PROVA PRÁTICA MIICRO

Prévia do material em texto

ASSUNTOS:
- Técnicas de semeadura e
isolamento de microrganismos.
- Meios de cultura
- Coloração de GRAM
- Microbiota da mão
- Controle de microrganismos por
agentes físicos e químicos
- Teste de Difusão de Disco –
Antibiograma
- Colheita e identificação de
estreptococos, enterococos e
estafilococos.
- Caracterização de enterobactérias
e coprocultura
- Urocultura
- Infecção do trato respiratório
- Infecções de pele e partes moles +
tsa
Técnicas de semeadura e isolamento de microrganismos
Os materiais utilizados são: Erlenmeyer, ágar, fita de pH e proveta.
O meio é pesado, dissolvido e hidratado. Fundido na temperatura de 85 à 95 C, até
que o meio se torne límpido, deve-se ajustar o pH. Preparar a para autoclave,
tampando o erlenmeyer com uma rolha de gaze e papel kraft. Posteriormente deve-se
esterilizar o meio em 121 °C por 15 min.
ESGOTAMENTO CONFLUÊNCIA
Meios de cultura
Meio Seletivo: são exemplos o Ágar Manitol Salgado e Agar SS, utilizados
para selecionar as espécies que serão isoladas e impedir o crescimento de
germes.Ele contém inibidores, geralmente antibióticos, que tornam inviável o
crescimento de certos microrganismos, sem inibir o crescimento do
microrganismo alvo.
Meio Diferencial: promove uma mudança na coloração das colônias de
bactérias, possibilitando a distinção de vários gêneros e espécies de
microrganismos.
https://www.prolab.com.br/produtos/meios-de-cultura/agar-salt-manitol
ÁGAR SANGUE - diferencial/não
seletivo.
Indicado para microrganismos
fastidiosos e com atividade hemolítica.
ÁGAR CHOCOLATE- Não seletivo
O Ágar Chocolate é indicado para
cultivo de microrganismos fastidiosos.
Sua base é rica em nutrientes,
suplementado
com hemácias de carneiro lisada e
vitaminas do complexo B. Que
proporcionam o crescimento de uma
ampla variedade de microrganismos
MUELLER HINTON - não seletivo e
não diferencial.
Usado para testes de suscetibilidade
aos antimicrobianos
ÁGAR NUTRIENTE - seletivo/
diferencial
ÁGAR Macconkey - fracamente
seletivo/diferencial
Seletivo por permitir somente o
crescimento de Enterobactérias e
BGNNF(bacilos gram negativos não
fermentadores), por conta do cristal
violeta.
Só cresce GRAM -!!!!
Diferencial porque diferencia as
bactérias lac+(colônia rosa) e lac-(
colônias brancas)
Não cresce gram positivo
ÁGAR MANITOL SALGADO- seletivo/
diferencial
Seletivo porque possui altas
concentrações de sal, então é todo tipo
de bactéria que consegue crescer
nesse meio. No caso os Stafilococos.
Diferencial porque consegue
diferenciar Staphylococcus aureus das
demais espécies( o meio fica um
amarelo brilhoso
ÁGAR Salmonella Shigella-
Moderadamente Seletivo/ diferencial
Seletivo porque isola Salmonella spp. e
algumas espécies de Shigella
Diferencial porque As bactérias
fermentadoras formam colônias
vermelhas e as não fermentadoras
formam colônias incolores.
ÁGAR CETRIMIDE- Seletivo e
diferencial
só nasce Pseudomonas aeroginosa
Coloração de GRAM
👀: Devo circular as colônias isoladas e na parte do verso da lâmina com o lápis
dermatográfico eu tenho que identificar minha lâmina (vou passar álcool se for como
a caneta vai sair!!!!)
