Protocolos - TCTHS

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Técnicas Citohistoquímicas 
Técnicas Citohistoquímicas 		Protocolos
Índice
Protocolos de Coloração	6
Primeiro teste	6
HE	6
Protocolo	6
Fundamento	6
O que cora?	6
Azul de Alcião	6
Protocolo	6
Fundamento	7
O que cora?	7
Quando o Azul de Alcião tem pH 2,5?	7
Doenças	7
Azul de Alcião/ PAS	7
Protocolo	7
Fundamento	8
O que cora?	8
Doenças	8
PAS (Periodic Acid Schiff)	8
Protocolo	8
Fundamento	8
O que cora?	9
Doenças	9
Carmin de Best	9
Protocolo	9
Fundamento	9
O que cora?	9
Doenças	9
Tricrómico Masson	9
Protocolo	9
Fundamento	10
O que cora?	10
Desvantagens	10
Doenças	10
Técnicas de Eleição fibras elásticas:	10
Técnicas de eleição Reticulina:	11
Van Gieson	11
Protocolo	11
Fundamento	11
O que cora?	12
Doenças	12
Desvantagens	12
Gordon e Sweet	12
Protocolo	12
Fundamento	13
O que cora?	13
Doenças	13
Orceína - Giemsa	13
Protocolo	13
Fundamento	14
O que cora?	14
Doenças	14
Vermelho do Congo	14
Protocolo	14
Fundamento	14
O que cora?	14
Doenças	14
Fatores que influenciam a coloração dos tecidos	17
Hidratos de Carbono	17
O que são?	17
Mucinas neutras	18
Mucinas ácidas	18
Mucinas (glicoconjugados)	18
Proteoglicanos (glicoconjugada tecido conjuntivo)	18
Polissacárido (glicogénio)	18
Resultados falso negativos de amiloidose podem ser devido a:	18
Segundo teste	19
Fontana Masson	19
Protocolo	19
Fundamento	19
O que cora?	19
Doenças	20
Fouchet-Sirius Red	20
Protocolo	20
Fundamento	20
O que cora?	20
Doenças	20
Azul da Prússia de Perls	21
Protocolo	21
Fundamento	21
O que cora?	21
Doenças	21
Gram (em cortes de parafina)	22
Protocolo	22
Fundamento	22
O que cora?	22
Cuidados:	22
Doenças	22
Ziehl-Neelsen (em cortes de parafina)	23
Protocolo	23
Fundamento	23
O que cora?	23
Doenças/ aplicações	23
Fite – Mycobacterium leprae (técnica de Wade Fite??)	24
Protocolo	24
Fundamento	24
O que cora?	24
Doenças/ aplicações	24
Warthin-Starry	24
Protocolo	24
Fundamento/ técnica	25
O que cora?	25
Doenças	25
Giemsa Modificada (em cortes de parafina)	25
Protocolo	25
Fundamento	25
O que cora?	25
Doenças	25
Grocott (em cortes de parafina)	25
Protocolo	25
Fundamento	26
O que cora?	26
Doenças	26
Gridley (em cortes de parafina)	26
Protocolo	26
Fundamento	26
O que cora?	26
Doenças	26
Substâncias Exógenas	26
Carvão	26
Sílica	27
Asbestos	27
Silicone	27
Talco	27
Pó de luvas (amido)	27
Pigmentos artefactos	27
Formalínico	27
Mercúrio	27
Dicromato	27
Protocolos de Coloração
Primeiro teste
HE
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Corar com Hematoxilina
· Lavar na água corrente (retira o excesso de corante)
· Diferenciação 
· Azular em água corrente
· Corar com eosina
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Método de coloração histológico combinado
· Existem várias variantes devido aos tipos de H e E que são utilizados
· Fase inicial – coloração de núcleos com hematoxilina
· Fase posterior – contraste do citoplasma e restantes componentes celulares com eosina
· Confere uma boa coloração da arquitetura tecidular geral
O que cora?
