Apostila Microbiologia

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NORMAS GERAIS DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
 
1. NORMAS DE BIOSSEGURANÇA 
 
• É obrigatório o uso de jaleco com mangas longas, sendo que este nunca deve ser 
intercambiado com os colegas depois de ser usado. O jaleco somente deverá ser 
usado no interior do laboratório e em corredores de áreas técnicas comuns, devendo 
ser retirado quando sair do ambiente. 
• Deixar casacos, bolsas, livros e outros pertences na estante que fica na entrada do 
laboratório. 
• Não colocar objetos de uso pessoal sobre as bancadas. 
• Lavar as mãos ao entrar e antes de sair do laboratório e, após, friccionar álcool 70 % 
deixando secar ao ar. 
• Não fumar, comer ou ingerir líquidos dentro do laboratório. 
• Não tocar nos olhos, boca ou nariz com as mãos. 
• Não cortar fitas adesivas com a boca. 
• Não fazer uso de lenços ou jaleco para limpar objetos ou instrumentos de trabalho. 
• Manter nas proximidades do local de trabalho um desinfetante (álcool etílico 70%; 
fenol 5 a 10%). 
• Cuidado ao acender o bico de Bunsen, verificando se não existe substância inflamável 
por perto. 
• Utilizar somente calçados fechados e de solado que dê aderência ao chão. Não é 
permitido o uso de chinelos e sandálias dentro da área laboratorial. 
• Os cabelos devem ser presos na sua totalidade. 
• Não utilizar joias e bijuterias que dificultem o trabalho e favoreçam a ocorrência de 
acidentes e contaminação. 
• As unhas devem ser curtas, de preferência sem esmalte. 
• Usar luvas quando as atividades a serem desenvolvidas exigirem contato com fluidos 
corporais ou cultura de micro-organismos. 
• Usar máscara sempre que manipular substâncias químicas com alto teor de 
evaporação e em área de alta contaminação com produtos biológicos. 
• Usar protetor facial, como óculos de segurança, principalmente quando houver 
possibilidade de espirros de fluidos. 
• É proibido o manuseio de maçanetas, telefones, puxadores de armários ou outros 
objetos de uso comum, por pessoas usando luvas, durante a execução de atividades 
em que agentes patogênicos ou material correlato (químico e ou biológico) esteja 
sendo manipulado. 
• Não é permitida a presença de animais e plantas que não estejam relacionados com 
as atividades do laboratório. 
• Minimizar a formação de aerossóis durante as manipulações laboratoriais. Especial 
atenção deve ser dada ao uso de centrífugas, que quando manuseadas 
erroneamente, produzem partículas respiráveis que podem ser ejetadas durante o uso 
do equipamento, devendo ser operadas de acordo com as instruções do fabricante. 
• Não levar luvas para áreas externas ao laboratório. 
• Comunicar ao professor se possuir algum ferimento nas mãos. 
• Em caso de acidente, comunicar imediatamente o professor e ou o técnico 
responsável. 
• Tratar os cortes, perfurações ou abrasões imediatamente, limpando com solução 
antisséptica e cobrindo com curativo. 
• Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver contraído uma enfermidade, 
como consequência de uma infecção no laboratório. 
 
2. NORMAS DO TRABALHO MICROBIOLÓGICO 
 
• Cada aluno é responsável pelo material que receber. 
• No início de cada aula, traçar um plano de trabalho, considerando o tempo necessário 
para uma análise e a sua leitura. 
• Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranquila, constante e metódica, evitando 
movimentos desnecessários como trocas de lugar, etc. 
• Limpar e desinfetar com álcool 70 % a superfície de mesas e balcões antes e depois 
do trabalho de cada dia. 
• Efetuar o registro de análise, anotando o tipo de amostra, procedência, dia e hora de 
entrada no laboratório e qualquer outra observação prévia à análise. Na análise 
propriamente dita anotar: data, método, meio de cultura empregado e os resultados 
obtidos. 
• Identificar as amostras antes de iniciar a análise e, em geral, não descartar até obter 
os resultados. 
• O material a ser analisado deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estéreis 
e nunca com as mãos. 
• Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso (limpar a alça de semeadura, com 
exceção da alça calibrada, em areia e álcool antes de flambá-la). 
• Colocar todo material usado, tais como lâminas, lamínulas, pipetas, etc. em 
recipientes adequados com solução desinfetante. 
• Os cultivos, antes de terminada a análise, devem ser conservados na geladeira de 
material contaminado. 
• Os cultivos, após terminada a análise, devem ser colocados no descarte de materiais 
contaminados. 
• Nunca desprezar materiais contaminados na pia do laboratório. 
• Colocar todo o material contaminado em recipiente apropriado e descontaminar na 
autoclave antes de proceder a lavagem. 
• O material utilizado na prática microbiológica deve receber a seguinte sequência de 
tratamento: esterilização, lavagem, secagem, acondicionamento, esterilização, 
armazenamento. 
• Não retirar qualquer cultivo do laboratório. 
• Evitar salpicar bancadas e piso com água ou soluções corantes. 
• No caso de derrubar material contaminado em bancadas ou piso, cobrir com fenol 5 
a 10%, recobrir com papel toalha e embeber novamente com fenol. Não esqueça de 
comunicar o professor ou técnico. 
• Seguir as normas de uso de equipamentos. 
 
Recomendações: 
 A distância do assento, diante da bancada de trabalho, deverá ser regulada de modo 
que os antebraços do manipulador repousem facilmente sobre a bancada. Assim, o tremor 
das mãos, frequente no começo das atividades práticas, será grandemente reduzido. 
 
3. PROCEDIMENTOS NOS CASOS DE ACIDENTES 
 
• Comunicar ao professor ou técnico quando derramar ou quebrar tubos, frascos, 
pipetas, placas de Petri ou recipientes contendo micro-organismos patogênicos. 
• Um dos acidentes mais perigosos, devido à grande produção de aerossóis, é a quebra 
de tubos durante a centrifugação. A centrífuga não deve ser aberta até que se 
completem 30 minutos (tempo necessário para a sedimentação dos aerossóis). 
Recolher os cacos de vidro com uma pinça e desinfetar a centrífuga com álcool 70 %. 
 
VIDRARIA, EQUIPAMENTOS E OUTROS MATERIAIS UTILIZADOS 
NAS PRÁTICAS MICROBIOLÓGICAS 
 
1. VIDRARIA 
 
• Alça de Drigalsky: para distribuição de amostras líquidas sobre meio de cultura em 
placa de Petri. 
• Balão de fundo chato e erlenmeyer de 125, 250, 500, 1000 e 2000 mL: preparo de 
meios de cultura e soluções. 
• Béquer (Becker) de 100, 250, 500, 1000 e 2000 mL: uso diverso. 
• Frasco conta-gotas: armazenamento de soluções corantes. 
• Frascos de cor âmbar com rolha esmerilhada: estoque de soluções corantes. 
• Funil: filtração e transferência de líquidos. 
• Gral e pistilo: trituração de corantes ou material de biópsia. 
• Kitassato de 125, 250, 500 1000 e 2000 mL: equipo para filtração a vácuo. 
• Lâminas (26 x 76 mm) e lamínulas (20 x 20 mm): para preparações coradas e a fresco. 
• Lâmina escavada (lâmina de Koch): usada para reações de aglutinação e para 
observação de micro-organismos pela técnica da gota pendente. 
• Pipetas Pasteur: transferência de líquidos. 
• Pipetas volumétricas: medição e transferência de líquidos. Possui grande precisão. 
• Pipetas graduadas (sorológicas ou de Mohr): medida e transferência de líquidos. 
• Placas de Petri: acondicionamento de meios de cultivo. 
• Provetas de 10, 50, 100, 250, 500, 1000 e 2000 mL: para medida de líquidos que 
serão usados no preparo de meios de cultura, reagentes e soluções corantes. 
• Tubos de Durham: são colocados invertidos dentro de tubos de ensaio e servem para 
captar o gás formado em uma fermentação. 
• Tubos de ensaio: são apresentados nos tamanhos 13 x 100 mm, 16 x 150 mm, 18 x 
180 mm que servirão para distribuição de volumes de 3, 5 e 10 mL, respectivamente. 
Os tubos podem possuir tampa de rosca ou não. 
 
 
 
2. EQUIPAMENTOS 
 
Os equipamentos utilizados no trabalho microbiológico variam de conformidade com a 
complexidade das atividades desenvolvidas no laboratório. A seguir, serão apresentados os 
equipamentosque podem ser encontrados em um laboratório de Microbiologia, bem como 
seu uso: 
• Agitador de tubos de ensaio tipo "mixer" ou "vortex": utilizado para homogeneizar 
suspensão de micro-organismos ou suspensão de materiais biológicos. 
• Agitador magnético (com ou sem placa aquecedora): dissolução de meios de cultura 
ou soluções. 
• Autoclave de Chamberland: utilizada para esterilização de soluções, meios de cultura, 
materiais contaminados e vidrarias. 
• Balança semi-analítica (10 mg a 1200 g) e analítica (100 g e 210 g): pesagem de 
corantes e reagentes para preparo de meios de cultura e soluções. 
• Banho-Maria: utilizado para preparo de meios de cultura e para a incubação de 
culturas de micro-organismos em meios líquidos. 
• Bico de Bunsen: manipulação asséptica de micro-organismos; flambagem de alças, 
agulhas, pinças, tesouras, etc. 
• Bomba de vácuo: auxílio em processos de filtração. 
• Câmara asséptica (cabine de fluxo laminar): manipulação de micro-organismos; 
distribuição de meios de cultura. 
• Centrífuga (3000 rpm): utilizada para sedimentar partículas sólidas de meio líquido. 
• Contador de colônias: utilizado para contar as colônias que crescem em meios sólidos 
contidos em placas de Petri. 
• Deionizador: sistema de filtragem que elimina os íons dissolvidos da água, cátions 
(íons Ca++, Mg++, Na++) e ânions (íons HCO2-, CO2-, Cl-, SO4-, SiO2-), através de trocas 
iônicas efetuadas por resinas catiônica e aniônica. São utilizados os mais variados 
tipos de resinas, selecionadas conforme aplicação e qualidade final requerida da 
água. 
• Destilador de água: fornecer água mais pura para o preparo de meios de cultura, 
corantes e reagentes. 
• Estufa bacteriológica – B.O.D. (35-37°C): incubação de culturas de micro-organismos. 
Existem micro-organismos que requerem temperaturas diferentes, como 4, 25, 42 e 
45°C. 
• Estufa de secagem (80-100°C): secagem de vidrarias. 
• Estufa de esterilização (100 a 300°C): conhecida como Forno Pasteur, é utilizada para 
esterilizar, a seco, materiais como vidrarias, pinças, tesouras, glicerina, etc. 
• Forno de micro-ondas: usado para aquecimento e dissolução de meios de cultura. 
• Freezer (-20 ou -70°C): utilizado para guardar culturas de micro-organismos, 
antimicrobianos, reagentes, etc. 
• Jarra de anaerobiose: usada para incubar meios de cultivos semeados com micro-
organismos que requerem tensão de CO2 para crescimento. 
• Micropipetadores: medição de pequenos volumes. 
• Microscópico estereoscópico (lupa): estudo da morfologia de colônias microbianas. 
• Microscópio ótico comum de campo claro: observação de preparações em lâminas 
coradas ou a fresco. 
• Peras: medição de volumes. 
• Potenciômetro ou pHmetro: medir pH de meios de cultura e reagentes. 
• Refrigerador (4°C a 8°C): armazenamento de meios de cultivo e de cultura de micro-
organismos. 
 
