Dissertação Ana Carolina - versão final

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ANA CAROLINA BALDISSERA
EFEITO DA COMBINAÇÃO DE ATMOSFERA MODIFICADA E USO DE CONSERVANTE SOBRE A VIDA ÚTIL DE QUEIJO MUSSARELA FATIADO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), como requisito parcial para obtenção de grau de Mestre em Ciência e Tecnologia em Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Weber da Silva Robazza
 Coorientador: Prof. Dr. Juliano de Dea Lindner
PINHALZINHO, SC
2019
ANA CAROLINA BALDISSERA
EFEITO DA COMBINAÇÃO DE ATMOSFERA MODIFICADA E USO DE CONSERVANTE SOBRE A VIDA ÚTIL DE QUEIJO MUSSARELA FATIADO
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade do Estado de Santa Catarina.
Banca Examinadora
Orientador:
__________________________________________________________________________ 
 Prof. Dr. Weber da Silva Robazza
 Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC)
Membros
 _________________________________________________________________________
 Prof. Dra. Heveline Enzweiler
 Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC)
 _________________________________________________________________________
 Prof. Dr. Jhony Tiago Teleken
 Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
PINHALZINHO, JANEIRO DE 2020.
AGRADECIMENTOS
A Deus. 
Ao meu orientador Prof. Dr. Weber da Silva Robazza, meus maiores sentimentos de gratidão. Obrigada pela confiança desde o início do programa, pelo apoio, disponibilidade, ensinamentos, auxílio e estímulo. Que sorte a minha ser orientada por alguém considerado exemplo de ética e profissionalismo.
Ao meu coorientador Prof. Dr. Juliano De Dea Lindner, pela confiança, companhia e amizade. Por disponibilizar infinitos recursos para o desempenho deste projeto. Pelos ensinamentos, descontração e paciência no decorrer das análises. 
À Nataly Neves Oliveira dos Santos e Gabriel Emiliano Motta, por toda a disponibilidade, leveza, amizade e compartilhamento de conhecimento no decorrer das análises.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade do Estado de Santa Catarina e aos professores que fazem parte do corpo docente e que, de certo modo, contribuíram para minha formação profissional.
À Chocoleite Indústria de Alimentos LTDA, pela disponibilidade e abertura em ceder suas instalações para que este trabalho pudesse ser realizado.
Ao meu filho, Bernardo, por dar sentido aos meus dias. E mesmo tão pequenino, não me deixar desistir dos meus sonhos.
Aos meus pais, Salete e Valmir, por continuarem me incentivando à estudar, e me apoiarem ao longo da minha vida. 
À minha família, Marília, Valentina, Lorena, Ruan, Flórence, Fabi, Tia Ivone, Vitoria e Fernanda, por todo carinho e amizade.
A todos os meus amigos, destacando João Victor, por terem sido meu alicerce, companhia e sinônimo de companheirismo. 
Gratidão pela presença e apoio de todos vocês.
RESUMO
Este estudo visou avaliar a influência da temperatura de armazenamento e da adição de conservante químico sobre a vida útil de queijo mussarela fatiado armazenado em atmosfera modificada. Foram utilizados 8 tratamentos: com duas concentrações de gases, acondicionado sob duas temperaturas, com a presença/ausência do conservante sorbato de potássio e a concentração de gases na embalagem após 1, 15 e 45 dias de armazenamento. Foram avaliados parâmetros físico-químicos e microbiológicos, indicativos da qualidade de vários alimentos, incluindo o queijo mussarela. O pH e a acidez foram influenciados pelas condições de tempo e temperatura, enquanto o pH diminuiu com o aumento da temperatura e tempo de armazenamento, a acidez aumentou. A população bacteriana no geral teve um aumento no decorrer dos dias de análise, exceto no caso de bactérias psicrotróficas. A contagem de bolores e leveduras foi o parâmetro que mais sofreu interferência em relação à concentração de gases, sendo menor na maior concentração. A população de Escherichia coli foi o único parâmetro que não teve interferência dos tratamentos empregados. Concluiu-se que a temperatura de armazenamento ainda é o fator que mais impacta na vida útil do queijo mussarela, e quanto mais baixa, menores serão as contagens bacterianas.
Palavras chave: Queijo mussarela. Gases. Temperatura. Conservante.
ABSTRACT
The purpose of the current study was to evaluate the influence of the storage temperature and of the addition of chemical preservative on the shelf life of sliced mozzarella cheese stored under modified atmosphere. To accomplish this task, there were adopted eight different treatments that included two storage temperatures, the addition/absence of potassium sorbate and the gases concentrations of the modified atmosphere packaging after 1, 15 and 45 days of storage. In addition, to evaluate the quality of the product, there were measured physicochemical and microbiological parameters. As a result, pH and acidity were mainly affected by the temperature and time of storage. The pH has diminished with time and temperature increasing. On the other hand, acidity has increased at the same conditions. Overall, the microbial population has increased during storage except for psychrotrophic bacteria. Molds were more sensitive to the gas concentration of the modified atmosphere packaging and the population of Escherichia coli was not affected by the different treatments. It can be concluded that the storage temperature is the parameter that most affects the shelf life of mozzarella cheese.
Keywords: Mozzarella cheese. Gases. Temperature. Preservative.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Escala de comprimento de partículas características em queijos	16
Figura 2 – Fluxograma para elaboração de queijo mussarela 	20
Figura 3 – Máquina de fatiamento de queijo mussarela 	24
Figura 4 – Termoformadora para embalagem de queijo	24
Figura 5 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada parâmetro físico químico após um dia de armazenamento	33
Figura 6 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada microrganismo após um dia de armazenamento	35
Figura 7 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada parâmetro físico químico após quinze dias de armazenamento	38
Figura 8 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada microrganismo após quinze dias de armazenamento	41
Figura 9 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada parâmetro físico-químico após quarenta e cinco dias de armazenamento 	43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Classificação dos queijos baseado no conteúdo de umidade. 15
Tabela 2 – Padrões microbiológicos para queijo mussarela. 17
Tabela 3 – Padrões microbiológicos para queijos. 17
Tabela 4 – Tratamentos utilizados no presente estudo. 27
Tabela 5 – Valores obtidos para parâmentros físico-químicos após um dia de armazenamento30
Tabela 6 – Sumários das regressões lineares realizadas para parâmetros físico-químicos após um dia de armazenamento 31
Tabela 7 – Valores obtidos para as contagens microbiológicas após um dia de armazenamento 30
Tabela 8 – Sumário das regressões lineares realizadas para cada microrganismo após um dia de armazenamento	33
Tabela 9 – Valores obtidos para parâmetros físico-químicos após quinze dias de armazenamento 36
Tabela 10 – Sumário das regressões lineares realizadas para os parâmetros físico-químicos após quinze dias de armazenamento	37
Tabela 11 – Valores obtidos para as contagens microbiológicas após quinze dias de armazenamento.	39
Tabela 12 – Sumário das regressões lineares realizadas para cada microrganismo após quarenta e cinco dias de armazenamento	40
Tabela 13 – Valores obtidos para os parâmetros físico-químicos após quarenta e cinco dias de armazenamento.	42
Tabela 14 – Sumário das regressões lineares realizadas para os parâmetros físico-químicos após 45 dias de armazenamento	43
Tabela 15 – Valores obtidos para as contagens microbiológicas após 45 dias de armazenamento 44
LISTA DE ABREVIATURAS
	Elemento
	Descrição
	Unidade
	
	Letras latinas
	
	FDA
	Food and Drug Administration 
	-
	DTA
	Doenças transmitidas por alimentos
	-
	BAL
	Bactérias ácido-lácticas
	UFC/g
	MRS
	Man, Rugosa and Sharpe
	-
	
	Tempo 
	dias
	
	Temperatura
	°C
	
	Luminosidade
	-
	
	Intensidade de vermelho
	-
	
	Intensidade do amarelo
	-
	
	Índice de saturação 
	-
	
	Ângulo de tonalidade 
	-
	
	Raiz quadrada do erro quadrático médio
	-
	
	Erro médio absoluto
	-
	
	Erro relativo percentual médio
	-
	UFC
	Unidade Formadora de colônia 
	-
	
	Número de parâmetros 
	-
	
	Número de pontos experimentais 
	-
	GGH
	Glóbulos de gordura homogeneizados
	-
	GCO
	Grânulos de coalhafa unidos
	-
	MS
	Ministério da Saúde
	-
	ANVISA
	Agência Nacional de Vigilância Sanitária
	-
	RDC
	Resolução da Diretoria Colegiada
	-
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS
	Elemento
	Descrição
	Unidade
	
