ou retenção de sequências não traduzidas (manutenção de íntrons) na molécula de RNA mensageiro, ocasionando erro no encadeamento (splicing). As mutações das junções da emendaparecem ocorrer mais comumente em genes do colágeno, sendo a base mutacional para a osteogênese imperfeita.
As mutações ainda podem ser classificadas em mutações estáveis ou fixas, quando são transmitidas inalteradasàs gerações seguintes, e mutações instáveis ou dinâmicas, quando sofrem alterações ao serem transmitidasnas famílias.
Os genomas eucarióticos, como o humano, consistem principalmente em regiões não codificadoras, e provavelmente a maioria das mutações ocorre nessas regiões, que não contêm genes (introns). Essas mutações são consideradas mutações neutras, se não afetam os produtos ou a expressão gênica. Os Introns funcionam como um mecanismo de proteção já que correspondem 97 a 98% dos genes, então é mais fácil ter uma mutação nessa parte não funcionante.
ORIGEM DAS MUTAÇÕES
· MUTAÇÕES ESPONTÂNEAS
● Surgem de uma variedade de fontes, principalmente do processo de replicação do DNA. Além disso, o DNA pode ser danificado pelo próprio ambiente celular.
· MECANISMO DE REPARO 
● As DNA pol I e III são muito precisas e possuem atividade exonucleásica (revisão) 3’ à 5’ - principal mecanismo de reparo. Porém, alguns desses erros escapam da correção pela DNA pol, e devem ser corrigidos por outros mecanismos.
● Mecanismo subsequente: reparo por excisão (recorte, retirada) de bases nitrogenadas é feito pelas enzimas DNA glicosilases. No local do recorte, a polimerase vai colocar novos nucleotídeos e a ligase vai fechar o corte. 
● Além dos erros de replicação, o DNA pode sofrer danos decorrentes da DEPURINAÇÃO (perde uma base purina). Existe um mecanismo de reparo eficiente que remove os sítios apurínicos e os substitui.
● O DNA também pode sofrer mutações decorrentes da DESAMINAÇÃO (mudança de uma base normal para uma atípica; C → U). Se não reparado, a uracila fará um pareamento com a adenina na replicação (G.C à A.T).
● Os danos no DNA podem ser também oriundos do estresse oxidativo (respiração celular).
· MUTAÇÕES INDUZIDAS 
● Enquanto algumas mutações ocorrem espontaneamente, outras fontes indutoras de mutação estão presentes no ambiente (físicos, químicos e biológicos). 
· Agentes mutagênicos podem atuar por 3 mecanismos básicos:
1. Podem substituir uma base na sequência do DNA 1 (Análogos de base)
2. Podem alterar a composição química de uma base (pareamento errôneo)
3. Podem danificar uma base de modo que ela não faça mais pareamentos
REAÇÃOEM CADEIA POLIMERASE
● Um dos avanços mais revolucionários da biologia molecular é a técnica originalmente denominada de amplificação da sequência de DNA ou amplificação do DNA in vitro, conhecida atualmente como reação emcadeia da polimerase ou PCR. Essa técnica permite à amplificação de fragmentos curtos de DNA e pode ser usada para produzir grandes quantidades de um determinado fragmento de DNA de qualquer ser vivo, desde que a sequência de bases da região considerada seja conhecida ou possa ser inferida a partir da sequência de aminoácidos de uma proteína.
● A PCR tem dois requisitos essenciais: um moldede DNA de fita simples do qual uma nova fita deDNA deve ser copiada e um iniciador (primer)com um grupo 3’-OH, ao qual novos nucleotídeossão adicionados. A PCR é baseada no uso da enzimaDNA-polimerase para copiar um molde de DNA em ciclosrepetidos e replicar o fragmento desejado. Para queesse fragmento seja copiado, a polimerase é guiada porpequenos oligonucleotídeos iniciadores ou primers, quesão hibridizados com o DNA-molde no início e no finalda sequência de DNA desejada. Esses iniciadores são delineadosde modo a promoverem o início da replicação decada uma das duas fitas da dupla-hélice do DNA original.Uma vez que os iniciadores devem ser sintetizados quimicamente,a PCR pode ser utilizada somente para clonarDNAs cujas sequências inicial e final sejamconhecidas.Orientada por esses iniciadores, a DNA-polimerase podefazer várias cópias (bilhões de cópias em um espaço detempo relativamente curto) da sequência desejada.