3. MATERIAIS 
 
• Ágar-ágar. 
• Alça e agulha de semeadura (níquel-cromo ou platina): usadas para isolamento e 
semeadura de micro-organismos. Para uso em rotina, as alças e agulhas devem ser 
de fio n° 24 (Brown & Sharp 24 ou BS 24) e o comprimento deve ser de 45 a 50 mm. 
As alças devem ter um diâmetro interno de 3 mm. 
• Álcool 70% ou 70° GL (Graus Gay-Lussac) e 98° GL. 
• Algodão hidrófilo e hidrófobo: usado para confecção de buchas para tubos de ensaio 
e para proteção do bocal de pipetas. 
• Barbante: usado para acondicionamento de materiais. 
• Corantes em pó ou preparados: usados para coloração de lâminas contendo micro-
organismos ou materiais biológicos. 
• Estante: suporte para tubos de ensaio. 
• Fita crepe. 
• Meios de cultura desidratados ou prontos para uso: cultivo de micro-organismos. 
• Membranas filtrantes. 
• Papel de filtro. 
• Papel kraft: usado para acondicionamento de materiais. 
• Pinças de pressão. 
• Sais e açúcares: preparo de meios de cultura e soluções reagentes. 
• Substratos para provas bioquímicas. 
• Tesoura: acondicionamento de materiais. 
• Tubos de látex 204: usados em equipo para filtração. 
LAVAGEM E ACONDICIONAMENTO DE MATERIAIS
1. INTRODUÇÃO
A lavagem e esterilização de materiais são atividades de apoio aos vários
processos de análises de laboratório, sendo definidas como a eliminação de resíduos
orgânicos de proteínas e de produtos de metabolização dos componentes do meio de
cultura, após o seu uso.
É de fundamental importância a escolha dos detergentes, equipamentos e
métodos empregados. Com a lavagem inadequada da vidraria poderão ficar restos de
meios de cultura e metabólitos que irão interferir nos constituintes das soluções e
meios de cultura e, consequentemente, nos resultados dos exames. Com o enxague
inadequado, poderão permanecer resíduos de detergente na vidraria, que podem
influenciar no crescimento dos micro-organismos.
2. LAVAGEM MANUAL DE VIDRARIAS
a) Tubos de Ensaio
* Colocar os tubos na autoclave, com as tampas de rosca afrouxadas, para
descontaminação a 121ºC por 30 minutos.
* Descartar o conteúdo dos tubos.
* Escovar a parte interna de cada tubo com o auxílio de uma escovinha e solução de
detergente a 0,5%.
* Enxaguar 10 vezes em água corrente, enchendo e esvaziando totalmente os tubos.
* Enxaguar uma vez em água destilada ou deionizada.
b) Placas de Petri
* Após a descontaminação, por autoclavação, lavar individualmente cada uma das
partes da placa (tampa e fundo) com o auxílio de uma esponja, para retirar marcas
de lápis dermatográfico e resíduos de meio de cultura.
* Enxaguar 10 vezes em água corrente, esfregando com as mãos as superfícies
internas e externas de cada uma das partes das placas. Verificar se todos os
resíduos foram eliminados.
* Enxaguar uma vez cada uma das partes da placa em água destilada ou deionizada.
c) Pipetas
* Após a descontaminação por autoclavação, tomando cuidado para não quebrar o
bocal, retirar o tampão de algodão (bucha) de cada pipeta através de vácuo ou
estilete de ponta fina (palitos, agulha).
* Colocar as pipetas em caixas contendo solução de detergente a 0,5 e ferver para
eliminar os resíduos da parede.
* Enxaguar 10 vezes em água corrente enchendo e esvaziando totalmente as
pipetas.
* Enxaguar uma vez em água destilada ou deionizada.
d) Lâminas e lamínulas
* Colocar o material em recipiente adequado e cobrir com solução de detergente 0,5
a 1,0%.
* Aquecer até a ebulição e manter a fervura por 5 a 10 minutos.
* Enxaguar em água corrente até a retirada do detergente.
* Enxaguar com água destilada.
* Secar com o auxílio de um pano limpo e macio (gaze).
* Desprezar as lâminas e lamínulas que estiverem muito riscadas ou foscas.
* Lavagem com "solução" sulfo-crômica
Esta lavagem se faz necessária quando a vidraria apresenta resíduos que
resistiram à lavagem com detergente.
O procedimento a seguir é:
* Adicionar 50 mL de "solução" sulfo-crômica no frasco a ser lavado.
* Agitar com os devidos cuidados cinco ou seis vezes.
* Com o auxílio de um funil transferir a "solução" sulfo-crômica usada para o próximo
frasco a ser lavado.
* Este procedimento poderá ser repetido, sem descarte da "solução", para a lavagem
de, no máximo, 10 frascos.
* Enxaguar 10 vezes em água corrente, enchendo e esvaziando totalmente os
frascos.
* Enxaguar uma vez em água destilada ou deionizada, realizando medidas de pH da
água destilada ou deionizada antes e depois do enxague (de preferência deixar o
frasco em teste com água destilada durante a noite e após, realizar a medida de pH
em potenciômetro (pHmetro).
3. SECAGEM
Deixar escorrer toda a água e colocar a vidraria na posição emborcada na
estufa de secagem a 100º C por 1 hora.
4. ACONDICIONAMENTO
Todo material utilizado no trabalho microbiológico deve ser perfeitamente limpo
e também estéril. Para ser esterilizado, o material deve ser acondicionado.
A vidraria, após cuidadosa lavagem e secagem, é acondicionada com papel
(kraft, tigre, etc.) e esterilizadaem autoclave a 121º C por 15 minutos ou em forno de
Pasteur a 160º C por 2 horas.
Os materiais devem ser acondicionados utilizando-se os métodos:
* A boca de toda a vidraria como tubos, garrafas, balões e erlenmeyers é fechada
com tampões de algodão (buchas), que não devem ser folgados ou
demasiadamente apertados.
* As garrafas, erlenmeyers, balões de fundo chato, etc. além da bucha de algodão,
levam também um invólucro de papel, o qual é amarrado com barbante ou fita
crepe.
* Os tubos de ensaio, depois de fechados com as buchas de algodão, são
empacotados. O número de tubos depende da necessidade de uso do laboratório.
* As placas de Petri são embrulhadas individualmente ou em número de 2, 5, 10,
etc., conforme a demanda de uso. Os pacotes são fixados com barbante ou fita
crepe.
* Pipetas são embuchadas na extremidade destinada a aspiração, com pequena
bucha de algodão colocada com o auxílio de uma agulha ou estilete, sendo então,
totalmente envolta em papel de embrulho. Elas também podem ser acondicionadas
em pacotes de papel (conjunto de 5, 10 e 20) ou em cilindros de aço inoxidável
especialmente fabricado para este propósito. A bucha não permite a penetração de
micro-organismos que poderiam contaminar os líquidos e protegem o operador de
líquidos contaminados.
* Os swabs (cotonetes ou zaragatoa) devem ser recobertos com papel alumínio e
embaladas em pacotes de papel (com marcas que identifiquem o local onde está o
cabo do swab) ou colocados em frascos autoclaváveis que devem ser embuchados
e envolvidos parcialmente em papel.
5. MOVIMENTAÇÃO DA VIDRARIA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
LAVAGEM
→
SECAGEM
→
ACONDICIONAMENTO
↑ ↓
DESCONTAMINAÇÃO
←
USO
←
ESTERILIZAÇÃO
ROTEIRO DO DESENVOLVIMENTO DA PRÁTICA
Trabalho individual:
a) Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. 
b) Lavar as mãos. 
c) Embuchar, conforme orientação do professor, 3 tubos de ensaio.
d) Acondicionar pipetas graduadas (1, 2, 5 e 10 mL): com auxílio de um clips para
papel, colocar uma pequena bucha de algodão no bocal da pipeta. Verificar,
assoprando suavemente na pipeta, se a bucha está adequada. Não deve estar
frouxa, nem muito apertada, o que dificultaria a passagem do ar. Acondicionar
individualmente cada pipeta utilizando papel kraft. Amarrar com barbante ou fita
crepe e anotar o volume da pipeta.
e) Produzir 5 swabs (zaragatoas) utilizando palito para churrasco, algodão e papel
alumínio.
Trabalho em equipe:
a) Acondicionar os tubos embuchados em pacotes, utilizando papel kraft e barbante
ou fita crepe.
b) Acondicionar 1 erlenmeyer.
c) Acondicionar 3 placas de Petri.
d) Acondicionar os swabs confeccionados utilizando papel kraft e fita crepe.
*Não esqueça de identificar o material e colocar a data.
MEIOS DE TRANSPORTE E DE CULTURA
Os meios de transporte são empregados com a finalidade de manter a amostra
viável para a realização da análise microbiológica quando não é possível executar a cultura
imediatamente após a coleta do material.
Os meios de cultura, por definição, destinam-se ao cultivo artificial de micro-
organismos e podem, de uma maneira geral, ser classificados de acordo com suas
características e ou aplicações.
Em relação à procedência, os meios de transporte e cultura podem ser:
- Naturais: são aqueles que não sofrem alteração na sua composição. Ex. batata,
cenoura, leite, suco de laranja, etc.
- Artificiais: são preparados pela mistura de diversas substâncias. Ex. ágar
simples, ágar chocolate, ágar Mueller Hinton, MacConkey, etc.
Em relação à consistência, os meios podem ser classificados em:
- Líquidos: não contêm ágar.
- Semi-sólidos: Contém de 0,3-0,5% de ágar.
- Sólidos: Geralmente contém de 1,3 a 2% de ágar.
Em relação aos componentes da fórmula, os meios podem ser classificados em:
- Sintéticos: aqueles cuja composição química é conhecida quantitativamente.
- Complexos ou indefinidos: aqueles em que não se conhece a composição exata
dos seus ingredientes. É conhecida sua composição química qualitativamente.
- Transporte: possui a finalidade de manter mais ou menos estável a população
microbiana presente na amostra. Meio que não contém fontes de carbono e de nitrogênio.
Isto faz com que as bactérias permaneçam viáveis, mas não podem multiplicar-se.
- Simples: destinados ao cultivo de micro-organismos pouco exigentes ou servem de
base para outros meios de cultura.
- Enriquecidos: meios de composição simples adicionados de substâncias muito nu-
tritivas que melhoram o seu valor nutritivo e que muitas vezes podem privilegiar o cresci-
mento de determinado grupo de bactérias.