	Letras Gregas
	
	βi
	Parâmetro ajustável
	adimensional
	
	Subscritos e sobrescritos
	
	
	Inicial 
	-
	
	Valores experimentais 
	-
	
	Valores observados
	-
	
	Enésimo número
	-
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO	10
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA	12
2.1 QUEIJOS E CONSERVAÇÃO DE PRODUTOS LÁCTEOS 12
2.2 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS LÁCTEOS	13
2.3 QUEIJOS	15
2.3.1 Definições, padrões físico-químicos e microbiológicos de queijo mussarela 16
2.3.2 Matéria prima, ingredientes e fabricação do queijo mussarela 18
2.4 BACTÉRIAS DETERIORANTES	19
2.5 A UTILIZAÇÃO DE CONSERVANTES EM QUEIJOS	20
3 OBJETIVOS	22
3.1 OBJETIVO GERAL	22
3.1.1 Objetivos específicos 22
4 MATERIAIS E MÉTODOS	23
4.1 FABRICAÇÃO DO QUEIJO MUSSARELA	23
4.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS	25
4.3 ANÁLISE DE pH	25
4.4 ANÁLISE DE ACIDEZ	26
4.5 ANÁLISE DE COR	26
4.6 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL E MODELAGEM MATEMÁTICA	27
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO	29
5.1 RESULTADOS OBTIDOS APÓS 1 DIA DE ARMAZENAMENTO	29
5.2 RESULTADOS OBTIDOS APÓS 15 DIAS DE ARMAZENAMENTO	35
5.3 RESULTADOS OBTIDOS APÓS 45 DIAS DE ARMAZENAMENTO	42
6 CONCLUSÕES	45
7 SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS:	46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS	47
1. INTRODUÇÃO 
Em 1º de junho de 2019, entraram em vigor novas regras para a produção de leite no Brasil, as quais especificaram novos padrões de identidade e qualidade dos leites cru refrigerado, pasteurizado e tipo A. As mudanças foram publicadas no Diário Oficial da União, em 30 de novembro de 2018, a pedido do MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento). A partir de então, foi estabelecido um prazo de 180 dias para regulamentação e consequente revogação das Instruções Normativas 51/2002, 22/2009, 62/2011, 07/2016 e 31/2018 (EMBRAPA, 2019).
Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2019), foram industrializados no país mais de 5,8 milhões de litros de leite no segundo trimestre de 2019, um valor de cerca de 0,4 milhões superior em relação ao mesmo período de 2018. Só em Santa Catarina, o total industrializado foi de mais de 636 milhões de litros de leite.
Derivados lácteos, por suas propriedades físico-químicas, são alimentos ótimos para o desenvolvimento de muitos microrganismos, e tem sua qualidade microbiológica influenciada, entre outros fatores, pela flora inicial do leite cru, condições de processamento e armazenamento (RUEGG, 2003; LOSITO et al., 2014).
O queijo mussarela, conhecido por ser de massa filada, é um dos inúmeros queijos originários da Itália. Segundo o FDA (1989), o queijo mussarela é subdivido em dois tipos: com baixo teor de umidade (45-54%) e com alto teor de umidade (56 a 65%). 
Geralmente, o queijo mussarela quando embalado a vácuo, em bandejas de polipropileno, seladas com uma película plástica superior e armazenadas a 8 °C, tem um prazo de validade inferior a 5 semanas. Por essa razão, o aumento da vida útil do produto é de extrema importância do ponto de vista industrial (MASTROMATTEO et al., 2014). 
Inúmeros estudos têm surgido, visando à melhoria da qualidade e o aumento da vida de prateleira dos alimentos no geral. Neste contexto, o uso de matérias-primas de alta qualidade, o desenvolvimento de inovações de processos e a adoção de condições adequadas de armazenamento têm se mostrado de extrema importância para o alcance deste objetivo (FARKYE et al., 1991; KINDSTEDT, 1993; BRODY, 2001; CONTE et al., 2009).
Na busca pelo prolongamento da vida útil de derivados lácteos, o potencial de embalagens com atmosfera modificada e embalagens ativas foi investigado (FLOROS et al., 2000; PANTALEÃO et al., 2007; PAPAIOANNOU et al., 2007, MASTROMATTEO et al., 2014; BROWN; FORAUER; D’AMICO, 2018). Com a utilização de embalagem em atmosfera modificada, é possível que sejam obtidos alguns benefícios como, por exemplo, a redução das alterações fisiológicas, das taxas de respiração, das reações de oxidação e do crescimento microbiano (MASTROMATTEO et al., 2014).
Este estudo teve o intuito de avaliar a interferência dos gases componentes de atmosfera modificada e sua interação com a presença de conservantes no aumento da vida útil de queijo mussarella, bem como no crescimento bacteriano e nas alterações físico-químicas em decorrência do tempo de armazenamento.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Na fundamentação teórica estão apresentados conceitos acerca da produção, parâmetros de qualidade microbiológicos e físico-químicos e da aplicação da tecnologia de embalagem em atmosfera modificada e uso de conservantes em queijos. 
2.1 QUEIJOS E CONSERVAÇÃO DE PRODUTOS LÁCTEOS
De acordo com o Regulamento Técnico para Fixação de Identidade e Qualidade de Queijo Mussarela (BRASIL, 1997), entende-se este produto como o queijo que se obtém por filagem de uma massa acidificada (produto intermediário obtido por coagulação de leite por meio de coalho e/ou outras enzimas coagulantes apropriadas), complementada ou não pela ação de bactérias lácticas específicas.
Ainda de acordo com o regulamento, os queijos podem ser classificados em queijos de baixa umidade (teor de umidade entre 36,0 e 45,9%), queijos de alta umidade (teor de umidade entre 46,0 a 54,9%) e queijos de muito alta umidade (com umidade não inferior a 55,0%). 
O queijo é um alimento considerado extremamente versátil, dada sua variedade de sabores, texturas e finalidades, características estas determinadas de acordo com o conteúdo proteico e força de interações proteína-proteína, além da suacomposição e condições de maturação e armazenamento (JANA; TAGALPALLEWAR, 2017; LUCEY et al. 2003; BANVILLE et al. 2013).
O uso de aditivos alimentares, dentre eles os conservantes, é estritamente regulamentado pela legislação, tanto mundial quanto nacional, devido ao risco potencial destas substâncias à saúde e segurança humana. Os limites específicos para cada um daqueles conservantes que são permitidos estão identificados em seus respectivos regulamentos (GUARINO et al., 2011).
Uma abordagem alternativa para se aumentar a vida útil de produtos lácteos envolve o uso de embalagens com atmosfera modificada. Estas embalagens podem proteger o produto contra a desidratação e a proliferação bacteriana e fúngica (COSTA et al., 2016).
A demanda por produtos livres de conservantes favorece o uso de embalagens do tipo Atmosfera Modificada (AM) na indústria de alimentos (BROWN; FORAUER; D’AMICO, 2018). Segundo Silva (2016), entre as tecnologias de embalagens desenvolvidas para a indústria de alimentos, aquelas com AM lideraram a evolução dos métodos de conservação dos alimentos frescos e minimamente processados. Estas embalagens atuam alterando o ambiente gasoso em torno do alimento com a finalidade de prolongar sua vida de prateleira. Elas modificam a composição dos gases que rodeiam um produto alimentício durante o armazenamento e, com a utilização de N2 e CO2, é possível reduzir as alterações fisiológicas, reações de oxidação e crescimento microbiano (MASTROMATTEO et al., 2014).
Portanto, diferentes métodos podem ser empregados como agentes conservantes (substâncias químicas adicionadas, temperaturas empregadas e modificação da atmosfera a que se expõem os produtos alimentícios). Logo, uma avaliação quantitativa comparativa da eficácia de cada agente pode ajudar a estabelecer uma combinação ótima destes agentes que maximizem a vida útil deste produto.
2.2 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS LÁCTEOS
Com o aumento na demanda de consumo de lácteos, alterações nos padrões de distribuição, formulações, mercado de exportação e expectativas dos consumidores resultaram na necessidade de suprir altos padrões de qualidade e fornecer produtos com um prazo de validade mais longo. Para fabricar lácteos de alta qualidade, as indústrias têm feito exigências rigorosas acerca da qualidade do leite cru, tais como: composição adequada (por exemplo, níveis de proteína e gordura dentro da legislação); matéria-prima isenta de sabores e odores estranhos; livre de resíduos detectáveis de drogas, adição de água ou outros adulterantes; baixa contagem total de bactérias e baixa contagem de células somáticas (MURPHY et al., 2016).
A maioria das bactérias presentes naturalmente no leite in natura é inativada durante o processo de pasteurização (elevação da temperatura entre 72 e 75 °C por 15 segundos) ou por outros tratamentos envolvidos na produção de derivados lácteos (XIN et al., 2017), o que não acontece com as enzimas, comumente lipases.
Desde antes de 1917, a introdução e o aperfeiçoamento gradual dos métodos de pasteurização por todo o mundo melhoraram a segurança e a qualidade do leite e produtos lácteos (BOOR et al., 2017). A pasteurização é considerada um processo eficiente para a eliminação de microrganismos patogênicos, fornecendo leite seguro para consumo e reduzindo a quantidade de microrganismos deteriorantes (SØRHAUG; STEPANIAK, 1997; LEWIS, 2003; KNIGHT et al., 2004). Entretanto, o processamento térmico do leite cru não é suficiente para eliminar todos os microrganismos capazes de causar deterioração e/ou alterações (RIBEIRO JUNIOR et al., 2018). Os microrganismos termodúricos resistem ao processo de pasteurização do leite e utilizam componentes, como proteínas e gorduras, como fontes de nutrientes, causando alterações organolépticas e consequente redução da vida útil do produto (HULL et al., 1992; HUCK et al., 2007).
De acordo com Johnson (2017), entre as bactérias que podem sobreviver à pasteurização se incluem aquelas capazes de produzir gás, produtoras de esporos e acidificantes, particularmente Streptococcus thermophilus, que, apesar de ter sua população reduzida durante a pasteurização, pode sobreviver em número suficiente para eventualmente desenvolver um biofilme na seção regenerativa do pasteurizador.
Alterações significativas ocorrem como resultado do crescimento microbiano do leite cru durante o transporte e a estocagem, sendo o mais prejudicial o resultado da liberação de enzimas lipolíticas e proteolíticas. Neste processo ocorre a quebra da estrutura proteica das micelas e/ou hidrólise de lipídios, afetando diretamente a qualidade e o rendimento dos produtos fabricados (HOTCHKISS; WERNER; LEE, 2006; ESPIE; MADDEN, 1997; BOOR; MURPHY, 2002).
Mussarela é um queijo altamente suscetível a contaminantes, tanto ambientais quanto microbianos (MEIER et al., 2018). Durante seu armazenamento, a mussarela pode perder a firmeza e a mastigabilidade desejadas pelos consumidores. Além disso, a capacidade de cortar ou triturar convenientemente o queijo para uso em pizza é reduzida e o produto tende a ficar pegajoso, grumoso e grudado nas lâminas mecânicas dos equipamentos de fatiação. Estes defeitos são causados pela proteólise e maturação, limitando sua utilização e diminuindo sua vida de prateleira (MOYNIHAN, 2014).
Vários autores relataram as atividades mais intensas de bactérias psicrotróficas produtoras destas lipases termorresistentes, enfatizando os gêneros Pseudomonas, Aeromona, Bacillus, Staphylococcus e Streptococcus (CHEN; COOLBEAR; DANIEL, 2004; MARTINS et al., 2015; MU; DU; BAI, 2008; SUBATHRA DEVI et al., 2015; TEH et al., 2011; VELU et al., 2012).
A composição da maioria dos produtos lácteos fornece um ótimo ambiente físico e químico para o crescimento e propagação de um amplo espectro de microorganismos, que englobam, além das bactérias já citadas, bolores e leveduras (HOTCHKISS; WERNER; LEE, 2006; TERNSTROM et al.,1993; JAY, 2000; BOOR; MURPHY 2002; CHAMBERS, 2002).
2.3 QUEIJOS
Em geral, o consumo global de queijo vem aumentando continuamente, sendo prevista uma projeção de aumento de aproximadamente 13,5% entre 2016 e 2025 (OCDE/FAO, 2016).
Segundo Fox (1993), queijo é o nome genérico dado a um grupo de alimentos fabricados à base de leite fermentado, produzidos em uma grande variedade de sabores e formas em todo o mundo. Inicialmente, era uma forma de conservar os constituintes do leite que evoluiu para se tornar um alimento de alta culinária com qualidades epicuristas, além de ser altamente nutritivo.
O queijo, além de ser um alimento altamente nutritivo e saboroso, possui um valor significativo na dieta, já que contém em sua composição proteína, gordura, minerais essenciais e vitaminas, dentre outros nutrientes. É utilizado principalmente por sua contribuição organoléptica em diversos pratos; no entanto, traz o adicional de nutrição e funcionalidade a uma variedade de alimentos (JANA; TAGALPALLEWAR, 2017).
Segundo o National Dairy Council (2000), mais de 400 variedades de queijo são conhecidas. Fox et al., (2016), classificaram os queijos (Tabela 1) em categorias específicas, com base em vários critérios, como firmeza (teor de umidade), tipo de cultura, maturado ou não, entre outros.
Tabela 1 – Classificação dos queijos baseado no conteúdo de umidade
	Tipo de Queijo
	Conteúdo de umidade (%)
	Exemplos
	Queijo fresco
	50 – 80
	Cottage, Quark, Camembert, Feta
	Queijo de pasta mole
	39 – 50
	Blue, Provolone, Limburger, Tilsiter
	Queijo semiduro
	Máx. 39
	Cheddar, Colby, Edam, Swiss, Gouda
	Queijo duro
	Máx. 34
	Parmesão, Romano, Sardo, Grana
Fonte: Adaptado de Olson (2008) e Fox et al., (2016).
As proteínas (caseínas na maior parte) são as principais componentes estruturais e estão presentes na forma de uma rede na matriz do queijo, na qual englobam glóbulos de gordura, água, minerais, bactérias e solutos dissolvidos, como lactose, ácido láctico, sais solúveis e peptídeos. Elas são as principais responsáveis pela estruturação do produto, aliadas a cada etapa de processamento (SMITH et al, 2017; LAMICHHANE;KELLY; SHEEHAN, 2018). Como outros tipos de alimentos, o queijo abrange uma estrutura hierárquica, com escalas que variam da molecular à macroescala (Figura 1). 
Figura 1 – Escala de comprimento de partículas características em queijos.
	Escala molecular
	Nanoescala
	