APLICAÇÕES
● A PCR pode ser usada também para diagnósticos específicos para sequências conhecidas de DNA, como detectar a presença de uma determinada sequência de DNA em uma amostra. Por exemplo, verificar a presença de vírus em uma amostra de sangue, realizando a reação com iniciadores complementares a sequências de DNA viral conhecidas.
-Diagnóstico de infecções: Bactérias, vírus, fungos, protozoários.
- Quantificação de DNA ou RNA viral/célula hospedeira.
- Diagnóstico de mutações gênicas e doenças genéticas.
● OBS: A PCR com transcriptase reversa (RT-PCR) é uma técnica utilizada para produzir muitas cópias de DNA a partir de um segmento de RNA. É um método comum para se estudar o RNA mensageiro.
REAGENTES NECESSÁRIOS PARA A REAÇÃO
● Água - RNASE e DNASE FREE
•Tampão – manter pH da reação constante
• DNA molde (DNA a ser replicado).
• Iniciadores (primer’s) 
• Nucleotídeos (dNTPs)
• MgCl (Co-fator essencial para a atividade da Taq DNA polimerase)
• DNA Polimerase (Taq) – DNA polimerase de uma bactéria que vive em condições extremas, utilizada por conta da sua propriedade enzimática resistente. 
FASES
· 1ª Fase – Desnaturação:
•Aquecimento a mais de 90ºC para a separação da dupla fita
• Separa tanto a Fita de DNA original quanto os produtos de amplificação
· 2ª Fase - Anelamento dos primers:
• Hibridização (acomplamento)
• Temperatura varia entre 40 a 70ºC conforme o par de primers
• Determina a especificidade da ligação
· 3ª Fase – Extensão: tornar o número de moléculas de DNA palpável!
• Atividade da Taq DNA polimerase
• Duplicação do DNA
• Temperatura ótima em torno de 72ºC
● OBS: Girase, ligase e helicase não estão presentes, utiliza-se a temperatura ao invés dessas enzimas. 
TIPOS DE PCR
● PCR convencional
● Nested PCR (duas etapas (rounds) de amplificação - melhorar especificidade e eficiência da reação).
● PCR em tempo real (qPCR)
● RT-PCR [transcriptase reversa - RNA, que é convertido em cDNA (DNA complementar)].
● PCR Multiplex (mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico).
CONCLUSÕES
● Método in vitro de replicação do DNA.
● Amplifica sequências específicas de DNA.
● Processo realizado em vários ciclos com diferentes temperaturas.
● A PCR é um processo de replicação do DNA in vitro.
● Amplifica fragmentos específicos do DNA total.
● Ocorre em 3 etapas.
● O papel da maior parte das enzimas é substituído por temperaturas ou reagentes da técnica.
● É aplicada para fins diagnósticos na identificação, quantificação e análise de processos fisiopatológicos.
FIBROSE CÍSTICA
● Distúrbio na secreção glandular (aumento na viscosidade da secreção).
● Mutação autossômica recessiva no braço longo do cromossomo 7.
● São mais de 2000 mil mutações. 
● Problema na síntese da proteína (87%) e no processamento (12%). 
● Os fármacos vão ajustar o funcionamento das proteínas defeituosas. 
● Lumacaftor – irá fazer a proteína defeituosa chegar a membrana mesmo defeituosa e então não sofre a ação de proteólise (a proteólise é um mecanismo normal do organismo que faz apoptose de proteínas defeituosas). 
● Ivacftor – irá potencializar a abertura dos receptores com atividade reduzida.