- Diferenciais: meios que permitem, através da visualização macroscópica, a
diferenciação de micro-organismos com características fisiológicas diferentes.
- Seletivos: são meios que contém substâncias inibidoras para determinados grupos
microbianos, com finalidade de permitir a dominância absoluta e o crescimento muito mais
rápido do micro-organismo que se deseja isolar.
As principais substâncias que inibem grupos de bactérias são: 
- Corantes: azul de metileno, cristal violeta, verde brilhante, vermelho neutro: inibem
os gram-positivos. 
- Citratos: inibem o grupo coliforme. 
- Sais biliares (desoxicolato de sódio): inibem os gram-positivos.
- Azida sódica: inibem bacilos gram-negativos.
As principais substâncias que servem como indicadores são: 
- Tiossulfato de sódio: fornece enxofre para a produção de ácido sulfídrico (H2S). 
- Sais de ferro: serve como indicador para verificar a produção de H2S. O H2S
formado reage com o ferro formando sulfeto ferroso que se precipita (cor negra). 
MEIO DE STUART
1. Finalidade: transporte de amostras clínicas, com o intuito de preservar a viabilidade das
bactérias durante o transporte, sem multiplicação significativa dos micro-organismos.
2. Fórmula:
Cloreto de sódio 3,0 g
Cloreto de potássio 0,2 g
Fosfato dissódico 1,15 g
Fosfato monopotássico 0,2 g
Tioglicolato de sódio 1,0 g
Cloreto de cálcio 1% 10,0 g
Cloreto de magnésio 1% 10,0 g
Ágar-Ágar 4,0 g
H2O destilada 1000 mL
 pH - 7,3
3. Mecanismo: este meio é semi-sólido, tamponado e contém tioglicolato de sódio como
agente redutor. Mantém pH favorável e previne a desidratação das secreções durante o
transporte, como também, a oxidação e a auto destruição enzimática do patógeno presente.
CALDO SIMPLES
1. Fórmula:
Extrato de carne 5,0 g
Peptona 10,0 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Água destilada 1000 mL
2. Preparo: adequar a fórmula à quantidade de meio a ser preparado. Pesar os ingredientes
do meio e dissolver em água fria. Aquecer em banho-Maria, agitar frequentemente, porém
evitar a formação de bolhas e ou espuma. Tomar cuidado para que o meio de cultivo não
entre em ebulição. Distribuir em recipiente adequado, acondicionar e esterilizar na autoclave
durante 15 minutos a 121° C. Fazer o controle de esterilidade (estufa 35°C por 24-48h).
Manter o meio em refrigerador a 4°C até o uso.
ÁGAR SIMPLES
1. Fórmula:
Extrato de carne 5,0 g
Peptona 10,0 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Ágar-ágar 20,0 g
Água destilada 1000 mL
2. Preparo: pesar os ingredientes do meio, acrescentar água fria e deixar em repouso por
10 a 15 minutos à temperatura ambiente. Aquecer em banho-Maria, agitando
frequentemente, porém, evitando a formação de bolhas e ou espuma, até completa
dissolução do meio de cultivo. Tomar cuidado para que o meio não entre em ebulição.
Colocar em recipiente adequado, acondicionar e esterilizar na autoclave durante 15 minutos
a 121° C. Retirar da autoclave, distribuir em recipiente apropriado e deixar solidificar à
temperatura ambiente. Fazer controle de esterilidade (estufa 35° C por 24-48h).
CARY BLAIR MODIFICADO
1. Finalidade: meio de transporte para fezes.
2. Fórmula:
Fosfato dissódico 1,1 g
Tioglicolato de sódio 1,5 g
Cloreto de sódio5,0 g
Cloreto de cálcio 0,09 g
Ágar-ágar 5,6 g
Água destilada 1000 mL
Esterilizar em vapor fluente (ou fervendo) por 15 minutos.
CALDO GN (segundo HAJNA)
1. Finalidade: meio empregado no enriquecimento de fezes para o melhor isolamento de
Salmonella sp e Shigella sp.
2. Fórmula:
Triptona 20,0 g
Dextrose 1,0 g
D-manitol 2,0 g
Citrato de sódio 5,0 g
Desoxicolato de sódio 0,5 g
Fosfato dipotássico 4,0 g
Fosfato monopotássico 1,5 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Água destilada 1000 mL
 pH 7,0
3. Mecanismo: O citrato e o desoxicolato de sódio atuam como inibidores de micro-
organismos gram-positivos e de alguns coliformes. O manitol favorece o crescimento de
Salmonella sp e de Shigella sp e os sais de fosfato impedem a acidificação precoce do
meio. Bactérias como Proteus sp e Pseudomonas aeruginosa crescem pouco e mais
lentamente que Salmonella sp e Shigella sp nas primeiras 6 a 8 horas de incubação.
4. Incubação: 6 a 8 horas à temperatura ambiente.
ÁGAR SANGUE
1. Preparo: adicionar assepticamente 5 a 10 mL de sangue desfibrinado de carneiro a
100mL de ágar simples fundido e resfriado a 56° C. 
O sangue de outros animais pode ser utilizado, sendo os mais empregados o sangue
de carneiro ou de coelho.
Meios desidratados vendidos comercialmente, como por exemplo o ágar Müeller
Hinton (MHA), o ágar tríptico de soja (TSA), o ágar infuso de cérebro e coração (BHI) e o
ágar Columbia podem também ser utilizados como base para o preparo do ágar sangue.
ÁGAR CHOCOLATE
1. Preparo: aquecer o ágar sangue até que este apresente uma coloração achocolatada,
obtida pelo aquecimento a 80° C em banho-Maria durante aproximadamente dois minutos.
CLED (CISTINA LACTOSE ELETRÓLITOS DEFICIENTE)
1. Finalidade: este meio é recomendado para a pesquisa e diferenciação de micro-
organismos causadores de infecção urinária.
2.Fórmula:
Peptona 4,0 g
Extrato de carne 3,0 g
Hidrolizado tríptico de caseína 4,0 g
L-cisteína 0,128 g
Lactose 10,0 g
Azul de bromotimol 0,02 g
Ágar 15,0 g
Água destilada 1000 mL
pH= 7,3
3. Mecanismo: este meio favorece tanto o crescimento de bacilos gram-negativos quanto de
cocos gram-positivos. Sendo deficiente em eletrólitos, impede o crescimento em véu
(“swarming”) do Proteus mirabilis, que dificulta o desenvolvimento de colônias isoladas. A
lactose presente no meio possibilita a diferenciação de bactérias fermentadoras desse
açúcar. Esta prova é fundamental na identificação bioquímica dos bacilos gram-negativos
pertencentes à família Enterobacteriaceae. Além disso, é ótimo para o crescimento de
leveduras, pois é isento de substâncias micostáticas.
4. Leitura e interpretação:
 Colônias amarelas: bactérias fermentadoras da lactose.
 Colônias transparentes: bactérias não fermentadoras da lactose.
CHAPMAN
1. Finalidade: verificar se a bactéria é capaz de crescer em meio contendo alta concentração
de NaCl (7,5 %). O gênero Staphylococcus cresce neste meio, enquanto os gêneros
Micrococcus, Planococcus e Stomatococcus não o fazem.
2. Fórmula:
Peptona especial 10,0 g
Extrato de carne 1,0 g
Cloreto de sódio 75,0 g
Manitol 10,0 g
Vermelho de fenol 0,025 g
Ágar 12,0 g
Água destilada 1000 mL
3. Leitura a interpretação:
 POSITIVO: Presença de crescimento.
 NEGATIVO: Ausência de crescimento.
HOLT-HARRIS & TEAGUE
1. Finalidade: meio seletivo para o isolamento de bacilos gram-negativos e diferencial para
os bacilos que fermentam a lactose e ou sacarose.
2. Fórmula:
Peptona de caseína 10,0 g
Lactose 5,0 g
Sacarose 5,0 g
Fosfato dipotássico 2,0 g
Eosina “Y”(amarela) 0,4 g
Azul de metileno 0,065 g
Ágar-Ágar 13,5 g
Água destilada 1000 mL
pH 7,1
3. Mecanismo: os corantes do meio (azul de metileno e eosina Y) formam o sal complexo
eosinato de azul de metileno, responsável pela cor achocolatada do meio de cultura. O
desenvolvimento de bactérias fermentadoras de lactose e ou sacarose proporciona a
acidificação do meio de cultura e a dissociação do complexo eosinato de azul de metileno. A
eosina retoma a sua cor original (fluorescência através da luz refletida), produzindo o
chamado “brilho metálico”. O azul de metileno fornece a coloração escura (azul escuro ou
preto) observada nas colônias lactose e ou sacarose positivas. A lactose e a sacarose
possibilitam a diferenciação de Salmonella sp e Shigella sp, que são lactose e sacarose
negativas, da microbiota contaminante lactose negativa, porém sacarose positiva (Proteus
vulgaris, Citrobacter). A microbiota gram-positiva é inibida pelos corantes (azul de metileno e
eosina amarela) presentes no meio.
4. Leitura e Interpretação:
 Escherichia coli: colônias pretas com ou sem brilho metálico (lac +).
 Outros coliformes: colônias pretas, geralmente sem brilho metálico (lac +).
 Salmonella sp e Shigella: colônias transparentes ou âmbar (lac -).
HEKTOEN ENTERIC ÁGAR
1. Finalidade: meio seletivo-diferencial para o isolamento de enterobactérias patogênicas.
2. Fórmula:
Peptona 12,0 g
Extrato de levedura 3,0 g
Sais biliares 9,0 g
Lactose 12,0 g
Sacarose 12,0 g
Salicina 2,0 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Tiossulfato de sódio 5,0 g
Citrato férrico de amônia 1,5 g
Azul de bromotimol 0,065 g
Fucsina ácida 0,1 g
Ágar 14,0 g
Água destilada 1000 mL
pH 7,5
3. Mecanismo: a alta concentração de sais biliares inibe o crescimento de toda a microbiota
contaminante gram-positiva e retarda o crescimento dos coliformes. O tiossulfato de sódio é
o substrato para a formação de H2S e o citrato férrico de amônia o revelador. As colônias de
bactérias lactose negativas se apresentam verdes ou transparentes, as lactose positivas
laranjas e as colônias H2S positivas com centro negro.
4. Leitura e interpretação:
 E. coli e outros coliformes: colônias cor salmão ou laranja (lac + H2S -)
 Shigella sp: colônias verdes ou transparentes (lac - H2S -)
 Salmonella sp e Proteus sp: colônias verdes ou transparentes com centro negro (lac - H2S
+)
ÁGAR Salmonella-Shigella (SS)
1. Finalidade: meio seletivo para o isolamento de Salmonella sp e Shigella sp a partir de
fezes, alimentos e outros materiais.
2. Fórmula:
Extrato de carne 5,0 g
Peptona especial 5,0 g
Lactose 10,0 g
Bilis de boi dessecada 8,5 g
Citrato de sódio 10,0 g
Tiossulfato de sódio 8,5 g
Sulfato ferroso 1,0 g
Verde brilhante 0,0003 g
Vermelho neutro 0,025 g
Agar 15 g
Água destilada 1000 mL
pH 7,0