· Núcleos – Azul
· Citoplasma – rosa (diferentes tonalidades)
· Fibras musculares – vermelho a rosa forte
· Eritrócitos – vermelho a laranja
· Fibrina – Rosa forte
Tipos
· Harris – núcleos
· Mayer – cromatina
· Gill – células caliciformes 
· Weigert (férrica) – fibras conjuntivas 
Azul de Alcião
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Corar com o Azul de Alcião
· Lavar na água corrente
· Fazer contraste com coloração nuclear Fast Red
· Lavar em água corrente
· Desidratar e montar
Fundamento
· Substância básica que se liga aos grupos ácidos dos hidratos de carbono
· pH 1 – cora mucinas muito ácidas
· pH 2.5 – cora mucinas ácidas fortes como fracas
· Vantagem:
- Cor intensa – mucinas muito coradas
- Especificidade – cora apenas mucinas ácidas
- Insolubilidade – não afetado por ação de ácido ou álcool
- Resultados permanentes – cor perdura durante muito tempo pelo que não é afetada pela passagem do tempo
· Desvantagem:
- ácidos nucleicos adoram este corante (agarram-se fortemente e atraem-no)
O que cora?
· Estruturas ricas em – mucinas ácidas – Azul-escuro
· Núcleos – rosa magenta
Quando o Azul de Alcião tem pH 2,5?
· Mucinas ácidas – Azul
· Núcleos - Roxo
Doenças
· Metaplasias intestinais
· Carcinoma gástrico
Azul de Alcião/ PAS
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Corar com o Azul de Alcião
· Lavar na água corrente e logo de seguida um pouco de água destilada
· Oxidar com ácido periódico (H5IO6)
· Lavar em água corrente
· Corar com reagente de Schiff
· Lavar com água corrente
· Corar com hematoxilina
· Lavar na água corrente
· Desidratar e corar
Fundamento
· Distingue entre mucinas ácidas e neutras
· O Cu presente na composição do corante é responsável pela cor azul
· Coloração sequencial
· Começar com Azul de Alcião para reagir com as mucinas ácidas e depois PAS para que haja reação com mucinas neutras
O que cora?
· Mucinas ácidas – tons de Azul 
· Mucinas neutras – tons de púrpura (rosa)
· Glicogénio – magenta
· Núcleos - roxo
Doenças
· Metaplasias intestinais
PAS (Periodic Acid Schiff)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Oxidar com ácido periódico (H5IO6)
· Lavar em água destilada
· Corar com reagente de Schiff
· Lavar com água corrente (quente)
· Contrastar com hematoxilina Mayer
· Desidratar e corar
Fundamento
· As estruturas demonstradas – glicogénio, mucinas neutras, mucinas ácidas fracas, muco proteínas e membranas basais
· Evidencia hidratos de carbono que tenham grupos glicol e carga neutra
· Ácido periódico – oxida as mucinas e glicogénios para que se formem aldeídos
· Aldeídos + reagente de Schiff = coloração vermelha magenta nos locais de ligação entre os dois
· Água quente – serve para intensificar a tonalidade magenta
· Esta coloração também reage com fungos – Candida albicans, histoplasma capsulum, etc
· Diagnóstico diferencial de tumores
O que cora?
· Substâncias PAS+ = magenta, rosa, púrpura
· Núcleos – azuis
Doenças
· Diagnóstico diferencial entre adenocarcinoma (PAS+) e carcinoma (PAS-)
· Metaplasia intestinal
· Demonstra fungos (patologia inflamatória – pele)
Carmin de Best
Protocolo
· Não encontrei
Fundamento
· Técnica muito seletiva para – demonstra o glicogénio
O que cora?