	Microescala
	
	Macroescala
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	GGH
	GCU
	
	
	Olhaduras, rachaduras
	Íons, água, lactose, proteínas do soro
	Agregados de caseína
	
	Micelas de caseína
	Bactérias
	Gordura livre
	Cristais visíveis
	
	
	
	
	Glóbulos de gordura nativos
	
	
	Partículas de coalhada
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	1 Å
	1 nm
	10 nm
	100 nm
	1 µm
	10 µm
	100 µm
	1 mm
	1 cm
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Fonte: LAMICHHANE; KELLY; SHEEHAN, 2018. Adaptado pela autora, 2020.
Legenda: GBH: Glóbulos de gordura homogeneizados; GCU: Grânulos de coalhada unidos
2.3.1 Definições, padrões físico-químicos e microbiológicos de queijo mussarela
O Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) através do Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade (RTIQ) estabelece que queijo mussarela é o queijo que se obtém por filagem de uma massa acidificada, (produto intermediário obtido por coagulação de leite por meio de coalho e/ou outras enzimas coagulantes apropriadas), complementada ou não pela ação de bactérias lácticas específicas, e pode ser um queijo de média, alta ou muita alta umidade, e extra-gordo, gordo a semi-gordo, dependendo do seu padrão físico-químico, como define o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Queijos (BRASIL, 1997).
Ainda, segundo a portaria nº 364, de 04 de setembro de 1997, dentre os ingredientes obrigatórios cita-se o leite e/ou leite reconstituído padronizado ou não no seu conteúdo de matéria gorda, coalho e/ou outras enzimas coagulantes apropriadas e o cloreto de sódio. Já dentre os ingredientes opcionais, cita-se a massa acidificada, cultivo de bactérias lácteas específicas, leite em pó, creme, cloreto de cálcio, caseinatos, ácidos cítrico, láctico, acético ou tartárico, e especiarias, condimentos e/ou outras substâncias alimentícias (BRASIL, 1997).
Além dos parâmetros físico-químicos, os padrões microbiológicos também são fixados pelo MAPA (2018), para queijo mussarela (Tabela 2).
Tabela 2 – Padrões microbiológicos para queijo mussarela
	Microrganismo
	n
	C
	m
	M
	Coliformes (30 °C)
	5
	2
	1000
	5000
	Coliformes (45 °C)
	5
	2
	100
	500
	Estafilococos Coagulação Positiva
	5
	2
	100
	1000
	Salmonella
	5
	0
	0
	-
	Listeria monocytogenes
	5
	0
	0
	-
Fonte: Brasil, 2018.
Legenda: n: número de unidades retiradas da amostra; C: número máximo de resultados positivos permitidos; m: separa as contagens satisfatórias das contagens aceitáveis. M: indica o limite entre as contagens aceitáveis e as contagens não satisfatórias. 
Entretanto, em 23 de dezembro de 2019, o Ministério da Saúde (MS), através da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), publicou a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) n° 331, que estabelece os padrões microbiológicos de alimentos e sua aplicação, padrões estes disponíveis na Instrução Normativa n° 60, de 23 de dezembro de 2019, conforme apresentado abaixo na Tabela 3 (BRASIL, 2019a; BRASIL, 2019b).
Tabela 3 – Padrões microbiológicos para queijos
	Microrganismo
	n
	C
	m
	M
	Enterotoxinas estafilocócicas (ng/g)
	5
	0
	Ausente
	-
	Salmonella/25g
	5
	0
	Ausente
	-
	Estafilococos Coagulase Positiva
	5
	2
	10²
	10³
	Escherichia coli/g, para queijos com umidade abaixo de 46%
	5
	2
	10
	10²
	Escherichia coli/g, para queijos com umidade igual ou acima de 46%
	5
	1
	10²
	10³
Fonte: Adaptado de Brasil, 2019b.
Legenda: n: número de unidades retiradas da amostra; C: número máximo de resultados positivos permitidos; m: separa as contagens satisfatórias das contagens aceitáveis. M: indica o limite entre as contagens aceitáveis e as contagens não satisfatórias. 
2.3.2 Matéria prima, ingredientes e fabricação do queijo mussarela
A proteína e a gordura são os dois principais componentes do leite cru (SHIMA; TANIMOTO, 2015). Contudo, o conjunto dos glóbulos de gordura e micelas de caseína ocupa mais da metade do teor de sólidos do leite. Portanto, a estabilidade estrutural e interações entre estas partículas afetam fortemente a qualidade de produtos lácteos (SHIMA; TANIMOTO, 2015; WALSTRA; WOUTERS; GEURTS, 2006).
No leite, a caseína é organizada em aglomerados hidrocoloidais com um diâmetro específico, denominados micelas de caseína (DE KRUIF et al., 2012). Já em queijos, após a adição do coagulante, é formado um gel preenchido com glóbulos de gordura, de tamanho característico, disperso em um gel de proteína e água (LUYTEN, 1988; YANG et al., 2011; WALSTRA, 1968).
As culturas iniciais, comumente chamadas Starter, ou popularmente, fermento lácteo, são principalmente espécies de bactérias produtoras de ácido láctico que são adicionadas ao leite. Seu papel principal é iniciar a produção de ácido láctico para o processo de fabricação do queijo (BROOME, 2007). Estas culturas podem ser classificadas em dois grupos: as linhagens menos sensíveis ao calor, que compreendem basicamente Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Lactobacillus helveticus, com temperaturas ótimas de crescimento em torno de 37 °C, e as linhagens mais sensíveis ao calor, com temperaturas ótimas de crescimento de cerca de 30 °C (LAW; TAMIME, 2010; MA et al., 2013).
Além disso, é importante monitorar a concentração de bactérias ácido lácticas (BAL), por serem os principais componentes das culturas iniciadoras usadas na produção de queijos, contribuindo para o sabor e a textura dos produtos fermentados e inibindo as bactérias deteriorantes dos alimentos, por produzir substâncias que reduzem significativamente seu crescimento (LOSITO et al., 2014).
O processo de fabricação de queijo mussarela (Figura 2), otimizado ao longo dos anos, desempenha um papel importante na determinação da estrutura do produto, e hoje, é capaz de incorporar processos técnicos de ponta visando sua padronização (SMITH et al, 2017).
Figura 2 – Fluxograma para elaboração de queijo mussarela.
Fonte: Adaptado de Patel, Vyas e Upadhyay (1986) e Ghosh e Singh (1996).
2.4 BACTÉRIAS DETERIORANTES 
Antes da implantação do sistema de refrigeração nas propriedades leiteiras logo após a ordenha, os microrganismos responsáveis pela deterioração do leite e seus derivados, eram do grupo dos mesófilos fermentadores de lactose, que causam rápida acidificação em leite. Com a publicação de regulamentos e instruções normativas determinando o uso da refrigeração do leite, associado a períodos mais longos de armazenamento, foi selecionado outro tipo de microbiota deterioradora, denominada psicrotrófica, capaz de se desenvolver em baixas temperaturas (ARCURI, 2003; COUSIN, 1982; FAGUNDES et al., 2006; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Os microrganismos psicrotróficos sintetizam enzimas termorresistentes e são capazes de se multiplicar a temperaturas iguais ou menores que 7 °C, independentemente de sua temperatura ótima de crescimento (FRANK et al., 1992).
A microflora predominante de queijos é constituída por bactérias ácido lácticas (BAL), introduzidas via fermento ou cultura starter. Os microrganismos remanescentes incluem bactérias termorresistentes originárias da matéria-prima, que conseguem sobreviver à etapa de pasteurização do leite, e a microflora que consiste na contaminação pós-pasteurização (MOLSKA, 1988). 
O crescimento de bolores e leveduras em queijos não é desejável, salvo produtos específicos, como Camembert e Brie, nos quais algumas espécies de fungos participam do processo de maturação (TANIWAKI; SILVA, 2001). Esses, de forma indesejável, podem causar mudanças drásticas na composição química, estrutura e aparência do produto, tornando-o impróprio para o consumo (LANITA; SILVA, 2008).
Além da produção de micotoxinas devido ao crescimento de fungos, estas ainda podem ser introduzidas em todos os produtos lácteos por contaminação indireta, inclusive possivelmente presente nos alimentos ingeridos pelas vacas leiteiras, como é ocaso da aflatoxina M1 (SENGUN; YAMAN; GONUL, 2008).
2.5 A UTILIZAÇÃO DE CONSERVANTES EM QUEIJOS 
A segurança é uma das principais questões da indústria de alimentos e, além da deterioração dos produtos alimentícios, sempre há preocupação com o surto de doenças transmitidas por alimentos (DTA) entre fabricantes de alimentos, agências reguladoras, pesquisadores e consumidores (KHORSHIDIAN et al., 2018). 
Estudos desenvolvidos sobre embalagens ativas de alimentos podem assumir a forma de filmes biodegradáveis e/ou comestíveis (MELLINAS et al., 2015) e atmosfera modificada (LEE et al., 2015), e tem sido preferidos por manter um rótulo limpo quando comparado ao uso de conservantes químicos.
Os gases mais utilizados em embalagens com atmosfera modificada são o oxigênio, nitrogênio e dióxido de carbono, que são utilizados isoladamente ou combinados para o aumento da vida de prateleira dos alimentos (LEE et al., 2015).
O CO2 é um inibidor do crescimento bacteriano e de fungos. A solubilidade deste gás é maior em temperaturas mais baixas, logo, a temperatura de estocagem refrigerada possui um efeito sinérgico para a ação bacteriostática do gás carbônico (CHURCH; PARSONS, 1995). Os bolores, leveduras e bactérias aeróbias deteriorantes são altamente susceptíveis ao gás carbônico (FINNE, 1982).
Um mecanismo possível para os efeitos inibitórios do crescimento bacteriano do CO2 poderia ser a inibição da captação de substratos pelos microorganismos já que as propriedades das proteínas são alteradas pela presença deste gás (FARBER, 1991; DIXON; KELL, 1989). 
O gás nitrogênio (N2) é um gás inerte, devido a suas fortes ligações. Portanto, este gás não afeta o odor, sabor ou cor dos alimentos, e sua principal funcionalidade pode estar relacionada à prevenção de um possível colapso da embalagem, que pode ocorrer quando altas concentrações de CO2 são utilizadas, situação favorecida no embalamento de queijos (LEE et al., 2015; SANDHYA, 2010).
O ácido 2,4-hexadienóico, mais conhecido como ácido sórbico e seu sal de potássio, são alternativas difundidas pelas indústrias alimentícia e farmacêutica, e sua aplicação está bem estabelecida como conservante antimicrobiano (NEMES et al., 2020). 
Conservantes químicos, como sorbato de potássio, são comumente usados para inibir ou retardar o crescimento de microrganismos patogênicos nos alimentos, já sua ação antimicrobiana é conhecida devido ao acúmulo de prótons e ânions no interior da célula microbiana que interrompe o metabolismo normal (MUSYOKA et al., 2018; LOPEZ-MALO et al., 2007).
3. OBJETIVOS
A seguir estão descritos os objetivos do presente estudo.
3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente estudo é avaliar o efeito da aplicação de diferentes concentrações de gases nas embalagens (via tempo de injeção) de gás e da aplicação ou não de conservante sorbato de potássio como tratamento na casca do queijo. Além disto, avaliar o efeito da temperatura empregada na conservação do queijo mussarela fatiado acondicionado em embalagem com atmosfera modificada.