3. Mecanismo: a microbiota contaminante gram-positiva é suprimida pelo verde brilhante e
sais biliares, enquanto que os coliformes são parcialmente inibidos pelas altas
concentrações de tiossulfato e citrato. O tiossulfato de sódio é o substrato para a formação
de H2S e o sulfato ferroso o revelador. A lactose atua com substrato para evidenciar o
desenvolvimento de coliformes que ocasionalmente possam crescer. As colônias lactose
negativas se apresentam transparentes, as lactose positivas rosas e as colônias H2S
positivas, com centro negro.
4. Leitura e interpretação:
 E. coli e outros coliformes: colônias rosas (lac + H2S -)
 Shigella sp: colônias transparentes (lac - H2S -)
 Salmonella sp e Proteus sp: colônias transparentes com centro negro (lac - H2S +)
ÁGAR XILOSE LISINA DESOXICOLATO (XLD)
1.Finalidade: meio utilizado para o isolamento e diferenciação de bactérias
enteropatogênicas, especialmente Shigella sp, Salmonella sp e Arizona sp.
2. Fórmula:
Extrato de levedura 3,0 g
Cloridrato de L-lisina 5,0 g
Sacarose 7,5 g
Lactose 7,5 g
Xilose 3,75 g
Desoxicolato de sódio 1,0 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Tiossulfato de sódio 6,8 g
Citrato de ferro amoniacal 0,8 g
Vermelho de fenol 0,08 g
Ágar 12,5 g
Água destilada 1000 mL
 pH 7,4
3. Mecanismo: a fermentação da xilose, lactose e sacarose ocasiona a mudança da cor do
vermelho de fenol paraamarelo, devido à acidificação do meio. O tiossulfato de sódio é o
substrato para a formação de H2S e o citrato de ferro amoniacal o revelador. As bactérias
que descarboxilam a lisina, produzindo cadaverina, apresentam uma colônia de cor
vermelho-púrpura devido ao aumento do pH ao redor das colônias. O efeito inibidor deste
meio de cultura é menor que o dos demais meios moderadamente seletivos.
4. Leitura e interpretação:
 E.coli e outros coliformes: colônias amarelas (lac + H2S -)
 Shigella sp e Providencia sp: colônias transparentes (lac - H2S -)
 Salmonella sp e Proteus sp: colônias transparentes com centro negro (lac - H2S +)
CALDO TRIPTICASEÍNA DE SOJA (Tryptic Soy Broth - TSB)
1. Finalidade: meio rico em nutrientes, para bactérias de fácil ou difícil crescimento.
2. Fórmula:
Triptona 17,0 g
Peptona de farinha de soja 3,0 g
D(+) glicose 2,5 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Fosfato dipotássico 2,5 g
Água destilada 1000 mL
pH = 7,1 a 7,5
ÁGAR TIOSSULFATO CITRATO SAIS BILIARES SACAROSE (TCBS)
1. Finalidade: meio seletivo-diferencial para o isolamento de Vibrio cholerae.
2. Fórmula:
Extrato de levedura 5,0 g
Proteose peptona 10,0 g
Citrato de sódio 10,0 g
Tiossulfato de sódio 10,0 g
Bile de boi dessecada 8,0 g
Sacarose 20,0 g
Cloreto de sódio 10,0 g
Citrato férrico 1,0 g
Azul de bromotimol 0,04 g
Azul de timol 0,04 g
Ágar 15,0 g
Água destilada 1000 mL
pH 8,6 + 0,2
3. Mecanismo: as elevadas concentrações de tiossulfato e citrato, assim como o meio
fortemente alcalino, inibem o crescimento de enterobactérias. A bile de boi inibe
principalmente enterococos. Algumas cepas de Proteus sacarose positivas podem crescer,
formando colônias semelhantes às do Vibrio. As colônias que fermentam a sacarose se
apresentam amarelas. O indicador de pH misto, azul de timol-azul de bromotimol, apresenta
viragem para amarelo devido à formação de ácido, mesmo sendo o meio fortemente
alcalino.
4. Leitura e interpretação:
 Vibrio cholerae: colônias amarelas (sacarose positivas) com centro opaco.
 V. parahaemolyticus: colônias verde-azuladas (sacarose negativas).
 Proteus sp: colônias amarelas ou verdes com centro negro (sacarose negativas, H2S
positivas).
 Outras enterobactérias: geralmente colônias verdes (sacarose negativas).
ÁGAR MAC CONKEY
1. Finalidade: meio seletivo para o isolamento de bacilos gram-negativos e diferencial para
os bacilos que fermentam a lactose.
2. Fórmula:
Peptona de caseína 17,0 g
Peptona de carne 3,0 g
Lactose 10,0 g
Mistura de sais biliares 1,5 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Vermelho neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,001 g
Ágar 13,5 g
Água destilada 1000 mL
 pH 7,1
3. Mecanismo: os sais biliares e o cristal violeta inibem a microbiota gram-positiva. A
lactose, em combinação com o indicador de pH, evidenciam os micro-organismos
degradadores de lactose.
4. Leitura e interpretação:
 E. coli e outros coliformes: colônias rosas (lac +)
 Salmonella sp e Shigella sp: colônias transparentes (lac -)
TÉCNICAS DE DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO
Os micro-organismos estão amplamente distribuídos em nosso ambiente: no
ar, no solo, nas águas, nas superfícies externas e internas do organismo humano, dos
animais e vegetais. Assim sendo, o estudo sistemático de um micro-organismo,
procedimentos médicos (como uma cirurgia), a preparação e preservação de
alimentos, e muitas outras situações requerem métodos que permitam a destruição ou
a remoção dos micro-organismos indesejáveis.
1. Controle de micro-organismos
Os micro-organismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes
físicos ou químicos através de uma grande variedade de técnicas cada uma com seu
mecanismo de ação e tendo seu limite próprio de aplicação prática. Entretanto, antes
de discutir tais processos, convém compreender alguns termos empregados para
conceituar os agentes físicos e químicos destinados ao controle dos micro-
organismos.
a) Assepsia: é o conjunto de processos utilizados para impedir a penetração de
micro-organismos em local que não os contenha.
b) Esterilização: é o processo de destruição de todas as formas de vida
microscópica, ou seja, destruição de todos os micro-organismos presentes em um
determinado material. É obtida pela utilização de agentes físicos, agentes químicos e,
no caso de líquidos termolábeis, pelo processo da filtração. Um objeto é considerado
esterilizado quando a probabilidade de se detectar um micro-organismo vivo, após a
esterilização deste material, é infinitamente pequena, ou seja, menor do que um para
um milhão.
c) Desinfecção: é o processo de destruição dos agentes infecciosos, através de
um desinfetante definido como um agente, geralmente químico, que mata as formas
vegetativas, mas não as formas esporuladas, de micro-organismos patogênicos. O
termo é utilizado para as substâncias aplicadas em objetos inanimados.
d) Antissepsia: é o processo em que um antisséptico é aplicado em tecidos vivos
(pele, mucosas). Antisséptico é uma substância química que se opõe à "sépsis" ou
previne o crescimento ou ação de micro-organismos pela destruição dos mesmos ou
pela inibição de seu crescimento ou atividade. Um exemplo é a antissepsia da pele
com álcool 70%.
e) Degermação: é a redução do número de micro-organismos da pele pelo uso
de sabão e escovação ou aplicação de sabão ou solução contendo antisséptico.
f) Bactericida: é um agente que mata as bactérias. Os termos fungicida, virucida
e esporicida se referem aos agentes que matam respectivamente, fungos, vírus e
esporos.
g) Bacteriostase: é uma condição na qual se previne o crescimento de bactérias
(adjetivo: bacteriostático). De maneira semelhante, fungistático descreve o agente que
inibe o desenvolvimento dos fungos. Aqueles agentes que tem, em comum, a
capacidade de inibir o crescimento de micro-organismos, são designados,
coletivamente como agentes microbiostáticos.
h) Agente antimicrobiano: é aquele que interfere com o crescimento ou
atividade dos micro-organismos. Na linguagem comum, o termo significa inibição do
crescimento e, de acordo com os tipos de micro-organismos sobre os quais agem,
recebem a designação de antibacterianos ou antifúngicos.
2. Esterilização e desinfecção em laboratório de microbiologia
Agentes Físicos: Os processos físicos são geralmente empregados para a
esterilização de vidraria, materiais em geral, meios de cultura e soluções. Os mais
comuns são o calor seco, calor úmido e filtração.
a) Calor Seco. Destrói os micro-organismos por oxidação de seus constituintes
químicos. A esterilização pelo calor seco é realizada em estufas especiais
denominadas de Forno Pasteur. O Forno de Pasteur é uma estufa elétrica e consiste
de uma câmara dotada de um elemento aquecedor elétrico (resistência) que aquece a
câmara e seu conteúdo. Além disso, existe um ventilador, um termostato que regula a
temperatura desejada, e um orifício na parte superior que permite a colocação de um
termômetro. Promove o aquecimento rápido, controlado e uniforme da câmara. Os
artigos nela colocados são aquecidos por irradiação do calor, das paredes laterais e
da base, cuja distribuição deve ser a mais uniforme possível. Sendo o calor seco
menos penetrante do que o úmido, o processo requer temperaturas mais elevadas e
tempo de exposição mais prolongado, geralmente em torno de 140 e 180°C durante 1
a 3 horas. Este é o processo indicado para esterilizar vidraria, instrumento de corte ou
de ponta, passíveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais impermeáveis como
ceras, pomadas e óleos. Os materiais são efetivamente esterilizados quando tratados
por uma das várias combinações de temperatura-tempo de eficácia comprovada
(Quadro 1).
Temperatura (°C) Tempo (horas)
121 12
160* 02*170 01
Quadro 1 - Combinações de tempo e temperatura para esterilização em Forno
Pasteur. * Mais utilizado.
- Operação: (a) ligar o forno e ajustar a temperatura para 160°C com auxílio do botão
do termostato e do termômetro graduado; esperar aquecer; (b) após o forno atingir a
temperatura de 160°C, utilizando luvas de amianto, abrir a porta do forno e colocar o
material limpo, seco e devidamente acondicionado no interior do forno, de forma