· Glicogénio
Doenças
· Carcinoma do fígado e pulmão
· Seminoma
· Mesotelioma
Tricrómico Masson
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Sensibilizar com solução aquosa de cloreto de mercúrio
· Lavar na água corrente
· Remoção do pigmento de mercúrio com a utilização de uma solução iodada
· Lavar rapidamente
· Corar com hematoxilina Verhoeff
· Diferenciar em álcool etílico
· Corar com fucsina
· Lavagem rápida
· Diferenciar com ácido fosfomolíbdico
· Escorrer o ácido
· Corar com solução verde luz
· Secar a lâmina
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Utiliza dois corantes ácidos semelhantes que coram de maneira diferente as estruturas
· Primeiro corante – cora as estruturas todas do tecido (utiliza se um mordente para o retirar das estruturas não desejadas)
· Segundo corante – utilização de um corante com uma tamanho molecular elevado
· Hematoxilina férrica – aplicada para conferir cor aos núcleos (mantem-se resistente à descoloração por soluções ácidas)
· É possível distinguir o colagénio do musculo
· Identifica – elevadas quantidades de colagénio no tecido
· Utilizado principalmente para diferenciar entre colagénio e musculo liso num tumor
· Aumento de colagénio como acontece em casos de cirrose
Princípio – A molécula de menor matriz penetra e colora um elemento do tecido, mas quando a molécula com maior matriz penetra no mesmo elemento do tecido, a molécula menor é substituída pela maior
O que cora?
· Núcleo - Preto
· Colagénio e muco – Azul ou azul-esverdeado
· Citoplasma, musculo, eritrócitos, queratina – vermelho
Desvantagens
· Secções que estejam demasiado fixadas em formalina ficam mal coradas
· Demasiada diferenciação com ácido acético faz com que a cor azul pareça desbotada
Doenças
· Carcinoma espinocelular
· Rabdomiossarcoma
· Cirroses hepáticas
Técnicas de Eleição fibras elásticas:
· Verhoeff –mais indicado para enfisema pulmonar e aterosclerose
- Fibras elásticas – Negro
- Núcleos – Castanho
-Colagénio – Vermelho
- Outras estruturas - Amarelo
· Orceína – enfisema pulmonar e aterosclerose
- Fibras elásticas – Castanho-escuro
- Núcleos – Azul
- Colagénio - Vermelho
· Weigert – Enfisema pulmonar e Nefrosclerose
- Fibras elásticas – Púrpura/ azul-negro
- Citoplasma – Rosa
Técnicas de eleição Reticulina:
· Métodos de prata amoniacal
- Gomori – cirrose hepática, carcinoma e sarcoma
Fibras – Preto
Colagénio – Cinzento
Fundo – Vermelho (van Gieson) / verde (verde luz)
- Gordon and Sweet - o mesmo de cima
Fibras – Preto
Colagénio – Cinzento
Fundo – verde (verde luz) / vermelho (van Gieson)
· Métodos de Prata Metanamina
- P.A.S.M
Van Gieson
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Corar com Hematoxilina Weigert (deve ser a férrica)
· Lavar na água corrente
· Diferenciar com álcool ácido
· Lavar em água corrente
· Corar com Van Gieson
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Coloração tricrómica – Hematoxilina férrica (para os núcleos), corante ácido (pícrico e cora o citoplasma) e fucsina ácida (coloração seletiva do colagénio)
· Como o Van Gieson é um corante alcoólico a lâmina precisa de ser desidratada primeiro com álcool 95% e caso não aconteça pode arrastar a coloração
· Distinção entre fibras de colagénio e fibras musculares em alterações fibróticas ou processos de fibrose – Aumento de colagénio
Princípio – O ácido pícrico confere ao meio um pH ácido (pH tem de estar entre 1,5 e 3,0 senão não ocorre a coloração diferencial) o que ajuda na formação de complexos com afinidade para o colagénio. 
O que cora?
· Núcleos – tonalidade negra
· Colagénio – Vermelho 
· Citoplasma, musculo, fibrina e eritrócitos - Amarelos
Doenças
· Cirrose hepática
· Pielonefrite
· Doenças neuromusculares
Desvantagens
· Não lavar com água após utilização do reagente de Van Gieson uma vez que compromete a coloração
· Existe tendência para a cor vermelha desvanecer seja qual for o meio de montagem utilizado
· Caso o ácido pícrico não esteja saturado a cor do colagénio, citoplasma e musculo vai ser igual 
Gordon e Sweet
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Com o permanganato de potássio faz-se a oxidação dos cortes
· Lavar em água destilada 
· Descorar com ácido oxálico 
· Lavar em água destilada
· Tonar os cortes mais recetivos com alúmen férrico
· Impregnar com solução de prata amoniacal
· Redução da prata com formalina
· Lavar em água corrente
· Intensificar com cloreto de ouro
· Lavar com água destilada
· Fixar com tiossulfato de sódio
· Lavar com água corrente
· Contraste com vermelho neutro - opcional
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Permanganato de Potássio oxida as fibras de reticulina pelo que as mesmas adquirem mais conexão para os sais de prata
· Ácido oxálico – retira o excesso até branquear 
· Mordente (alúmen de ferro) – prepara o tecido para a admissão dos sais de prata
· Solução de cloreto de Ouro que com a redução a ouro metálico promove a oxidação da prata metálica em iões de prata
· Tiossulfato de Sódio – formação de complexos de prata solúveis com prata iónica não reativa no tecido, pelo que remove e reduz a marcação inespecífica da prata metálica
· Contraste – Vermelho neutro ou corante nuclear 
· Desvantagem:
- o fundo e os núcleos têm menos coloração
O que cora?