- Meia gotas de salina
- Alça descartável ou alça normal
- Esfregaço na lâmina (circular)
- Secar na chama
- Marcar o lado oposto esfregaço
Cristal violeta 1 min
COLORAÇÃO:
● Lugol 1 min
● LAVA COM ÁGUA DESTILADA
● Álcool 10 seg
● LAVA COM ÁGUA DESTILADA
● Safranina 30 seg
● SECAR NO AR
Resultados Microscópio:
- ROSA OU VERMELHO: NEGATIVO
- ROXO OU AZUL: POSITIVO
- CACHOS: Staphylococcus
- SEPARADO: Streptococcus
Controle de microrganismos por agentes físicos e químicos/Teste de Difusão de
Disco – Antibiograma
Fazer uma suspensão bacteriana na escala de Mcfarland:
Com a alça pegar colônias com a mesma morfologia, mas não pegue muitas para
evitar de ultrapassar a escala de Mcfaland (isto significa que há aproximadamente 1,5
x 10 8 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL). Sempre compare com o tubo que
tem a escala de Mcfaland e com aquele papel listrado ou contra luz. Se estiver
parecido pode começar.
- Use o swab para fazer a confluência(meio Mueller hinton)
- Aplicação dos discos
- Leitura dos halos após incubação.
Não coloque o meio na superfície do fundo escuro sempre segure, para luz passar e você
conseguir fazer uma boa leitura. Quando for identificar a placa sempre lembre de escrever
no cantinho, para não atrapalhar a leitura depois.
A área em volta de um disco antibiótico que não tem crescimento é chamada de zona de
inibição. Esta zona é medida em milímetros (mm) e comparada a um gráfico de
interpretação padrão usado para categorizar a amostra como sensível, intermediária ou
resistente. Se a zona de inibição observada é maior ou igual ao tamanho da zona padrão, o
microrganismo é considerado sensível ao antibiótico. Por outro lado, se a zona de inibição
observada é menor, o microrganismo é considerado resistente.
Colheita e identificação de estreptococos, enterococos e
estafilococos.
ESTAFILOCOCOS
-
Secreção nasal e orofaringe.
Materiais:
Ágar sangue + Meio Stuart → orofaringe
Ágar sangue + manitol hipertônico → fossas nasais
Depois de inoculadas nos meios por esgotamento e incubadas, vão ser o
obtidos os seguintes resultados
bactérias gram positivas
Teste da Catalase
A presença da catalase permite separar os estreptococos catalase negativa de
outros cocos Gram-positivos produtores de catalase, por exemplo, estafilococos. A
enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. A liberação
do oxigênio se observa pela formação de bolhas.
- Controle positivo de Staphylococcus aureus;
- Leitura: Não havendo formação de bolhas, o teste é negativo e indicativo de
Streptococcus.
- 👀: Atenção: reações falso-positivas podem ocorrer se o teste for realizado em
meio de cultura contendo sangue, pois este possui a enzima catalase.
Teste da Coagulase em lâmina
- Colocar 2 gotas de salina em uma lâmina;
- Emulsionar uma colônia isolada a ser testada;
- Colocar uma gota de plasma 1:5 e misturar.
👀: Lembrar de não colocar muita colônia, a mesma quantidade que eu tiver no controle eu
tenho que ter no teste.
Leitura: Formação de coágulo ou grumos, identifica Staphylococcus aureus;
Não há formação de coágulo ou grumos, identifica Staphylococcus coagulase
negativa.
Teste da Coagulase em tubo
Adicionar uma alçada de colônia diretamente no plasma 1:5 de coelho com EDTA;
no tubo teste e controle com Staphylococcus aureus
Leitura:Formação de coágulo observada pela inclinação suave.
Formação de coágulo inteira ou parcial, identifica Staphylococcus aureus;
Não há formação de coágulo, identifica Staphylococcus coagulase negativa.
ESTREPTOCOCOS E ENTEROCOCOS
Para identificar deve-se verificar a coloração, formato e arranjo(cocos alinhados em
cordões)
Teste da catalase
Teste da bacitracina e Camp test
Em um lado do agar sangue deve-se colocar salina, depois pegar colônia, realizar o
esgotamento e colocar o disco de bacitracina.