adequada para permitir a circulação do ar quente no interior da câmara. Alguns tipos
de forno são dotados de ventilador interno para uniformizar a circulação do ar; (c)
fechar a porta do forno e aguardar a temperatura subir e estabilizar em 160°C. A partir
desse momento, marcar o tempo de esterilização (1 a 3 horas). Nunca abrir a porta do
forno durante o ciclo de esterilização; (d) desligar o forno e deixar esfriar naturalmente,
com a porta fechada; (e) com auxílio de luvas de amianto de cano longo, abrir a porta
do forno para a retirada do material quando o termômetro acusar temperatura de 60 a
80°C.
b) Flambagem. Constitui um processo no qual os instrumentos são expostos à chama
do bico de Bunsen até se tornarem rubros. Geralmente é utilizada para a esterilização
de alças e agulhas de semeadura.
c) Calor Úmido. Representa o processo mais prático e seguro para fins de
esterilização. O calor úmido, sob a forma de vapor d’água saturado sob pressão, é o
mais prático e eficiente agente de esterilização, proporcionando temperaturas mais
elevadas que as obtidas por ebulição, e assim os micro-organismos são destruídos
pela coagulação de suas proteínas. Este processo é empregado principalmente para a
descontaminação de materiais (para descarte ou reutilização) e esterilização de
soluções, meios de cultura, vidrarias em geral e outros materiais termorresistentes e
que não sejam afetados pela umidade. O equipamento que produz estas condições é
chamado de autoclave. O funcionamento da autoclave é baseado no princípio da
marmita de Papin, em que a água aquecida em recipiente fechado onde o vapor fica
retido sobre pressão, pode atingir temperaturas superiores a 100°C, sem ferver. A
autoclave de Chamberland é um recipiente (caldeira) cilíndrico metálico horizontal ou
vertical, de parede resistente, fechada na parte superior com uma tampa pesada,
preferencialmente de bronze, a qual é parafusada ou apertada sob uma vedação
(guarnição) de borracha e parafusos (manipuladores) de fixação. A tampa veda
perfeitamente. Compõem ainda o equipamento um manômetro e uma válvula de
segurança onde se pode fazer o ajuste de pressão e temperatura correspondente. No
interior da caldeira existe um suporte (cruzeta) sobre a qual se coloca uma cesta
metálica de superfície perfurada (para permitir a passagem do vapor), contendo o
material a ser esterilizado. Entre a cruzeta e o fundo da autoclave existe um espaço
onde estão localizadas resistências elétricas protegidas por material isolantes. Neste
espaço é colocada a água que será aquecida. A água, de preferência destilada, é
aquecida dentro do cilindro pelo emprego de resistências elétricas de imersão. O nível
da água de dentro do cilindro deve ser examinado a cada operação e deve sempre
estar acima das resistências. O cilindro da autoclave é provido de uma saída lateral
com válvulas, que serve para esgotar a água, quando necessário efetuar eventuais
limpezas. 
- Operação: (a) abrir a tampa da autoclave e colocar água na caldeira até quase atingir
a cruzeta (um dedo abaixo); (b) introduzir o cesto metálico contendo o material a ser
esterilizado; (c) fechar a tampa, apertando por igual os manipuladores; (d) ligar o
aparelho na rede elétrica e ligar a chave no máximo da intensidade; (e) abrir o registro
do orifício do escapamento (deixar aberta a torneira de remoção de ar ou vapor para
remover todo o ar); a princípio, há expulsão do ar contido na caldeira. Quando a água
começa a ferver, sai um jato intermitente de ar misturado com vapor de água. Quando
todo o ar residual é expulso do aparelho, começa a sair um jato contínuo de vapor de
água. Deixe que o fluxo de vapor fluente persista por cerca de 5 minutos; (f) fechar o
registro do orifício de escapamento. O manômetro começa a acusar o aumento de
pressão; (g) ao atingir a temperatura de 121°C (1 atmosfera de pressão), diminuir a
intensidade de calor girando a chave elétrica para a posição média ou mínima, de
forma que a pressão permaneça estável; (h) quando a temperatura requerida para a
esterilização é alcançada, conta-se o tempo (15 a 20 minutos) usando um relógio de
laboratório (com alarme); (i) desligar a chave elétrica girando-a para a posição
desligado; (j) manter a autoclave e a torneira de ar e vapor fechada e aguardar que a
pressão retome a zero atmosfera, pois quando a pressão da autoclave é aliviada
rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e frascos fervem violentamente, fazendo
com que os tampões sejam arremessados para fora dos mesmos; (k) abrir o registro
do orifício de escapamento para equalizar a pressão da autoclave com a do ambiente;
(l) com auxílio de luvas de amianto, de cano longo, afrouxar os manipuladores; (m)
abrir a tampa da autoclave com cuidado. Proteger o rosto contra a projeção de vapor;
(n) retirar o cesto com o material esterilizado. Obs: Para regular a válvula de
segurança, deslocar o contra-peso para frente ou para trás, de maneira a estabilizar a
pressão desejada, observando-se o limite de até 1,5 atmosferas. A água da caldeira
após a esterilização de material contaminado deve ser drenada através da válvula de
drenagem.
d) Filtração. A esterilização de gases ou de líquidos pode ser efetuada por meio de
filtração, através de materiais capazes de reter micro-organismos. Como exemplo de
filtração de gases temos o tampão de algodão utilizado para fechar as bocas dos
tubos de ensaio e balões contendo meios de cultura. O algodão é suficientemente
poroso para permitir a entrada do ar, porém impede a penetração de micro-
organismos. Para a esterilização de líquidos existem vários filtros bacteriológicos
fabricados com diferentes materiais: (a) terra de diatomáceas, no filtro Berkefeld; (b)
porcelana, no filtro de Chamberland; (c) placa de asbesto, no filtro Seitz (discos
filtrantes); (d) membranas de ésteres de celulose (filtrantes), na membrana Millipore e
Sartorius e outros, sendo os dois últimos mais usados (c e d). Os discos Seitz são
discos de amianto, extremamente absorventes, que retém os micro-organismos
principalmente por diferenças de cargas elétricas. As membranas filtrantes são
constituídas de ésteres de celulose e contém milhões de poros microscópicos com
diâmetros uniformes variando de 0,01 a 14µm. Essas membranas retêm, em sua
superfície, todas as partículas que excedem ao tamanho dos seus poros. Na prática
bacteriológica, geralmente são utilizadas membranas com poros de 0,45 a 0,22µm. No
processo de filtração, como os discos e membranas filtrantes, são empregados
principalmente para a esterilização de soluções que contenham substâncias
termolábeis, como por exemplo: soro, plasma, açúcares, antibióticos, vitaminas que
são adicionadas assepticamente em meios de cultivo. Para acomodar o filtro ou
membrana filtrante geralmente utiliza-se um suporte especialmente confeccionado
para tal fim (aço inoxidável, plástico, vidro e outros materiais), que por sua vez é
adaptado a um recipiente para receber o filtrado. O conjunto (equipo para filtração) é
acondicionado em papel e esterilizado. Para a filtração de soluções, em discos ou
membranas, é necessário forçar o líquido através do filtro, aplicando uma pressão
negativa ao frasco de filtração, por meio de uma bomba de vácuo ou de uma trompa
de água, ou impondouma pressão positiva acima do líquido de filtração.
Normalmente, o disco Seitz é acoplado a um suporte que por sua vez é adaptado a
um frasco de kitassato, sendo que este conjunto acondicionado é esterilizado em
autoclave. As membranas filtrantes podem ser montadas em suportes de diferentes
tamanhos, que variam de acordo com o diâmetro da membrana. Para a filtração de um
pequeno volume de líquido, o suporte previamente esterilizado e com membrana é
adaptado a uma seringa, sendo que o líquido filtrado é coletado em frasco estéril. Para
grandes volumes são mais usados os filtros Seitz. O controle de esterilidade da
solução filtrada é feito através de semeadura em meios de cultura na forma líquida. A
ausência de turvação do meio de cultivo, após incubação a 37°C por 24 a 48 horas,
comprova a eficácia do processo de esterilização.
- Operação: Retirar o invólucro de papel que envolve o equipo de filtração e verter
sobre o compartimento onde se encontra o filtro, a solução a ser esterilizada. Para
acelerar o processo de filtração aplica-se uma pressão negativa (bomba de vácuo)
para grandes volumes ou pressão positiva (seringa) para pequenos volumes.
Outros agentes físicos empregados na esterilização e desinfecção:
CALOR SECO: Incineração.
CALOR ÚMIDO: Pasteurização, água fervente ou vapor fluente (contínuo ou
fracionado).
RADIAÇÕES: de feixe eletrônico (raios catódicos); ionizantes (raios gamas e raios-X);
não ionizantes (ultravioleta); acústica (vibrações sônicas e ultrassônicas).
4. Testes de esterilidade: Mesmo utilizando-se de processos eficazes para a
esterilização de diferentes materiais, nem sempre as condições são ideais, podendo
haver eventuais falhas de ordem técnica, tais como temperatura, pressão e tempo
inadequados, comprometendo o processo de esterilização. Portanto, é de fundamental
importância que sejam realizados testes de esterilidade para verificar se os materiais
foram efetivamente esterilizados. 
Podem ser empregados no controle de esterilidade, indicadores químicos e
biológicos que permitem verificar se os artigos atingiram, no interior da câmara ou dos
pacotes, uma temperatura compatível com a esterilização.
4.1 Testes Químicos: Utilizam-se substâncias que apresentam-se alteradas quando
submetidas a determinadas temperaturas.