· Fibras reticulares – Negro/ Dourado
· Núcleos – Vermelho (opcional)
Doenças
· Identificação de tumores de origem mesodérmica (produzem uma quantidade elevada de reticulina
· Cirrose hepática
· Lesões Renais
· Diagnóstico diferencial:
- Carcinoma - organizado em nichos de células tumorais
- Sarcoma – Cada célula é rodeada de reticulina
- Cirrose hepática – reticulina com padrão descontinuo
Orceína - Giemsa 
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar até ao álcool 70%
· Submersão da lâmina na solução de Orceína
· Lavar na água corrente
· Corar com solução Giemsa ON
· Diferenciar com álcool 95%
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Demonstração de componentes do tecido conjuntivo cutâneo, grânulos do epitélio cutâneo, mucinas
· Reage com elementos sulfatados do tecido conjuntivo o que faz com que o mesmo core
· Intensidade ideal – utilizar solução Giemsa sobrecorando com a mesma os tecidos
· Diferenciada porque se recorre ao uso de uma solução alcoólica
O que cora?
· Estruturas ricas em – mucinas ácidas – Azul-escuro
Doenças
· Patologias – alterações da membrana basal assim como a sua função
Vermelho do Congo
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Corar com Vermelho do Congo
· Diferenciar com hidróxido potássio alcoólico
· Lavar em água
· Contrastar com hematoxilina (alumínio)
· Diferenciar e azular
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Coloração que demonstra a presença de amiloide (substância extracelular fibrilar)
· Principio -Vermelho do congo tem afinidade seletiva para amiloide por isso liga-se através de ligações de hidrogénio não polares que é o que vai proporcionar a birrefringência verde quando observado à luz polarizada
· Amilose – extracelular, amorfo, material eosinofílico
O que cora?
· Depósitos de amiloide/ fibras elásticas amiloide - vermelho
· Luz polarizada apenas com amiloide – Verde maçã (Granny Smith)
· Núcleos - azul
Doenças
· Metaplasias intestinais
· Carcinoma gástrico
Ação do corante
· Direta – afinidade do corante para com o tecido que consequentemente se liga
· Indireta – é necessário um composto (mordente) para promover a ligação entre corante e tecido
Tempo de coloração
· Progressiva – sequencia definida que tem o objetivo de alcançar a intensidade de coloração desejada 
· Regressiva – sobrecoloração de todo o tecido/ estruturas com afinidade para determinado corante para ser de seguida removido através da ação de um diferenciador
Ação do corante
· Monocrómica – 1 cor
· Bicrómica – 2 cores
· Tricrómica – 3 cores
· Policromia – mais de 3 cores
Genéricas
· Arquitetura geral do tecido (HE)
Especificas
· Demonstração de um elemento do tecido (PAS, Perls, Van Gieson, etc)
Impregnação através de metais pesados
· Estrutura através de impregnação de metais (Gomori, PASM, etc)
· Metal utilizado normalmente é a prata que é reduzida a uma forma visível que precipita sobre o tecido
· Reação argentafim – existência de substâncias no tecido que reduzem a prata metálica (substâncias argentafins; melanina na técnica de Masson)
· Reação argirofilica – agente redutor externo é adicionado para realizar a redução da prata que é designado por argirofilas (fibras de reticulina na técnica de Gomori)
· Microscopia eletrónica
- Visa a observação da ultraestrutura das célula
- Varrimento e transmissão
- Feixe de eletrões que interage com a amostra
- Coloração é feita através da deposição de metais pesados (tetróxido de ósmio, acetato de uracilo, citrato de chumbo)
Metacromasia
· Cromotropo – estruturas tecidulares que adquirem coloração diferente do corante original (grânulos de mastócitos, tecido conjuntivo, cartilagem, amiloide)
· Têm a capacidade de corar determinadas estruturas com uma cor diferente da sua
· Ortocromatiza – coloração que não muda a sua cor original quando presente sobre o tecido a corar
Fatores que influenciam a coloração dos tecidos
Ph – alterações no pH pode alterar polarização das moléculas e influenciar a cor
Força iónica dos corantes – mais força maior capacidade para corar as estruturas desejadas