3.1.1 Objetivos específicos
a) Verificar o efeito da adição de conservante no queijo mussarela. 
b) Verificar o efeito da concentração de gás no aumento ou diminuição da vida de prateleira do queijo mussarela.
c) Verificar o efeito da estocagem em diferentes temperaturas na vida de prateleira do queijo mussarela. 
d) Obter expressões matemáticas que expressam a influência da concentração de cada gás e da temperatura sobre cada variável de resposta estudada.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Nessa seção estão descritos os materiais e métodos empregados para alcance dos objetivos.
4.1 FABRICAÇÃO DO QUEIJO MUSSARELA 
O leite utilizado na fabricação do queijo mussarela foi proveniente de produtores rurais da região da serra catarinense (Lages, SC), nas dependências da empresa Chocoleite Indústria de Alimentos Ltda. Foram realizadas análises físico-químicas conforme Instrução Normativa do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. O leite foi então armazenado à 4 °C, e posteriormente pasteurizado a 72 – 75 °C por 15 segundos e enviado ao tanque de fabricação.
Foi adicionada a cultura láctea (Streptococcus termophillus) e o cloreto de cálcio no início do enchimento do tanque. Ao completar o volume, foi adicionado o coagulante, e então mantido em repouso até a formação da coalhada. Foram realizados o corte e cozimento para a expulsão do excesso de soro dos grãos e, então a massa foi prensada e permaneceu em repouso para que ocorresse a diminuição do pH. Posteriormente, a massa foi cortada em blocos e filada com água quente, moldada e acondicionada em formas na água gelada. Após a redução da temperatura, os queijos foram imersos em solução de salmoura por aproximadamente 16 horas, e então dispersos em prateleiras em câmara fria, para secarem. Foram então embalados a vácuo e transportados até a máquina de fatiamento (Marca e Modelo: Incalfer Rodi 1M – Figura 3) para posterior embalagem sob atmosfera modificada (Gás de nome comercial Conservare 68 – White Martins) em Termoformadora Selovac LF-360 (Figura 4).
Ao serem embaladas, foram acondicionadas em caixas de isopor, com gelo reutilizável, e transportadas até o Laboratório de Bioprocessos e o Laboratório de Microbiologia de Alimentos no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina em Florianópolis. 
Figura 3 – Máquina de fatiamento de queijo mussarela.
Fonte: Elaborada pela autora, 2020.
Figura 4 – Termoformadora para embalagem de queijo mussarela
Fonte: Elaborada pela autora, 2020.
Todas as análises microbiológicas e físico-químicas foram realizadas nos dias 1, 15 e 45 de armazenamento, com exceção das análises dos parâmetros de cor que foram feitas nos dias 1 e 15 de armazenamento.
4.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS 
Para as determinações das contagens microbiológicas foram retiradas alíquotas de 25 g das amostras dos queijos mussarela e transferidas para sacos estéreis de Stomacher, e adicionadas de 225 mL de água peptonada 0,1% estéril e homogeneizadas em Stomacher (BagMixer 400) por 2 minutos obtendo-se a diluição 10-1. Diluições seriadas subsequentes foram preparadas com água peptonada 0,1% estéril, retirando-se 1 mL da diluição 10-1 e transferindo-se para tubos de ensaio contendo 9 mL de água peptonada. 
Para a contagem das bactérias ácido lácticas viáveis (BAL), utilizou-se o método de semeadura em placa (pour plate) por superfície, em Ágar De Mann, Rogosa e Sharpe (MRS) (LIOFILCHEM, KASVI, Itália), que foram incubadas em jarra anaeróbia, com placas invertidas, a 37 °C durante 48 horas. A concentração de BAL foi expressa em log UFC/g. 
Para a contagem de microrganismos psicrotróficos, utilizou-se o método de semeadura em superfície, em Plate Count Agar (PCA). As placas foram incubadas a 7°C por 10 dias. A concentração de psicrotróficos foi expressa em log UFC/g. Por sua vez, para a contagem de bolores e leveduras, utilizou-se Potato Dextrose Agar, ou Agar Batata Dextrose (PDA), pelo método de semeadura em superfície. As placas foram incubadas a 25 °C, por 5 dias. A concentração de bolores e leveduras foi expressa em log UFC/g.
Para a contagem de enterobactérias, foi utilizado o método com Ágar EMB (Ágar Eosina Azul de Metileno – Neogen), através da semeadura em superfície, e incubadas a 35 °C por 24 horas e para a contagem de estafilococos foi utilizado o método com ágar Baird Parker, suplementado com telurito e gema de ovo (Neogen), através da semeadura em superfície. As placas foram incubadas a 35 °C por 24 horas.
4.3 ANÁLISE DE pH
As determinações do pH dos queijos mussarela foram realizadas utilizando-se pHmetro (Hanna, modelo HI9126) com resolução de 0,01. Para as análises de pH, foram utilizados 5 g de amostra de queijo mussarela homogeneizada em 50 mL de água destilada. O pHmetro foi calibrado antes das leituras, utilizando soluções padrão (pH 4,0 e pH 7,0). 
4.4 ANÁLISE DE ACIDEZ
As determinações do teor de acidez dos queijos foram realizadas de acordo com o Instituto Adolfo Lutz (2008). Pesou-se aproximadamente 10g da amostra, transferindo para um balão volumétrico de 100 mL com álcool a 95%, neutro, completando-se o volume. A amostra foi filtrada e retirada uma alíquota. Foram adicionadas 5 gotas da solução de fenolftaleína e foi feita titulação com solução de hidróxido de sódio 0,1 M, até coloração rósea. Os valores foram aplicados na equação a seguir:
 (1)
onde
V = volume (mL) de solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação
f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,1 M
A = massa (g) da alíquota da amostra usado na titulação.
4.5 ANÁLISE DE COR
Para a avaliação instrumental da cor das amostras de mussarela fatiadas, as determinações foram realizadas através de colorímetro (Minolta Chroma Meter, modelo CR-400), em três escalas L*, a*, b*, onde L* indica a luminosidade e o a* e b*, são as coordenadas cromáticas (para a* variando de vermelho a verde e b* variando de azul a amarelo). Para cada um dos instantes considerados, foram avaliados os parâmetros Croma e ângulo de Hue, dados pelas Equações 2 e 3, respectivamente.
 (2)
 (3)
4.6 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL E MODELAGEM MATEMÁTICA
	No presente estudo foram utilizadas as seguintes variáveis explicativas cada uma com dois níveis: a temperatura de armazenamento (X1) (5 °C e 10 °C), o tempo de injeção do gás na embalagem (X2) (2,6 segundos e 2,8 segundos) e a presença ou ausência de conservante (X3) (sorbato de sódio a 0,2 % em massa). Os níveis das variáveis explicativas foram definidos com base em parâmetros operacionais do processo da empresa estudada. Foi realizado um planejamento fatorial completo 23. Todas as medidas foram realizadas em duplicata. As variáveis de resposta (Y) foram a cor, pH, acidez e as contagens bacterianas.
	Para cada uma das respostas foi ajustado o seguinte modelo de segunda ordem:
 (4)
	A Tabela 4 apresenta os níveis codificados das variáveis e tratamentos utilizados nesta dissertação:
Tabela 4 – Tratamentos utilizados no presente estudo.
	Tratamento
	X1
	X2
	X3
	1
	-1 (5 °C)
	-1 (2,6 seg)
	-1 (0,0 %)
	2
	-1 (5 °C)
	-1 (2,6 seg)
	1 (0,2 %)
	3
	-1 (5 °C)
	1 (2,8 seg)
	-1 (0,0 %)
	4
	-1 (5 °C)
	1 (2,8 seg)
	1 (0,2 %)
	5
	1 (10 °C)
	-1 (2,6 seg)
	-1 (0,0 %)
	6
	1 (10 °C)
	-1 (2,6 seg)
	1 (0,2 %)
	7
	1 (10 °C)
	1 (2,8 seg)
	-1 (0,0 %)
	8
	1 (10 °C)
	1 (2,8 seg)
	1 (0,2 %)
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
	Com o intuito de avaliar os ajustes obtidos com o modelo polinomial da Equação 4, foram utilizados os seguintes índices estatísticos: raiz do erro quadrático médio (RMSE), erro absoluto médio (MAE) e erro relativo percentual médio (ERPM), os quais estão dados pelas Equações de 5 a 7. Nestas expressões, o símbolo n corresponde ao número de observações experimentais, p é o número de parâmetros do modelo, ypred,i representa a i-ésima previsão realizada pelo modelo e yobs,i é a i-ésima observação experimental.
 (5)
 (6)
 (7)
	Toda a análise estatística e regressões lineares foram realizadas com o software livre R v. 3.6.1 (R CORE TEAM, 2013).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A seguir, estão apresentados e discutidos os resultados obtidos nesta dissertação.
5.1 RESULTADOS OBTIDOS APÓS 1 DIA DE ARMAZENAMENTO 
	A Tabela 5 apresenta os resultados obtidos para os parâmetros físico-químicos após o primeiro dia de armazenamento para cada um dos oito tratamentos utilizados. Conforme pode ser visto, o pH e acidez foram estatisticamente equivalentes para todos os tratamentos e houve uma ligeira diferença nos valores dos parâmetros de coloração para alguns tratamentos. Os valores negativos do ângulo de Hue foram gerados por um valor negativo do parâmetro a*, o que indica que a cor da amostra tendeu mais para o verde que para o vermelho (TUNICK et al., 2012). Portanto, em geral, é possível considerar-se que não houve diferença entre a maior parte dos parâmetros físico-químicos nos diferentes tratamentos após um dia de armazenamento.
Em comparação com outros estudos, Martínez-Martínez e Vélez-Ruiz (2019), encontraram resultados para luminosidade L* semelhantes ao medidos no presente estudo, com valores de 84,83, valores de pH e acidez ligeiramente menores, em torno 5,54 e 0,086%, respectivamente, no primeiro dia de armazenamento. Já Gorrasi et al. (2016), ao avaliar a mussarela acondicionada em embalagem ativa, sob abuso térmico (18 °C), encontrou pH de 5,58 no primeiro dia de armazenamento, valor este relativamente próximo ao obtido nesta dissertação (5,71). Além disso, Moynihan et al. (2016), avaliaram a influência do teor de caseína no pH e acidez de queijo mussarela. Seus resultados demonstram que quanto menor a quantidade de caseína, menor o pH e consequentemente, menor a acidez. Os valores encontrados para o dia 1 foram pH 5,45 para o pH e acidez de 0,39 % de ácido láctico para o leite com teor de caseína menor. Os queijos mussarela avaliados foram embalados sob vácuo, e armazenados em temperatura de 4 °C.
Os modelos expressos pela Equação 4 foram ajustados em função das variáveis explicativas. As Equações de 8 a 12 expressam os resultados para os parâmetros físico-químicos. Observa-se que o pH e o Croma são, de fato, independentes das variáveis X1, X2 e X3. o que indica que eles podem ser considerado como constantes para todos os tratamentos. Por sua vez, a Acidez e o ângulo de Hue dependem de X1 e X2 e de X1, X2 e X3, respectivamente. Entretanto, o valor do termo independente (β0) é bem superior em relação aos demais coeficientes, o que indica que estes parâmetros são muito pouco afetados pela temperatura, quantidade de gás e adição de conservante após um dia de armazenamento. A Tabela 6 apresenta um resumo dos resultados obtidos para as Equações de 8 a 12. Observa-se que o modelo constante para o Croma não apresenta os resíduos normalmente distribuídos o que indica que, provavelmente, um modelo polinomial não é adequado para descrever sua dependência com as variáveis explicativas.