Fita indicadora: fixar, sobre a superfície dos objetos a serem esterilizados, um
pedaço de aproximadamente 3 a 5 cm da fita indicadora. Observar que a fita possui
cor creme uniforme. Após a esterilização verificar se a fita apresenta faixas pretas
paralelas, indicando que a temperatura do processo de esterilização atingiu 121°C. 
4.2 Testes Biológicos: São utilizados suspensões de esporos de Geobacillus
stearothermophilus para o calor úmido (autoclave de Chamberland) e Bacillus
atrophaeus para calor seco (forno de Pasteur) ou para autoclave à óxido de etileno,
que deverão ser destruídos pela exposição a cada um dos processos a que estão
relacionados. Este bioindicador consiste em uma ampola com caldo nutriente,
contendo açúcar e um indicador de pH, e esporos da bactéria Geobacillus
stearothermophilus ATCC 7953. A resistência térmica destes esporos é tal que o
micro-organismo não sobrevive após autoclavação a 121°C durante 15 minutos. Em
temperatura ou tempos de exposição menores, os esporos sobrevivem. As ampolas
são colocadas junto com o material a ser esterilizado. Após a autoclavação, a eficácia
do processo de esterilização é verificada pela incubação das ampolas para
evidenciação da germinação dos esporos. A ausência de crescimento indica
esterilização adequada. Neste caso, o bioindicador apresenta coloração violeta. Se a
esterilização for inadequada, os esporos da bactéria sobrevivem ao tratamento térmico
e germinam. O conteúdo da ampola apresentará coloração amarela dentro de 24
horas, devido à formação de ácidos decorrentes da fermentação do açúcar e também
apresenta turbidez devido ao crescimento bacteriano. 
Técnica: Colocar em um béquer de 100 mL de capacidade a ampola teste, juntamente
com o material a ser esterilizado na autoclave. Em paralelo, deixar outra ampola do
bioindicador à temperatura ambiente (controle positivo). Após a esterilização, retirar a
ampola teste da autoclave e incubá-la, juntamente com o controle positivo, em banho-
maria a 56-60°C durante 24 a 48 horas. Os resultados podem ser analisados
observando o Quadro 2.
Ampola(s) Teste(s)
Ampola Controle Positivo Processo de esterilização
Amarela e turva Amarela e turva Inadequado
Violeta e límpido Amarela e turva Adequado
Violeta e límpido Violeta e límpido Bioindicador inativo;
substituí-lo
Quadro 2: Interpretação do controle de esterilização na autoclave de Chamberland
pelo emprego de bioindicadores (G. stearothermophilus).
ANOTAÇÕES
TESTES DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Os testes de sensibilidade de determinado micro-organismo aos agentes
antimicrobianos são usados para orientar a seleção do agente mais adequado ao
tratamento da infecção por ele causada, quando - mesmo sendo conhecida sua
identidade - sua sensibilidade ou resistência não possa ser definida com segurança a
partir dos dados disponíveis.
Este conceito é aplicado principalmente para os bacilos gram-negativos
fermentadores e não fermentadores da glicose e Staphylococcus aureus, que são
bactérias que apresentam resistência a um grande número de antimicrobianos.
A realização do teste de sensibilidade é raramente necessária quando a
infecção é causada por micro-organismo comumente sensível a antimicrobiano
altamente efetivo, como por exemplo, para Streptococcus pyogenes em relação à
benzilpenicilina.
No entanto, estas situações devem ser revistas, pois existem relatos de cepas
produtoras de beta-lactamases entre Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae
e Streptococcus pneumoniae tornando, nestes casos, necessária a realização de
testes de sensibilidade.
Também há necessidade de que os laboratórios aperfeiçoem, continuamente,
as técnicas e os critérios utilizados para a avaliação da sensibilidade dos micro-
organismos responsáveis por doenças humanas aos agentes antimicrobianos, tendo
em vista que novos agentes antimicrobianos estão sendo produzidos ao mesmo tempo
em que muitas espécies bacterianas deixam de ser sensíveis.
1. Indicações para a Realização do Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos
- Servir de guia na escolha da terapia racional;
- Contribuir para uma garantia da eficácia quimioterápica;
- Para micro-organismos que costumam apresentar resistência a agentes
antimicrobianos;
- Nos estudos destinados à avaliação da atividade do espectro de ação de novos
agentes antimicrobianos;
- Como marcadores epidemiológicos:
. detectar e rastrear surtos de infecção;
. localizar amostras resistentes na comunidade.
2 Métodos
A escolha do método mais adequado para o teste de sensibilidade aos
antimicrobianos depende do equipamento de que dispõe o laboratório, do número e
dos tipos de micro-organismos e antimicrobianos a serem estudados e da finalidade a
que se propõe a realização do teste.
O método mais amplamente utilizado é o teste de disco-difusão em ágar em
função da facilidade técnica e da obtenção de resultados razoavelmente exatos e
precisos.
Este método foi proposto por Bauer e Kirby em 1966, sendo aplicável a micro-
organismos que tenham crescimento rápido. Uma das imperfeições desse método é
ser um teste qualitativo e não quantitativo, o que permite classificar os micro-
organismos em sensíveis, intermediários e resistentes. Não é aplicável a muitos micro-
organismos de crescimento lento e a anaeróbios. E também não é adequado para a
avaliação da sensibilidade às polimixinas, que se difundem pouco no ágar.
Nesta técnica,discos de papel de filtro são impregnados com os agentes
antimicrobianos em concentrações conhecidas e padronizadas; os discos são, então,
aplicados nas placas de ágar já inoculadas com o micro-organismo cuja sensibilidade
aos antimicrobianos se pretende conhecer.
Quando o disco é aplicado na superfície inoculada do meio, o mesmo absorve
água e ocorre a difusão do antimicrobiano no meio de cultura (Figura 1).
Figura 1: Difusão do antimicrobiano no meio de cultura na técnica de disco-difusão.
Após a inoculação do micro-organismo no meio de cultura, inicia-se a fase de
crescimento logarítmico. Nesse momento, a multiplicação bacteriana é mais rápida
que a difusão da droga no ágar e as células bacterianas não inibidas pelo
antimicrobiano continuam a se multiplicar.
Não aparece nenhum crescimento na área onde a droga está presente em
concentrações inibitórias. Quanto mais sensível a bactéria, maior será a zona de
inibição. Micro-organismos de crescimento lento aparecerão como mais sensíveis ao
antimicrobiano, pois este tem mais tempo para difundir-se no ágar.
O tamanho da zona de inibição também depende da velocidade de difusão dos
antimicrobianos através do ágar. Diferentes drogas se difundem em diferentes
velocidades. Consequentemente, a zona de inibição observada com uma droga não
pode ser comparada com a de outro antimicrobiano. O diâmetro da zona de inibição é
inversamente proporcional à Concentração Inibitória Mínima (CIM), determinada por
um método quantitativo.
Existem outros testes que utilizam o método da difusão em ágar. O Etest e o
M.I.C.E. são testes de difusão que fornecem resultados quantitativos. Fitas
impregnadas com antimicrobiano em concentrações decrescentes são aplicadas sobre
placas contendo agar Mueller Hinton semeadas com a bactéria a ser testada.
O método de diluição em caldo pode fornecer dados quantitativos da atividade
antimicrobiana e determinar a CIM, sendo útil para a confirmação da sensibilidade
intermediária ou equívoca evidenciada pelo teste de difusão. Também é indicado para
testar a sensibilidade de bactérias anaeróbias e para analisar a existência de
sinergismo ou antagonismo entre antimicrobianos. Este método apresenta as
seguintes desvantagens: não apresenta a flexibilidade dos testes de difusão; oferece
dificuldade para a detecção de contaminantes e de mutantes resistentes no inóculo.
Sistemas rápidos automatizados de teste de sensibilidade utilizam o método de
microdiluição em caldo e fornecem leituras em 3 a 6 horas. O fundamento desses
sistemas é a detecção do crescimento bacteriano em presença ou ausência de
antimicrobianos, medindo as mudanças da densidade óptica ou da impedância
elétrica, ou fazendo a contagem direta das bactérias.
2.1 Teste de sensibilidade por difusão em ágar (Bauer et al., 1966)
2.1.1 Meio de cultura utilizado
O meio de Mueller Hinton Agar (MHA) é considerado o meio de escolha pois
apresenta:
- boa reprodutividade e sensibilidade de lote para lote;
- baixa quantidade de inibidores às sulfonamidas, trimetoprima e tetraciclinas;
- crescimento da maioria dos patógenos.
Para bactérias de crescimento lento (fastidiosas), como Haemophilus
influenzae, Neisseria gonorrhoeae e Streptococcus pneumoniae, o agar Mueller
Hinton deve ser suplementado da seguinte maneira:
H. influenzae
O MHA deve ser acrescido de sangue de carneiro (5%), isovitalex (1%) e
após, achocolatado.
N. gonorrhoeae
MHA acrescido de sangue de carneiro (5%) e após, achocolatado.
S. pneumoniae
MHA acrescido de sangue de carneiro (5%).
2.1.2 Preparo do MHA
- Preparar o MHA desidratado de acordo com a recomendação do fabricante;
- Acertar o pH para 7,2 -7,4, se necessário;
- Imediatamente após a autoclavação, esfriar a 45 - 50ºC em água fria;
- Distribuir em placas de Petri, sendo que a espessura deverá ser de
aproximadamente 4 mm (60 a 70 mL em placas de 14 cm de diâmetro interno; 25 a
30 mL em placas de 9 cm de diâmetro interno);
- Estocar no refrigerador a 2-8ºC, embrulhadas em plástico para minimizar a
evaporação, por até 7 dias;
- Não devem existir gotas de água na superfície das placas. Colocar em estufa por 10
a 20 minutos para retirar o excesso de umidade.