Leitura: pode ser beta-hemolítico do grupo A: Streptococcus pyogenes
Do outro lado deve realizar o Camp test, o teste visa a identificação de cepas de S.
agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o fator CAMP (Christie, Atkins e
Munch-Petersen) que atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo
Staphylococcus aureus em ágar sangue.
- Leitura: se formar seta dos dois lados: positivo
- Seta de um lado só: negativo
Prova da Optoquina:
● A optoquina (etil-hidrocupreína hidroclorídrica) é uma droga solúvel em água que se
difunde rapidamente em meio de cultura sólido. Para este teste, em geral, utiliza-se
o disco de optoquina de 6 mm contendo 5 µg da droga.
● Procedimento: Preparar uma suspensão do isolado correspondente a 0,5 da escala
de McFarland; Semear a suspensão em uma placa de ágar sangue de carneiro 5%
de forma a obter crescimento confluente; Após a absorção da suspensão pelo meio
de cultura, colocar um disco de optoquina na superfície do meio semeado, com o
auxílio de uma pinça; Incubar.
● Resultado: Formação de halo,que deve ser medido; Presença de halo ≥ 14 mm
indica que a cultura é sensível à optoquina, sendo identificado para Streptococcus
pneumoniae
Teste PYR
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida
pelo S. pyogenes, mas não pelos demais estreptococos β-hemolíticos.
● Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma
lâmina ou placa de Petri vazia;
● Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação
mais lenta e menos intensa);
● Realizar um esfregaço com a bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o disco de
PYR umidecido;
● Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorrerá
em até 1 minuto.
Leitura:Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha;
O aparecimento de coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo;
● Bile esculina:
+ PRETO
- AMARELO
● NaCl:
+ AMARELO
- ROXO
Caracterização de enterobactérias e coprocultura
- O aluno deverá observar o aspecto e coloração das colônias nos meios de cultura.
Após, deverá coletar uma colônia isolada que seja suspeita de patógeno (DEC,
Shigella ou Salmonella) e inocular com agulha nos tubos da série bioquímica na
ordem observada no esquema abaixo.
Os microrganismos utilizam diferentes vias metabólicas para obtenção de
energia e diferentes enzimas para degradar substratos, essa classificação se
baseia exatamente nisso, em como cada bactéria se comporta frente a
determinado teste, levando em consideração essas características
metabólicas.
➔ Procedimento: Com auxílio da alça descartável (parte mais fina), coletar
colônia suspeita (sem brilho); inocular a colônia em cada tubo da série
bioquímica;
- LAC + : as colônias ficam rosadas
- LAC - : ágar fica alaranjado
SÉRIE BIOQUÍMICA
Legenda:
Vm = Caldo Vermelho De Metila
teste para identificar espécies bacterianas fortes fermentadoras, a partir da glicose. O meio
tem a cor inicial amarelo, se a bactéria for uma forte produtora de ácidos ficará vermelho,
em função da presença do indicador de pH vermelho de metila. O ponto de viragem deste
meio é o pH 4,4.
Resultados:
VM: pingar de 3 a 5 gotas de vermelho de metila no tubo, e analisar os seguintes resultados
- avermelhado +: fermentação ácida mista
- amarelado - :
Ureia = Caldo Ureia (Teste Da Urease ou Caldo Ureia de Stuart): esse meio é utilizado
para avaliar se a bactéria é produtora da enzima urease. A ureia presente no meio é
degradada pela enzima urease em duas moléculas de amônia. A amônia formada alcaliniza
o meio e o indicador de pH, vermelho de fenol, presente no meio, se torna rosa.
Originalmente o meio tem a cor âmbar e após a alcalinização se torna rosa.