Tabela 5 – Valores obtidos para os parâmetros físico-químicos após um dia de armazenamento. Os valores estão expressos como média (erro-padrão).
	Tratamento
	pH
	Acidez (%)
	h* (°)
	C*
	L*
	1
	5,69 (0,01)a
	2,0 (0,0)a
	-80,5 (0,2)a
	22,4 (0,4)ab
	76,2 (1,0)b
	2
	5,72 (0,01)a
	1,9 (0,1)a
	-80,4 (0,1)a
	22,5 (0,1)a
	71,4 (0,4)a
	3
	5,72 (0,03)a
	1,9 (0,0)a
	-79,9 (0,1)ab
	22,3 (0,4)ab
	74,6 (0,5)ab
	4
	5,71 (0,00)a
	1,6 (0,1)a
	-79,0 (0,2)b
	20,3 (0,3)b
	73,8 (0,7)ab
	5
	5,69 (0,04)a
	1,7 (0,1)a
	-80,1 (0,5)ab
	22,6 (0,6)a
	73,2 (1,1)ab
	6
	5,76 (0,01)a
	1,8 (0,5)a
	-80,5 (0,4)a
	22,4 (0,1)ab
	75,5 (1,2)ab
	7
	5,73 (0,01)a
	1,5 (0,1)a
	-79,8 (0,1)ab
	22,4 (0,5)ab
	73,1 (0,3)ab
	8
	5,71 (0,01)a
	1,5 (0,0)a
	-79,6 (0,5)ab
	22,6 (0,4)a
	72,4 (0,8)ab
*Valores seguidos pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey, a nível de 5% de probabilidade.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
 (8)
 (9)
 (10)
 (11)
 (12)Tabela 6 – Sumário das regressões lineares realizadas para os parâmetros físico-químicos após um dia de armazenamento.
	Coeficiente
	Equação 8
	Equação 9
	Equação 10
	Equação 11
	Equação 12
	Intercepto
	5,71 (0,01)***
	1,72 (0,06)***
	-79,98 (0,08)***
	22,17 (0,21)***
	73,77 (0,33)***
	X1
	ns
	-0,12 (0,06)# 
	ns
	ns
	ns
	X2
	ns
	-0,11 (0,06)#
	0,42 (0,08)***
	ns
	ns
	X1X3
	ns
	Ns
	-0,16 (0,08)#
	ns
	0,89 (0,33)*
	X2X3
	ns
	Ns
	0,16 (0,08)#
	ns
	ns
	RMSE
	0,040
	0,212
	0,271
	0,813
	1,816
	MAE
	0,028
	0,145
	0,189
	0,593
	1,497
	ERPM (%)
	0,493
	8,431
	0,237
	2,736
	2,028
	Shapiro (p)
	0,052
	0,154
	0,462
	0,015
	0,988
Os valores estão expressos como estimativa (erro-padrão)
ns: não significante
#: p<0,1, *: p<0,05, **:p<0,01 e ***:p<0,001.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
Conforme pode ser visualizado na Tabela 7, um comportamento semelhante foi observado para as contagens microbiológicas. A principal diferença entre estas e os parâmetros físico-químicos está associada a uma maior incerteza nos valores experimentais como pode ser percebido pelos valores dos erros-padrão.
Tabela 7 – Valores obtidos para as contagens microbiológicas após um dia de armazenamento. Os valores estão expressos como média (erro-padrão).
	Tratamento
	BAL (logUFC/g)
	Bolores (logUFC/g)
	E. coli (logUFC/g)
	Psicrotróficos (logUFC/g)
	1
	1,4 (0,6)a
	0,3 (0,2)bc
	0,0 (0,0)a
	1,3 (0,8)a
	2
	1,4 (0,9)a
	1,4 (1,0)ab
	Ausente
	1,4 (0,7)a
	3
	1,7 (1,1)a
	0,7 (0,5)bc
	0,0 (0,0)a
	1,4 (0,8)a
	4
	0,6 (0,5)a
	0,2 (0,0)c
	0,0 (0,0)a
	1,7 (0,9)a
	5
	1,0 (0,5)a
	0,1 (0,1)c
	0,7 (0,5)b
	1,6 (0,8)a
	6
	1,6 (0,8)a
	1,0 (0,7)ab
	Ausente
	1,1 (0,6)a
	7
	1,4 (0,8)a
	0,0 (0,0)c
	0,7 (0,6)ab
	1,1 (0,6)a
	8
	1,4 (0,8)a
	0,0 (0,1)c
	0,0 (0,0)a
	1,1 (0,6)a
*Valores seguidos pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey, a nível de 5% de probabilidade.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
	Solomakos et al. (2019), ao enumerar bactérias ácido lácticas, bolores e leveduras e psicrotróficas em um estudo envolvendo queijo grego, maturado, com leite de ovelha e atmosfera modificada e duas diferentes temperaturas, encontrou valores de psicrotróficos em torno de 6 log UFC/g para as temperaturas estudadas (4 e 10 °C), valores para bactérias ácido lácticas em torno de 7,6 e 7,7 log UFC/g para temperaturas de 4 e 10 °C, respectivamente e para bolores e leveduras em torno de 2,5 log UFC/g para ambas as temperaturas no tempo 0 (zero).
	As Equações de 13 a 16 apresentam os resultados obtidos após o ajuste do modelo polinomial para os diferentes microrganismos. De acordo com os resultados obtidos, a concentração de Escherichia coli pode ser aproximada como sendo constante independentemente da temperatura, concentração de gases e adição de conservante. A população de bactérias psicrotróficas diminui com o aumento da temperatura e de sua interação com a concentração de gases e a presença de conservante. Por sua vez, a população de bolores interage de forma negativa com a concentração de gases e sua interação com a presença de conservante, mas curiosamente diminui com a adição de conservantes, o que indica que após um dia de tratamento, a adição de sorbato de potássio ainda não exerceu efeito inibitório sobre os fungos. A Tabela 8 apresenta os resultados obtidos para os parâmetros ajustáveis e os índices estatísticos obtidos após cada ajuste e as Figuras 5 e 6 mostram os diagramas dos valores previstos em função dos observados para os parâmetros físico-químicos e microbiológicos, respectivamente. 
 (13)
 (14)
 (15)
 (16)
Tabela 8 – Sumário das regressões lineares realizadas para cada microrganismo após um dia de armazenamento.
	Coeficiente
	Equação 13
	Equação 14
	Equação 15
	Equação 16
	Intercepto
	1,29 (0,08)***
	0,51 (0,09)***
	0,07 (0,04)#
	1,64 (0,05)***
	X1
	ns
	ns
	ns
	-0,12 (0,05)*
	X2
	ns
	-0,18 (0,09)#
	ns
	ns
	X3
	ns
	0,19 (0,09)#
	ns
	ns
	X1X2
	ns
	ns
	ns
	-0,11 (0,05)#
	X1X3
	0,28 (0,08)**
	ns
	ns
	-0,11 (0,05)*
	X2X3
	-0,20 (0,08)*
	-0,32 (0,09)**
	ns
	ns
	RMSE
	0,293
	0,305
	0,532
	0,178
	MAE
	0,253
	0,239
	0,355
	0,144
	ERPM (%)
	22,823
	63,772
	139,423
	9,254
	Shapiro (p)
	0,389
	0,531
	0,000
	0,259
Os valores estão expressos como estimativa (erro-padrão)
ns: não significante
*: p<0,05, **:p<0,01 e ***:p<0,001.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
Figura 5 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada parâmetro físico-químico após um dia de armazenamento.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
Figura 6 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada microrganismo após um dia de armazenamento.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
5.2 RESULTADOS OBTIDOS APÓS 15 DIAS DE ARMAZENAMENTO 
	Os resultados obtidos para as propriedades físico-químicas após quinze dias de armazenamento estão expressos na Tabela 9. Nesta situação, foi observada diferença nos valores do pH e acidez entre alguns tratamentos. Em geral, o pH foi mais baixo quando a temperatura de armazenamento foi de 10 °C, quando o tempo de injeção foi igual a 2,6 segundos (o que corresponde a uma menor concentração de gases). A presença ou ausência de conservante não afetou os valores do pH. Comportamento análogo foi observado para a acidez, exceto que ela aumentou quando o pH diminuiu. No que diz respeito aos parâmetros de cor, os valores de h*, C* e L* não variaram com os tratamentos. Entretanto, houve diferença em relação aos valores obtidos após 1 dia de tratamento, o que sugere que o tempo de armazenamento é uma variável mais relevante para explicar a variação desses parâmetros do que os níveis de temperatura, tempo de injeção de gás e presença/ausência de conservante empregado no presente estudo.
	Ma et al. (2014), encontrou valores de L* para queijo mussarela após seu forneamento em torno de 78,87, ou seja, com luminosidade ainda maior que os queijos avaliados após 15 dias de armazenamento no presente estudo. 
	Moynihan et al. (2016), em estudo já citado anteriormente, encontraram valores para 15 dias de armazenamento, de pH igual a 5,51 e acidez igual a 0,6 % de ácido láctico para o leite com teor de caseína menor, valores menores quando comparados ao estudo apresentado. 
Tabela 9 – Valores obtidos para os parâmetros físico-químicos após quinze dias de armazenamento. Os valores estão expressos como média (erro-padrão).
	Tratamento
	pH
	Acidez
	h* (°)
	C*
	L*
	1
	5,65 (0,05)abc
	2,1 (0,4)ab
	-81,7 (0,1)a
	29,2 (0,5)a
	76,5 (0,6)a
	2
	5,79 (0,01)a
	1,3 (0,1)a
	-81,8 (0,2)a
	29,0 (0,7)a
	75,6 (0,4)a
	3
	5,79 (0,03)a
	1,5 (0,2)a
	-81,7 (0,3)a
	28,9 (0,3)a
	77,4 (1,6)a
	4
	5,71 (0,04)ab
	1,8 (0,2)ab
	-81,8 (0,3)a
	30,2 (0,5)a
	76,5 (0,9)a
	5
	5,49 (0,05)c
	3,4 (0,3)c
	-81,8 (0,2)a
	29,7 (0,3)a
	77,7 (0,9)a
	6
	5,57 (0,02)bc
	2,8 (0,2)bc
	-81,6 (0,3)a
	30,4 (0,3)a
	74,5 (1,1)a
	7
	5,70 (0,07)ab
	2,0 (0,3)ab
	-81,9 (0,1)a
	30,6 (0,4)a
	74,7 (0,9)a
	8
	5,61 (0,02)abc
	2,6 (0,3)abc
	-82,1 (0,1)a
	30,1 (0,1)a
	76,2 (0,6)a
*Valores seguidos pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey, a nível de 5% de probabilidade.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
	As Equações de 17 a 21 foram obtidas após o ajuste do modelo polinomial de segundo grau (Equação 4) para cada uma das variáveis de resposta físico-químicas. Após a manutenção dos termos significativos, concluiu-se que o parâmetro β3 (presença/ausência) de conservante de fato não afetou o pH e a acidez, mas interagiu com o tempo de injeção de gás na embalagem de atmosfera modificada. Os parâmetros de cor, em geral, se mantiveram constante com a exceção do C*, o qual sofreu uma pequena influência da temperatura. A partir da análise do parâmetro β0, observou-seque o nível médio do pH diminuiu (5,71 para 5,66), da acidez aumentou (1,72 para 2,14), da luminosidade e do Croma aumentaram (73,77 para 76,13 e 22,17 para 29,75, respectivamente) e que a coloração se tornou mais esverdeada (o ângulo de Hue variou de -79,98° para -81,80°) após armazenamento de 1 para 15 dias.
 (17)
 (18)
 (19)
 (20)
 (21)
	A Tabela 8 apresenta um sumário das regressões lineares obtidas para as Equações 14 a 18. A partir dos valores dos índices estatísticos, nota-se que os ajustes obtidos pelos modelos foram satisfatórios, sendo que o único modelo que não reproduziu os resultados experimentais com alta precisão foi o da acidez (Equação 15) que apresentou um erro percentual médio de cerca de 20%. Os valores pequenos obtidos para os índices estatísticos evidenciam que os parâmetros de cor foram independentes dos tratamentos empregados. Após aplicação do teste de Shapiro-Wilk, estimou-se que os resíduos dos 5 modelos se apresentaram aproximadamente normalmente distribuídos (p>0,05), com exceção da Equação 18, a qual apresentou um ligeiro desvio da normalidade. A Figura 7 apresenta os gráficos dos valores preditos em função dos valores observados após o ajuste dos cinco modelos aos dados experimentais.
Tabela 10 – Sumário das regressões lineares realizadas para os parâmetros físico-químicos após quinze dias de armazenamento.
	Coeficiente
	Equação 17
	Equação 18
	Equação 19
	Equação 20
	Equação 21
	Intercepto
	5,66 (0,01)***
	2,14 (0,09)***
	-81,80 (0,07)***
	29,75 (0,15)***
	76,13 (0,35)***
	X1
	-0,07 (0,01)***
	0,49 (0,09)***
	ns
	0,43 (0,15)**
	ns
	X2
	0,04 (0,01)**
	-0,24 (0,09)*
	ns
	ns
	ns
	X1X2
	Ns
	-0,21 (0,09)*
	ns
	ns
	ns
	X2X3
	-0,05 (0,01)**
	0,27 (0,09)**
	ns
	ns
	ns
	RMSE
	0,074
	0,459
	0,396
	0,843
	1,946
	MAE
	0,063
	0,404
	0,334
	0,671
	1,475
	ERPM (%)
	1,120
	20,297
	0,409
	2,269
	1,940
	Shapiro (p)
	0,097
	0,046
	0,164
	0,727
	0,789
Os valores estão expressos como estimativa (erro-padrão)
ns: não significante
*: p<0,05, **:p<0,01 e ***:p<0,001.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
Figura 7 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada parâmetro físico-químico após quinze dias de armazenamento.
 