2.1.3 Semeadura nas placas
- Selecionar 4 - 5 colônias isoladas do mesmo tipo morfológico;
- Tocar as colônias selecionadas com agulha e transferir para 4,5 mL de MHB (Mueller
Hinton Broth);
- Incubar a 35 - 37ºC por 2 - 6 horas até o aparecimento de turvação discreta;
- Padronizar o inóculo para 0,5 (1,5 X 108 UFC/mL) da escala de McFarland
comparando com uma solução de BaS04 (0,5 mL de BaCl2 0,048 M + 99,5 mL de
H2S04 0,18 M);
- Introduzir swab não tóxico na superfície do MHB padronizado, removendo-se o
excesso do caldo, comprimindo-se o swab contra a parede interna do tubo;
- Semear com o swab, em ângulo de 60º, toda a superfície do ágar na placa até a
obtenção de um inóculo uniforme (inocular, no máximo, após 15 minutos da
padronização);
- Deixar as placas em repouso por mais ou menos 5 minutos para secar;
2.1.4 Seleção dos discos
A escolha adequada dos antimicrobianos para o teste de sensibilidade deve
ser uma decisão em conjunto: do laboratório clínico, farmacologistas, Comissão de
Controle de Infecção Hospitalar e de médicos infectologistas.
O número de antimicrobianos deverá ser limitado para cada grupo de
bactérias, e testar somente um antimicrobiano de cada classe, com exceção de
algumas classes.
2.1.5 Estocagem dos discos
- Manter refrigerado a 4 - 8º C os discos em uso;
- Guardar em freezer (não Frost freezer) a - 14º C os discos em estoque;
- Retirar os discos do refrigerador uma a duas horas antes do uso, para adquirir a
temperatura ambiente;
- Verificar a data de validade dos discos;
- Os discos de penicilina, que são sensíveis a umidade, deverão ser mantidos no
dessecador e em geladeira.
2.1.6 Aplicação dos discos
- Aplicar os discos, com leve pressão, usando-se pinça estéril ou dispensadores
mecânicos;
- Os discos devem estar situados de forma que fiquem a uma distância de 2 a 3 cm
um do outro;
- Colocar os discos que contenham antimicrobiano que difundem menos no centro da
placa;
- Depois de 15 minutos de aplicação dos discos, as placas são invertidas e
incubadas.
2.1.7 Incubação
- As placas devem ser incubadas a 30 - 35ºC por 18 - 24 horas;
- Para teste de sensibilidade de S. aureus, as placas devem ser incubadas a 30ºC,
pois muitas cepas resistentes à oxacilina crescem em temperatura mais baixas;
- A incubação em atmosfera de CO2 deve ser evitada, pois pode alterar o pH da
superfície e, como consequência, a atividade de alguns antimicrobianos;
- Nos testes de sensibilidade para Neisseria sp e H. influenzae, as placas devem ser
incubadas em tensão de 5 a 7% de CO2 (jarra com vela);
- Antibiograma de bactérias não fermentadoras da glicose também deve ser incubado
a 30ºC, pois muitas espécies não crescem à temperatura de 37ºC.
2.1.8 Leitura e Interpretação
- A leitura deve ser feita após 18 a 24 horas de incubação;
- Os diâmetros dos halos de inibição do crescimento devem ser medidos com régua
ou paquímetro e reportados em mm;
- Pode ocorrer a formação de mais de um halo nos seguintes casos:
 Proteus: ocorre a formação de um véu (swarming). Deve ser lido o halo externo.
 Sulfas: ler o halo com borda de crescimento mais denso.
 H. influenzae: ler halo interno (beta lactamase com penicilina ou ampicilina).
 Bactérias que produzem hemólise: ler o halo de inibição do crescimento e não o
halo de hemólise.
- Reportar os resultados como Sensível, Intermediário ou Resistente, conforme tabela.
- Para S. pneumoniae, testar a oxacilina 1ug e reportar o resultado como penicilina;
Cepas suscetíveis à penicilina apresentarão zonas de inibição maior ou igual a 20
mme as cepas resistentes ou relativamente resistentes terão zonas menores ou
iguais a 19 mm. O teste da oxacilina pesquisa a resistência intrínseca aos beta-
lactâmicos. Relaciona-se principalmente com o mecanismo de ação das proteínas
ligadas à penicilina (PBPs- Penicillin Binding Proteins), e sua maior ou menor
afinidade aos beta-lactâmicos.
2.1.9 Fontes de erros comuns do antibiograma por difusão
- Não utilização do meio Mueller Hinton;
- pH do meio de cultura não ajustado;
- Prazo de validade ultrapassado para os discos e meio de cultura;
- Armazenamento inadequado dos discos;
- Padronização inadequada da suspensão;
- Não eliminação do excesso de caldo do swab;
- Demora excessiva entre a padronização da cultura e o inóculo no meio de cultura;
- Demora na colocação dos discos após a semeadura;
- Demora na incubação das placas após a colocação dos discos.
2.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A CIM representa a menor concentração de antimicrobiano que produz uma
inibição completa do crescimento de um micro-organismo sendo expressa em mg/mL,
UI/mL ou umol/mL.
O método utilizado é o da diluição (macro ou microdiluição) que permite a
quantificação da concentração mínima do agente antimicrobiano necessário para
impedir a replicação bacteriana (bacteriostático) ou inviabilizar a bactéria presente
(bactericida).
O princípio do método baseia-se na diluição sucessiva do antimicrobiano em
meios líquidos ou sólidos e a inoculação da bactéria.
2.2.1 Aplicações Clínicas
- Para pacientes imunossuprimidos;
- Nas endocardites bacterianas subagudas;
- Suspeita de micro-organismo resistente (penicilina, cefalosporina);
- Quando o resultado da difusão em ágar apresenta padrão de intermediário ou
resistente;
- Quando a terapia é por aminoglicosídeos (dose terapêutica é semelhante à dose
tóxica);
- Pacientes com função renal comprometida;
- Para teste de sensibilidade de anaeróbios.
2.2.2 Meio de cultura utilizado
É utilizado o Mueller Hinton Broth (MHB) para as bactérias aeróbias e
anaeróbias facultativas, pois estas têm crescimento rápido.
Para micro-organismos mais exigentes, como os estreptococos, deve ser
usado o Tryptic Soy Broth (TSB) e para Pseudomonas aeruginosa é usado o MHB
suplementado com íons magnésio e cálcio.
2.2.3 Procedimento
- Pode ser usado a microtécnica ou macrotécnica.
- Preparar um inóculo correspondente a 0,5 da escala de Mac Farland.
- Preparar uma sequência de 9 tubos, sendo que no primeiro tubo coloca-se 2mL de
MHB e nos 8 tubos seguintes coloca-se 1 mL de MHB em cada.
- No primeiro tubo, a concentração do antimicrobiano deverá ser de 128 ug/mL. A
exceção é para a carbenicilina e cefalosporina, quando testamos P. aeruginosa,
onde a concentração deverá ser de 256 ug /mL.
- Fazer diluições seriadas do meio contendo o antimicrobiano até o oitavo tubo. 
- O nono tubo deve conter apenas MHB, sendo este o controle de crescimento.
- Transferir assepticamente 1 mL do inóculo para cada tubo.
- Incubar a 35 ºC por 18 horas.
- Verificar a menor concentração de antimicrobiano onde não houve crescimento
bacteriano. Este será o valor da CIM.
TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE
MICRO-ORGANISMOS
1. Considerações gerais sobre cultura pura
Um pré-requisito para a caracterização de uma espécie microbiana no laboratório
de microbiologia é que ela esteja disponível para estudo como uma cultura pura. O
termo cultura pura quer dizer que todas as células da cultura têm uma origem comum,
isto é, são descendentes da mesma célula. É possível obter uma cultura pura através
da transferência de uma célula para um meio de cultura adequado, através do uso de
micromanipulador acoplado a um microscópio. Entretanto, na prática microbiológica são
empregados métodos indiretos para a obtenção de culturas puras, baseados em
técnicas de isolamento de colônias, como por exemplo: (1) Técnicas de esgotamento
por estrias contínuas ou descontínuas na superfície de um meio de cultura; (2) Diluição
e semeadura pela técnica de "pour plate"; (3) semeadura na superfície de um meio de
cultura com auxílio da alça de Drigalsky. Em termos práticos, considera-se que a
população microbiana de uma colônia é proveniente de uma única célula e, portanto,
representa uma cultura pura. Na realidade, neste caso, o termo cultura axênica pode
ser mais apropriado do que cultura pura, porque cultura axênica significa o crescimento
de um micro-organismo em um ambiente livre de outros organismos. Essencialmente, o
termo cultura pura implica em pureza genética enquanto que cultura axênica não. A
maioria dos trabalhos práticos no laboratório de microbiologia é realizada a partir de culturas
puras, isto é, populações microbianas provenientes de uma única célula. Cabe ao
bacteriologista então, usar técnicas adequadas a fim de isolar um determinado micro-
organismo em cultura pura a partir de materiais que contém uma microbiota mista de micro-
organismos, como por exemplo: amostras de materiais biológicos, alimentos, água, solo e
outros, considerando-se a especialidade da rotina mantida pelo laboratório.
2. Formação e crescimento de colônias
Quando uma bactéria isolada se reproduz dentro de um meio solidificado ou na
sua superfície, sua progênie vai se acumulando na forma de uma massa de células
conhecida como colônia, visível macroscopicamente. Inicialmente o crescimento da
colônia é exponencial em relação ao tempo. Após algumas divisões, entretanto, a
ordem de crescimento se torna mais complexa devido à grande proximidade das células
acumuladas. Esta proximidade cria uma situação, que pode ser chamada de
“aglomeração fisiológica”, na qual as células individuais competem entre si pelos
nutrientes disponíveis e afetam-se mutuamente pelo acúmulo localizado de produtos
residuais. Como os nutrientes precisam se difundir do meio circundante para as células,
enquanto os produtos residuais do metabolismo devem se difundir das células para o
ambiente, os membros individuais das colônias ficam sujeitos a uma variedade de