Fixação dos tecidos – certos fixadores podem alterar a polarização das estruturas a corar
Concentração do corante – mais concentração maior ligação do corante ao tecido (mais moléculas em solução)
Pureza do corante – as impurezas dos corantes afetam a capacidade de coloração
Temperatura – mais temperatura logo maior distribuição do corante pelos tecidos
Absorção dos corantes pelas estruturas – mais absorção quanto maior for a afinidade
Solubilidade co corante – molécula maior de corante menor difusão pelo tecido
Densidade das estruturas – mais densidade logo mais intensidade (núcleo num gânglio)Geometria das estruturas – facilidade de coloração para estruturas finas ou isoladas (citologia)
Permeabilidade das estruturas – mais permeáveis mais difícil de corar porque deixam passar o corante. Menos permeáveis é ideal porque retém corante
Hidratos de Carbono
O que são?
· Células teciduais encontram-se numa matriz aquosa viscoelástica ricas em hidratos de Carbono
· Tem como função auxiliar no metabolismo celular, adesão celular, atividades enzimáticas, regulação de proliferação
· Ajudam a caracterizar patologias (inflamação, Neoplasia, autoimunes, doenças infeciosas)
· Maiores componentes dos hidratos de carbono? Glicogénio e mucinas
· As mucinas podem classificar-se em? Ácidas fortemente ou fracamente sulfatadas ou neutras
Mucinas neutras
· Não tem ácidos reativos
· PAS positivas
· Origem epitelial – células de revestimento gástrico e em várias células epiteliais muco-secretoras do trato GI e respiratório
Mucinas ácidas
· pH baixo com corantes catiónicos = PAS negativas
· Pouco ácidas ao reagir com um pH mais elevado com corantes catiónicos = PAS positivas
Mucinas (glicoconjugados)
· Localização – tecido conjuntivo e epitelial
· Função – lubrifica e protege as células e tecidos das imediações
· Doença associada – deteta as mucinas presentes num tumor e ajuda a identificar a sua malignidade
Proteoglicanos (glicoconjugada tecido conjuntivo)
· Localização – cartilagem, tendões, ligamentos, vasos sanguíneos, válvulas do coração e pele
· Função – atração de água para o tecido e atua como um estabilizador e suporta todos os elementos fibrosos do tecido conjuntivo
· Doença associada – vários sarcomas e alguns carcinomas
Polissacárido (glicogénio)
· Localização – Fígado, musculo esquelético, muscular cardíaca, entre outros
· Função – Reserva de hidratos de carbono (energia)
· Doença associada – várias malignidades (sarcoma de Ewing, seminoma) ou desordens no armazenamento do glicogénio (fígado evidencia acumulações massivas de glicogénio)
Resultados falso negativos de amiloidose podem ser devido a:
· Devido a quantidade insuficiente de material
· Técnica de coloração inadequada
· Utilização incorreta dos materiais de polarização e intensidade de luz insuficiente
Análise Imunohistoquímica do tecido adiposo – simplifica a deteção automatizada de amiloide pelo que a experiência e dedicação do observador não é um fator de avaliação
Análise negativa, mas existe uma grande suspeita clínica de que é positivo – faz-se uma biópsia dirigida a um órgão suspeito de ter acumulação de amiloide 
Histoquímica – combinação das disciplinas de Histotecnologia, química orgânica e bioquímica
Definição – estudo de células e componentes tecidulares através da reação química que os diferenciam e permite visualização ao microscópico (obtém-se um diagnostico diferencial fidedigno)
Corantes não vitais – aplicado para corar tecidos previamente fixados
Corantes vitais – cora células em cultura e por isso utilizam-se corantes que não provocam dano à célula
Segundo teste
Fontana Masson
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Solução de nitrato de prata amoniacal a 10%
· Passar em água destilada
· Tratar com solução de tiossulfato de sódio
· Passar em água destilada
· Contrastar com vermelho neutro
· Lavar em água
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Com o poder redutor da melanina existe a transformação do sal de Ag em prata metálica
· Não especifica para melanina
· Objetivo principal – diferenciação entre pigmentos de cor acastanhada ou a sua localização exata
O que cora?