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
	A Tabela 11 mostra os resultados obtidos para as contagens microbiológicas de cada tratamento após quinze dias de armazenamento. As populações de bactérias ácido-lácticas e de bolores foram superiores para a temperatura de 10 °C em relação à temperatura de 5 °C. Por sua vez, os microrganismos psicrotróficos, conforme esperado, se desenvolveram melhor a 5 °C, enquanto que o crescimento dos E. coli foi aproximadamente independente da temperatura. A concentração de todos os microrganismos não variou de forma significativa com o tempo de injeção dos gases na embalagem. Em relação aos tratamentos com conservantes, as bactérias ácido-lácticas, bolores e microrganismos psicrotróficos se desenvolveram melhor nos tratamentos sem conservantes, mas os níveis de E. coli foram aproximadamente independentes da presença ou ausência de sorbato de potássio.
Tabela 11 – Valores obtidos para as contagens microbiológicas após quinze dias de armazenamento. Os valores estão expressos como média (erro-padrão).
	Tratamento
	BAL (logUFC/g)
	Bolores (logUFC/g)
	E. coli (logUFC/g)
	Psicrotróficos (logUFC/g)
	1
	2,2 (0,3)ab
	1,6 (0,3)ab
	1,2 (0,2)a
	0,4 (0,4)ab
	2
	1,8 (0,2)a
	1,6 (0,4)ab
	0,5 (0,2)b
	0,9 (0,4)ac
	3
	1,6 (0,3)a
	1,1 (0,2)a
	1,9 (0,0)c
	1,3 (0,4)ac
	4
	2,5 (0,3)b
	2,1 (0,3)bc
	1,3 (0,3)a
	1,7 (0,5)c
	5
	2,7 (0,2)b
	2,1 (0,2)bc
	1,7 (0,8)ac
	0,8 (0,5)ac
	6
	2,5 (0,2)b
	2,6 (0,2)c
	0,3 (0,0)b
	1,3 (0,0)c
	7
	2,2 (0,2)ab
	1,8 (0,2)b
	1,4 (0,0)a
	0,0 (0,0)b
	8
	3,1 (0,0)c
	2,4 (0,2)c
	Ausente
	0,6 (0,0)a
*Valores seguidos pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey, a nível de 5% de probabilidade.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
	Os resultados obtidos após o ajuste da Equação 4 aos dados microbiológicos estão indicados nas Equações de 22 a 25 e na Tabela 12. A partir das equações, é possível observar-se uma correlação negativa das populações de bactérias ácido-lácticas e de bolores com a presença de conservantes. Além dos conservantes, a temperatura afeta os bolores, mas não interagiu de forma significativa com as demais bactérias. Por sua vez, o nível de E. coli permaneceu independente dos tratamentos e os organismos psicrotróficos foram afetados pela interação entre temperatura e tempo de injeção de gases. Ao se observar a Tabela 12, verifica-se que os erros resultantes dos ajustes tendem a ser bem superiores para os dados microbiológicos em relação aos dados físico-químicos. Além disso, no caso dos bolores os resíduos não podem ser considerados como normalmente distribuídos, o que sugere que seja aplicada alguma transformação nos dados das variáveis explicativas antes do ajuste do modelo aos dados. A Figura 8 exibe os gráficos dos valores preditos em função dos valores observados para os modelos dados pelas Equações de 22 a 25.
 (22)
 (23)
 (24)
 (25)
Tabela 12 – Sumário das regressões lineares realizadas para cada microrganismo após quinze dias de armazenamento.
	Coeficiente
	Equação 22
	Equação 23
	Equação 24
	Equação 25
	Intercepto
	2,26 (0,10)***
	1,95 (0,08)***
	1,20 (0,20)***
	0,93 (0,16)***
	X1
	Ns
	0,22 (0,08)*
	ns
	ns
	X3
	-0,27 (0,10)*
	-0,36 (0,08)***
	ns
	ns
	X1X2
	Ns
	Ns
	ns
	-0,36 (0,16)*
	RMSE
	0,496
	0,422
	0,617
	0,561
	MAE
	0,399
	0,342
	0,503
	0,418
	ERPM (%)
	20,489
	22,665
	77,522
	50,920
	Shapiro (p)
	0,985
	0,008
	0,798
	0,426
Os valores estão expressos como estimativa (erro-padrão)
ns: não significante
*: p<0,05, **:p<0,01 e ***:p<0,001.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
	Em geral, após quinze dias de armazenamento, observou-se que as contagens médias indepedentemente do tratamento (parâmetro β0) de bactérias ácido lácticas (de 1,29 para 2,26 log UFC/g), bolores (de 0,51 log UFC/g para 1,95 log UFC/g) e E. coli (de 0,07 log UFC/g para 1,20 log UFC/g) aumentaram. Por outro lado, estas contagens diminuíram para as bactérias psicrotróficas (de 1,64 log UFC/g para 0,93 log UFC/g). Entretanto, obteve-se que o efeito da adição de sorbato de potássio (parâmetro β3) foi mais pronunciado para a inibição do crescimento de bactérias ácido-lácticas e de bolores em relação ao primeiro dia de armazenamento. Além disso, a temperatura (parâmetro β1) contribuiu mais para o crescimento de bolores e exerceu menor influência na população de bactérias psicrotróficas.
	Han et al. (2014), encontraram concentrações de bactérias ácido lácticas superiores a 8 log UFC/g, em mussarela acondicionada a 10 °C, por um período de 15 dias sob vácuo, valores bem acima dos encontrados no presente estudo, o que pode indicar que a presença de atmosfera modificada inibe seu crescimento.
Figura 8 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada microrganismo após quinze dias de armazenamento.
 
