Métodos aplicados a Imunologia Clínica

Prévia do material em texto

Natureza das reações Antígeno-Anticorpo 
• Modelo chave-fechadura: 
 
Essa relação se dá através de: 
• Pontes de hidrogênio; 
• Ligações eletrostáticas; 
• Forças de Van der Waals; 
• Hidrofóbicas. 
Afinidade 
É a força da reação entre um único 
determinante antigênico e um único sítio 
de combinação no anticorpo. 
Alta afinidade: O complexo Ag-Ac tende a 
se manterem unidos. 
Baixa afinidade: Os complexo Ag-Ac 
tende a se dissociar. 
Avidez 
É uma medida da força total de ligação de 
um antígeno contendo muitos 
determinantes antigênicos e anticorpos 
multivalentes. 
AFINIDADE X AVIDEZ 
Afinidade se refere à força de ligação entre 
um único determinante antigênico e um 
sítio de combinação de um anticorpo 
particular, enquanto que avidez se refere à 
força total de ligação entre antígenos e 
anticorpos. 
Reação Cruzada 
• Especificidade: Se refere à habilidade 
de um sítio de combinação de 
anticorpo em particular de reagir com 
apenas um antígeno; 
• A Reação cruzada refere-se a 
habilidade de um sítio de combinação 
de anticorpo em particular de reagir 
com mais de um determinante 
antigênico ou a habilidade de uma 
população de moléculas de anticorpos 
de reagir com mais de um antígeno. 
 
Fatores que afetam a reação antígeno-
anticorpo 
• Afinidade; 
• Avidez; 
• Razão Ag-Ac (efeito 
pró-zona); 
• Forma física do Ag; 
(solúvel/particulado). 
 
Testes sorológicos 
DIRETO: Quando se investiga a presença 
do antígeno ou do próprio patógeno na 
amostra. 
INDIRETO: Quando se pesquisa proteínas 
ou anticorpos contra determinado 
microrganismo. 
Aglutinação passiva 
Precipitação → Aglutinação 
Se eu tenho um antígeno solúvel, na hora 
em que ocorre a reação antígeno-
anticorpo, o antígeno precipita. 
• Aglutinação passiva é aplicada a Ag 
solúveis, proteicos ou polissacarídeos. 
• Ex: Látex PCR 
• Reação de aglutinação: É a formação 
de agregados suficientemente 
grandes, de células interligadas por 
pontes moleculares de anticorpos que 
se combinam simultaneamente com 
os determinantes antigênicos iguais, 
porém situado a superfície de células 
diferentes. 
Fatores que afetam a reação de 
aglutinação 
• Fenômeno pró-zona: Região com 
excesso de c levando a inibição da 
aglutinação- Excesso de Ac, menor 
possibilidade de que o mesmo Ac se 
ligue a determinantes Ag diferentes. 
• Anticorpos incompletos ou 
bloqueadores: Há soros que contém 
Ac IgG, contra hemácias Rh, que são 
incapazes de promover aglutinação 
(inacessibilidade dos determinantes 
ou pobreza dos determinantes 
antigênicos). Entretanto, faz-se o 
tratamento com tripsina, papaína, 
bromelina e albumina. Ou utilizamos o 
Soro de Coombs. 
 
 
 
Reação de Coombs 
• Para saber se as hemácias da criança 
estão sensibilizadas utiliza-se a 
Reação de aglutinação- Coombs 
Direto; 
TESTE DE COOMBS DIRETO 
 
TESTE DE COOMBS INDIRETO 
• É utilizado para fazer prova cruzada 
entre um doador e um receptor de 
sangue, para saber se existem 
anticorpos contra as hemácias do 
doador. 
Reação de aglutinação 
• Látex-PCR: Partículas de látex 
estabilizadas e sensibilizadas com Ac 
anti-proteína C reativa humana. 
- Testes limite mínimo de detecção; 
- Podem ser qualitativo ou semi-
quantitativo. 
• Utilizado para diagnóstico e 
acompanhamento terapêutico (sífilis); 
• Baseia-se na pesquisa de Ac contra a 
cardiolipina, presente em diversos 
tecidos, que atingem elevados níveis 
na infecção por Treponema pallidum; 
• Pode permanecer reagente após a 
cura da infecção apresentando 
quedas progressivas em seus títulos; 
• RN não infectados podem apresentar 
teste reagente devido a presença de 
Ac maternos, ou seja, não indicado o 
uso; 
• Títulos são considerados positivos 
quando 1/16 ou mais. 
Resultado em títulos 
1. Identifique um tubo para cada 
amostra; 
2. Pipete 350 µl de solução salina em 
cada tubo previamente identificado; 
3. Homogeneíze a amostra e pipete 50 µl 
no tubo correspondente. Com esses 
volumes você vai obter a diluição 1/8. 
TÍTULO é a concentração de uma solução 
determinada por titulação. É a menor 
quantidade ou concentração que produza 
um efeito particular ou produto. O título é 
a recíproca da diluição. Então, em uma 
reação de pesquisa de anticorpos positiva 
da diluição ½ e ¼ e negativa na diluição 
1/8 e 1/16, o título é 4. 
Antígeno + Anticorpo = Fixação do 
Complemento 
• IgM, IgG1 e IgG3; 
• Ag solúveis e particulados; 
• Utilizam sistema indicador (Hc de 
carneiro + Ac específco; 
• Qualitativo e Quantitativo 
Reação de citotoxicidade: Hemólise é um 
fenômeno citotóxico. Ex: Prova de 
linfotoxicidade. 
• A imunofluorescência é usada com o 
objetivo de se identificar a distribuição 
de um antígeno anatomicamente, ou 
seja, sua localização em tecidos ou 
células, intracelular ou de membrana; 
• Utiliza anticorpos ligados a 
fluorocromos; 
• Absorvem luz em comprimento de 
onda curto e elevada energia e são 
capazes de emitir luz em comprimento 
de onda maior e em baixa energia; 
• Isotiocianato de fluoresceína, lisamina 
rosamina B, fieritrina e vermelho Texas 
Direta 
• Maior custo: Requer um conjugado 
Ac-Fluorocromo para cada Ag; 
• Ex: Estreptococcus beta-hemolíticos, 
bacilo diftérico. 
Indireta 
• Mais evidente: várias moléculas do Ac 
fluorescente ligam-se a Ig; 
• Pode-se utilizar o mesmo conjugado 
para pesquisar Ig em diferentes 
reações; 
• Permite detectar qual a classe de Ac; 
• Por diluições seriadas do soro em 
estudo, tem-se o título da reação; 
• Ex: Toxoplasmose, Sífilis, Chagas e 
Anti-DNA. 
• ELISA detecta substância com 
propriedades antigênicas 
(principalmente proteínas); 
• Baseadas em reação enzimática 
colorimétrica; 
Princípio básico 
• Enzima é utilizada para detectar 
ligação antígeno-anticorpo; 
• A Enzima converte o substrato sem 
cor em um produto colorido, indicando 
a presença do complexo antígeno-
anticorpo. 
Ex. peroxidase – peróxido de 
hidrogênio + doador de elétrons 
(revelador). 
• Pode ser usado para detectar a 
presença de antígenos ou anticorpos 
 