● Ureia:
- positivo: rosado
- negativo: continua o mesmo aspecto
Mili = Motilidade, (Produção De) Indol, Lisina Descarboxilase
★ Determinar se o microrganismo é móvel ou imóvel
★ Auxilia na diferenciação entre gêneros
▻ Ex: Klebsiella e Enterobacter
★ Inocular até 2/3 do meio
★ ▻ Meio semi-sólido: 0,3-0,5% de ágar
👀 NÃO VIRE O TUBO NA HORIZONTAL!!! Visualizar os tubos sempre na vertical
★ Resultados:
★ pingar de 3 a 5 gotas do reagente Kovac’s
- motilidade + : tubo turvo
- motilidade - : tudo com uma ‘'espécie’' de furo
- descarboxilação da lisina +: continua roxo
- descarboxilação da lisina - : fundo amarelado
- produção de indol + : possui a presença de um anel avermelhado em cima
do tubo
- produção de indol - : anel amarronzado/ amarelo
Fenilalanina = Ágar Fenilalanina (Teste Da Fenilalanina Desaminase)
★ Meio utilizado para diferenciação de bacilos entéricos quanto à capacidade de
produzir ácido fenilpirúvico a partir da desaminação da fenilalanina por ação
enzimática.
★ O meio é incolor e se os bacilos entéricos forem FA positivos, o meio apresentará
uma coloração esverdeada na superfície após a adição do cloreto férrico.
★ Pingar de 3 a 5 gotas de cloreto férrico
★ Resultado +: o tubo ficar verde
★ Resultado - : não muda de coloração
↓
Tsi = Ágar Triple Iron Sugar (Tríplice Açúcar Ferro)
★ Determinar a capacidade de um microrganismos de metabolizar carboidrato no
meio, com ou sem produção de gás, e produção de H2S;
★ Resultado:
Leitura:
produção de gás +: bolhas de ar com o ágar podendo subir no tubo
produção de gás - : sem bolhas de ar
- fermentação + : meio amarelado
- fermentação - : meio avermelhado
- produção de H2S + : meio fica preto
- produção de H2S - : meio continua da mesma coloração
Citrato = Ágar Citrato De Simmons
★ Meio utilizado para identificação de bactérias que utilizam o citrato com única fonte
de carbono.
★ Resultado: O meio tem a coloração inicial verde, se a bactéria metabolizar o citrato
presente no meio, ele ficará azul devido ao indicador azul de bromotimol. A mudança
de cor ocorre pela alcalinização do meio
★ Leitura:
- positivo + : meio fica azul
- negativo - : meio fica verde
Urocultura
- Uso de cultura mista
- Bacilos gram + no agar sangue
- Bacilos gram - agar mac conkey
- Se tiver crescimento no Mac Conkey: serie bioquimica
- SEM crescimento no Mac Conkey:
- GRAM
- Catalase:
- Se POSITIVO: coagulase em tubo e lâmina / manitol
Novobiocina: placa de mullher hinton, fazer escala de McFarland, usar salina para fazer
confluencia (com swab) e aplicar o disco.
- Se NEGATIVO: Camp teste/ bacitracina
NaCl / bile esculina
- Infecção do trato respiratório
- Infecções de pele e partes moles + tsa
GRAM NEGATIVO
LAC + : série bioquímica
LAC - : oxidase
- Tira de oxidase em uma placa vazia
- Pingar 2 gotas de água destilada na tira
- Alça descartável e coletar colônias controle de pseudomonas e colocar de um lado
da tira
- Fazer a mesma coisa com colônias teste
- Positivo: azul
- Negativo: mesma cor
- Se POSITIVO: OF glicose e cetrimide
OF Glicose:
- 2 tubos, 1 com meio e outro com meio e vaselina
- Agulha normal e inocula nos 2 tubos com placa agar nutriente
- Resultado:
Cetrimide: esgotamento com bactéria teste com alça descartável
Resultado:
- Se NEGATIVO: Série bioquímica e OF glicose
GRAM POSITIVO:
- Catalase
- Se POSITIVA: coagulase em tubo e lâmina + manitol
- Se NEGATIVA: Camp / bacitracina e NaCl / Bile esculina.