 
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
5.3 RESULTADOS OBTIDOS APÓS 45 DIAS DE ARMAZENAMENTO 
	A Tabela 13 mostra os resultados obtidos para os parâmetros físico-químicos após 45 dias de armazenamento.Observa-se que após 45 dias de armazenamento, o pH ficou aproximadamente na mesma faixa do que nos 15 primeiros dias e a acidez continou aumentando (Equações 26 e 27). A Tabela 14 sumariza os resultados obtidos após a regressão linear. A Figura 9 exibe os resultados obtidos para os diagramas de valores previstos pelos modelos das Equações 26 e 27 em função dos valores observados.
Tabela 13 – Valores obtidos para os parâmetros físico-químicos após quarenta e cinco dias de armazenamento. Os valores estão expressos como média (erro-padrão).
	Tratamento
	pH
	Acidez
	1
	5,72 (0,11)ab
	2,2 (0,6)bc
	2
	5,64 (0,03)ab
	2,8 (0,2)abc
	3
	5,78 (0,05)ab
	1,7 (0,3)b
	4
	5,82 (0,04)a
	1,7 (0,2)b
	5
	5,56 (0,01)b
	3,2 (0,2)ac
	6
	5,55 (0,00)b
	3,6 (0,1)a
	7
	5,65 (0,05)ab
	2,7 (0,4)abc
	8
	5,71 (0,02)ab
	2,3 (0,1)abc
*Valores seguidos pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey, a nível de 5% de probabilidade.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
 (26)
 (27)
Tabela 14 – Sumário das regressões lineares realizadas para os parâmetros físico-químicos após quarenta e cinco dias de armazenamento.
	Coeficiente
	Equação 26
	Equação 27
	Intercepto
	5,68 (0,02)***
	2,49 (0,10)***
	X1
	-0,06 (0,02)***
	0,44 (0,10)*** 
	X2
	0,06 (0,02)**
	-0,44 (0,10)***
	X1X2
	ns
	ns
	X2X3
	ns
	-0,18 (0,10)#
	RMSE
	0,090
	0,536
	MAE
	0,067
	0,416
	ERPM (%)
	1,174
	22,308
	Shapiro (p)
	0,123
	0,840
Os valores estão expressos como estimativa (erro-padrão)
ns: não significante
#: p<0,01, *: p<0,05, **:p<0,01, ***:p<0,001.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
Figura 9 – Gráficos apresentando os valores preditos em função dos valores observados para cada parâmetro físico-químico após quarenta e cinco dias de armazenamento.
 