condições ambientais, segundo sua localização dentro da colônia. O crescimento de
colônias bacterianas é afetado, não só pelas interações celulares dentro de cada colônia,
mas também por interações com colônias vizinhas. Se as colônias estiverem muito
próximas, elas interferem com o crescimento uma das outras pela depleção de
nutrientes do meio ou pela excreção de produtos residuais tóxicos. O fenômeno é
comumente observado em “placas semeadas por estrias” em ágar nutriente, para
isolamento de bactérias. Nestas placas, as colônias que estão juntas são pequenas,
enquanto aquelas que se encontram bem isoladas atingem tamanhos maiores.
3. Manutenção e estoque de culturas puras
Após a obtenção das culturas puras, faz-se necessário em alguns casos, o seu
estoque em laboratório, para estudos posteriores. É essencial que o método de conservação
e manutenção preserve todas as características da espécie, tais como foram evidenciadas
no momento do seu isolamento. No laboratório, dispõem-se das seguintes técnicas para a
estocagem de culturas puras:
a) Transferência periódica para meios de culturas novos (recém preparados);
b) Conservação das culturas sob camada de óleo mineral;
c) Conservação das culturas pela dessecação rápida em estado congelado (Liofiliza-
ção);
d) Estocagem em temperaturas muito baixas como, por exemplo: freezer (-70°C) e
em nitrogênio líquido (-196°C).
Existem organizações que mantêm em estoque culturas puras de amostras tipos
(padrões internacionais) de bactérias, fungos, vírus, algas, protozoários, bem como de
células animais. Algumas dessas organizações são: (1) American Type Culture Collection
(ATCC) em Rockville - Maryland; (2) Instituto Pasteur de Paris; (3) National Collection of
Type Culture(NCTC) em Londres; (4) Japanese Type Culture Collection em Nagao Tóquio.
Culturas puras de amostras padrões podem ser solicitadas a estas organizações, para uso
em trabalhos de pesquisa, de controle de qualidade da rotina microbiológica e etc.
Usualmente, estas amostras são remetidas em ampolas (liofilizadas), mediante a compra
e/ou doação.
4. Uso correto dos materiais em microbiologia
a. Pipeta: As pipetas utilizadas em microbiologia são preparadas previamente embrulhadas
em papel kraft e esterilizadas. Para uso, torcer o papel na região central da pipeta, retirar
primeiramente o papel da parte superior e depois a inferior (correspondente a ponta da
pipeta). Esta sequência evita que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador.
Uma vez usada a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro contendo desin-
fetante. OBS.: as pipetas não devem ser flambadas.
b. Alça e agulha bacteriológica: Toda vez que se fizer uma semeadura siga as regras
abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura pelos microrganis-
mos presentes no meio ambiente. A alça/agulha bacteriológica deve ser flambada antes e
depois de qualquer operação de semeadura até ficar incandescente. Para tanto, deve
ser passada na chama e a posição correta para a flambagem da alça/agulha é que a
mesma faça um ângulo de 45°C em relação ao bico de Bunsen. Deve ser utilizado o cone
interno da chama do bico de Bunsen. A seguir, para retirar o material a ser manipulado,
esfriar previamente a alça/agulha na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da
placa de Petri. Após o uso, passar a alça/agulha no álcool e areia e posteriormente
flambá-la. A alça calibrada não deve ser passada no álcool e areia.
5. Semeadura de micro-organismos
a. Pelo método de espalhamento em placa – semeadura em superfície (“spread
plate”): Alíquota (normalmente de 0,1 a 1 mL) de amostra direta ou diluída é inoculada
na placa contendo meio de cultura e depois se espalha essa amostra com a alça de dri-
galski, previamente esterilizada (forno, por 2 horas a 180°C, ou em autoclave, a 121°C
por 30 minutos) ou ainda pode-se fazer uma esterilização imediata mergulhando a alça
em álcool absoluto e em seguida passando na chama – flambar (3 vezes consecutivas).
b. Pelo método de espalhamento em placa – semeadura em superfície e profundidade
(“pour plate”): Alíquota de uma amostra é inoculada em um tubo contendo ágar nutrien-
te liquefeito e homogeneizado. Em seguida é vertido para uma placa de Petri e incubado
ou é colocado uma alíquota da amostra direto na placa de Petri e posteriormente é colo-
cado o meio de cultura, homogeneizado e incubado.
c. Em placa - na superfície do ágar, para o isolamento de colônias, utilizando alça mi-
crobiológica: As placas de Petri deverão ser abertas próximas ao bico de Bunsen para
evitar contaminação com microrganismos do ar. Uma vez semeadas, as placas devem
ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. A técnica de semeadura para
isolamento de colônias pode ser:
Técnicas de esgotamento por
estrias contínuas na superfície do
ágar:
Técnicas de esgotamento por estrias
descontínuas na superfície do ágar
(4 estrias):
d. Em tubos (meio sólido) pelo método de estrias superficiais (ágar inclinado): Toda
vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos
mesmos imediatamente à retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido segu-
ro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a agulha. Semear o material por estrias
descontínuas na superficie do ágar. Após a semeadura, a agulha deve ser passada no al-
cool e areia e em seguida flambada.
e. Em tubos (meio sólido) pelo método de picada profunda: Semear o material por pica-
da profunda e, todo o ágar. Após a semeadura, a agulha deve ser passada no alcool e
areia e em seguida flambada.
f. Em tubos (meio líquido) pelo método de semeadura por dispersão: A semeadura em
tubos contendo meio líquido pode ser feita com a alça bacteriológica, a agulha ou pipeta.
Semear em todo o meio. Após a semeadura, a alça e/ou agulha deve ser passada no al-
cool e areia e em seguida flambada.
1ª 2ª
4ª
3ª
COLORAÇÃO DE GRAM
O método de Gram se baseia no fato de que o complexo formado entre o iodo
(lugol) e a violeta de genciana (complexo iodo-pararosa-anilina) permanece retido
dentro da célula de algumas bactérias mesmo após o tratamento subsequente com o
álcool (agente descorante). Estas bactérias são denominadas gram-positivas. Outras
bactérias chamadas gram-negativas descoram facilmente com o álcool. Entretanto, se
após a ação do álcool, se efetuar uma coloração de fundo utilizando-se a fucsina
básica, as bactérias gram-negativas aparecerão coradas em vermelho, ao passo que
as gram-positivas se apresentarão roxas, isto é, conservarão a cor violeta do
complexo iodo-violeta de genciana.
O mecanismo da coloração de Gram não está ainda bem definido, porém se
relaciona indubitavelmente as diferenças de permeabilidade da parede celular. Nas
bactérias gram-positivas, a parede é constituída essencialmente por peptideoglicano e
o tratamento com álcool resulta em uma desidratação e consequente diminuição da
permeabilidade, o que impede ou dificulta a eluição do complexo iodo-corante. O
mesmo não acontece com as bactérias gram-negativas, onde o solvente orgânico atua
em sentido contrário, determinando aumento da permeabilidade celular.
A coloração de Gram é de elevada importância para a sistemática em
bacteriologia, pois divide as bactérias em dois grandes grupos: GRAM-POSITIVAS e
GRAM-NEGATIVAS, que reagem diferentemente frente a muitos agentes físicos e
químicos.
TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM
- Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto.
- Escorrer o corante e cobrir com lugol por 1 minuto.
- Lavar em água corrente de baixa pressão.
- Descorar com álcool-acetona por 5-10 segundos (tempo delicado).
- Lavar em água corrente de baixa pressão.
- Corar com fucsina básica durante 30 segundos.
- Lavar em água corrente de baixa pressão.
- Deixar secar espontaneamente ao ar.
- Fazer a leitura ao microscópio com objetiva de imersão.
USO DO MICROSCÓPIO
O microscópio é usado para visualizar estruturas ou células pequenas demais
para serem vistas a olho nu. Devido ao fato do microscópio ser um instrumento
delicado e caro, cuidados especiais devem ser tomados no seu uso, limpeza e
armazenamento.
As partes de um microscópio são (Figura 1):
¨ Ajuste grosseiro ou macrométrico: controle que ajusta a posição das objetivas do
microscópio; usado para focar inicialmente a lâmina.
¨ Ajuste fino ou micrométrico: controle que ajusta a posição das objetivas; usado para
o foco preciso do objeto depois de ter sido focado com o macrométrico.
Figura 1: Partes de um microscópio.
¨ Charriot: o controle que ajusta a posição da lâmina.
¨ Condensador: localizado abaixo da platina do microscópio que direciona a luz para
a objetiva se for baixado ou elevado. Baixando o condensador vai haver um
aumento de espécimes não corados.
¨ Diafragma: regula a quantidade de luz que chega ao espécime examinado no
microscópio.
¨ Distância de trabalho: é a distância entre a objetiva e a lâmina quando o objeto está
em foco bem nítido. Quanto maior o aumento, menor a distância. O macrométrico
não deve ser usado quando se usa o maior aumento, para evitar que a objetiva
acidentalmente bata na lâmina e esta seja danificada.
¨ Objetiva: lente de aumento que está mais próxima do objeto a ser examinado no
microscópio. A objetiva pode ser de pequeno aumento (10x ou menos), objetiva de
grande aumento (40x) e a objetiva de imersão a óleo (100x).
¨ Ocular: lente de aumento que está mais próxima do olho do examinador. O
aumento usual é de 10 vezes (10x).
¨ Platina: local onde se coloca a lâmina.
¨ Revolver ou tambor: local onde se inserem as objetivas.