ELISA Direto 
1. Anticorpo contra o antígeno 
investigado aderido ao suporte sólido 
(dentro de cada poço) 
2. Adicionado soro para testar presença 
de antígeno 
3. Antígeno específico é ligado se 
contido 
4. Removido soro e antígenos não 
ligados 
5. A ligação do antígeno é forte o 
suficiente para resistir ao processo de 
lavagem 
6. Adição de anticorpos marcados com 
enzima 
7. Anticorpos marcados ligam-se aos 
antígenos 
8. Lavagem para remover aos anticorpos 
não ligados 
9. Adição do substrato da enzima 
10. Leitura da mudança de cor 
ELISA Indireto 
1. Antígeno aderido ao suporte sólido 
2. Adicionado soro para verificar a 
presença do anticorpo 
3. Ligação 
4. Processo de lavagem 
5. Adição do segundo anticorpo 
6. O primeiro anticorpo liga-se ao 
segundo anticorpo 
7. Lavagem dos anticorpos não ligados 
8. Adição do substrato 
9. Leitura da mudança de cor 
• Permite que um determinado tipo 
celular seja rapidamente identificado, 
caracterizado, quantificado e 
selecionado; 
• Susbtâncias marcadas com 
fluorocromos como marcadores das 
moléculas investigadas; 
• Permite leituras em um ou mais 
comprimento de onda de modo que 
diferentes fluorocromos podem ser 
usados e vários marcadores podem 
ser medidos simultaneamente. 
1. Preparação das células e marcação 
com reagentes fluorescentes; 
2. Processamento das células marcadas 
no citômetro de fluxo e coleta dos 
dados; 
3. Análise dos dados 
Ex: Histogramas 
Aplicação: Contagem de células 
específicas, HLA e sequências genéticas. 
• Quantifica Ag e Ac presente em fluidos 
corporais; 
• Muito usado para dosagens de 
hormônios e marcadores tumorais; 
• Método imunológico baseado na 
emissão de energia a partir de uma 
reação química (pode ser enzimática); 
• A técnica se baseia na ligação de Ag-
Ac. Um dos dois reagentes é 
conjugado a uma substância que, 
quando ativada, emite luz visível. 
Então, a emissão de luz é proporcional 
ao agente pesquisado. 
Diferençaspara o radioimunoensaio 
Radioimunoensaio foi a primeira técnica 
desenvolvida para dosagem hormonal e 
de outras substâncias presentes em 
pequenas concentrações em fluídos 
biológicos, sendo um método muito 
sensível para análise quantitativa Ag-Ac. 
Limitações 
• Material radioativo; 
• Validade curta desse reagente; 
• Demora na execução do teste. 
Vantagens da quimioluminescência 
• Opção de ensaio com elevada 
sensibilidade e especificidade 
adequada; 
• Exame automatizado e rápido; 
• Várias amostras podem ser analisadas 
e distintas substâncias investigadas 
de uma só vez; 
• A técnica se baseia na ligação de Ag-
Ac. Um dos dois reagentes é 
conjugado a uma substância que, 
quando ativada, emite luz visível. 
Então, a emissão de luz é proporcional 
ao agente pesquisado. 
 
• Os fótons são medidos através de um 
fotomultiplicador que tem a função de 
transformar a luz emitida pelos fótons 
em impulsos elétricos; 
• Estes impulsos são lidos em 
contagens de luz por segundo (cps). 
Essa unidade é proporcional a 
quantidade de Ag na amostra.