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
Os valores médios das contagens microbiológicas estão apresentados na Tabela 15. Após 45 dias de armazenamento, as incertezas associadas às medidas microbiológicas foram bem altas, o que dificulta a identificação da eficácia relativa de cada tratamento empregado. Por essa razão, não foram ajustados modelos matemáticos para os dados da Tabela 15, mas somente foram feitas estimativas baseadas no valor médio para cada microrganismo. As Equações de 28 a 31 contêm os resultados obtidos. Como não foram feitos ajustes, não foram calculados índices de qualidade de ajuste para esses dados.
Tabela 15 – Valores obtidos para as contagens microbiológicas após quarenta e cinco dias de armazenamento. Os valores estão expressos como média (erro-padrão).
	Tratamento
	BAL (logUFC/g)
	Bolores (logUFC/g)
	E. coli
(logUFC/g)
	Psicrotróficos (logUFC/g)
	1
	0,2 (0,0)a
	2,7 (2,1)a
	0,4 (0,3)a
	1,8 (1,2)a
	2
	2,5 (2,3)ab
	2,5 (1,9)a
	0,5 (0,4)a
	0,9 (0,7)a
	3
	2,1 (2,0)ab
	2,2 (1,9)a
	0,6 (0,5)a
	1,4 (1,0)a
	4
	2,4 (2,3)ab
	3,1 (2,4)a
	1,4 (0,0)b
	0,4 (0,3)ab
	5
	2,5 (2,4)ab
	1,6 (1,3)a
	2,1 (0,0)c
	1,3 (0,9)a
	6
	2,5 (0,3)ab
	3,0 (2,2)a
	0,6 (0,5)a
	0,0 (0,0)b
	7
	2,8 (2,4)b
	2,1 (1,7)a
	Ausente
	0,0 (0,0)b
	8
	2,5 (2,4)ab
	2,4 (1,5)a
	Ausente
	0,8 (0,6)a
*Valores seguidos pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey, a nível de 5% de probabilidade.
Fonte: Elaborado pela autora, 2020.
 (28)
 (29)
 (30)
 (31)
6. CONCLUSÕES 
Em geral, o pH diminuiu com o tempo e temperatura e aumentou com o tempo de injeção de gases na embalagem e a acidez aumentou com o tempo e a temperatura, mas diminuiu conforme o tempo de injeção de gases na embalagem aumentou. Os índices de coloração mostraram que a mussarela se torna mais brilhante e esverdeada com o tempo e este efeito foi pouco afetado pelo tratamento empregado.
	No que diz respeito aos microrganismos estudados, na média, a população de cada bactéria/fungo aumentou com o tempo com a exceção das bactérias psicrotróficas. A incerteza associada às contagens também aumentou com o tempo de armazenamento. A temperatura foi a variável mais importante que afetou o crescimento das bactérias psicrotróficas, enquanto que a presença/ausência de conservante mais afetou a concentração de bactérias ácido-lácticas. O nível de E. coli foi praticamente independente de qualquer tratamento e a população de bolores aumentou com a temperatura e diminuiu com a concentração de gases. 
7. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS: 
Como pesquisas futuras, sugere-se:
· Utilizar bacteriocinas e óleos essenciais como conservantes e avaliar os resultados quando comparados com conservantes químicos;
· Avaliar os efeitos da adição de óleos essenciais sobre a vida útil dos queijos e alteração no perfil sensorial;
· Utilizar diferentes culturas starter, concomitantemente ao uso de conservantes e avaliar o crescimento microbiano;
· Avaliar diferentes concentrações de gases, e sua interação química e microbiológica com o queijo mussarela;
· Adicionar concentração conhecida de microrganismos em queijo mussarela e avaliar o poder de inibição de seu desenvolvimento utilizando bacteriocinas, conservantes químicos e extratos de óleo essencial.
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BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Instrução Normativa n° 60, de 23 de dezembro de 2019. Estabelece as lisras de padrões microbiológicos para alimentos. Diário Oficial da União. 26 de dezembro de 2019b.
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