· Melanina – preto/ castanho-escuro
· Luz polarizada apenas com amiloide – Vermelho
Doenças
· Tumores dos melanócitos
Fouchet-Sirius Red
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Reagente de Fouchet
· Lavar em água destilada
· Contrastar com Sirius Red
· Secar ao ar
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Oxida a bilirrubina em biliverdina
· Coloração de fibras de reticulina e colagénio que rodeiam os hepatócitos
· Objetivo – identificação mais rápida quando a concentração de bilirrubina é reduzida
O que cora?
· Pigmentos de bílis – verde acastanhado
· Músculo – amarelo
· Fibras de reticulina e colagénio – vermelho
Doenças
· Identificação de doença metabólica a nível da bilirrubina??
Azul da Prússia de Perls
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Solução de ferrocianeto de potássio acidificada
· Lavar em água destilada
· Contrastar com eritrosina ou vermelho neutro
· Lavar com água destilada
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Identifica e deteta ferro ferroso (Fe3+)
· O ferro ferroso reage com ferrocianeto de potássio e adquire coloração azul-escuro que é característico de ferrocianeto férrico
· Objetivo – distinção entre pigmentos de cor acastanhada e hemossiderina
O que cora?
· Depósitos de ferro/ ferro ferroso – azul
· Núcleos – vermelho
Doenças
· Depósitos de ferro ferroso (hemossiderose)
Gram (em cortes de parafina)
Protocolo
· Desparafinar e hidratar
· Corar com solução filtrada de violeta de cristal
· Lavar os cortes com solução de iodina
· Diferenciação com álcool-acetona
· Lavar em água corrente
· Contrastar com vermelho neutro
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· A diferença de coloração depende da parede celular de cada uma das bactérias
· Gram positiva – camada de peptidoglicanos que retêm o corante (os poros por ação do mordente e a diferenciação não afeta)
· Gram negativa – possuem maior quantidade de lípidos na membrana celular e uma camada mais fina de peptidoglicano
· Solução de iodada (mordente) – que serve para fechar intensificar a cor 
· Álcool-acetona – vai diferenciar (‘varre’ a primeira camada de peptoglicanos dos Gram negativos e possibilita a ação do 2º corante)
· Violeta de Cristal - possui maior lipossolubilidade e é três vezes mais solúvel em álcool que a fucsina e é também um corante catiónico (básico) pelo que tem uma maior afinidade para com a cromatina nuclear assim como para com as outras estruturas (que são ácidas/ aniónicas); após fechar os poros não é possível remover
O que cora?
· Gram negativas – azul
· Gram positivas – vermelho
· Fundo – vermelho
Cuidados:
· Diferenciação – preciso ter atenção ao tempo (demasiado tempo leva à remoção de todo o corante de todas as bactérias)
· Mordente (iodo) – formação de um complexo com o violeta de Cristal que vai tornar o complexo menos lipofílico e acelera a remoção do corante das Gram negativas
Doenças 
· H pylori – gram+ - neoplasia gástrica
· Treponema pallidum – gram- - causa sífilis 
Ziehl-Neelsen (em cortes de parafina)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Corar com carbolfucsina a 65º
· Escorrer o corante das lâminas e deixar secar ao ar
· Diferenciar cem álcool ácido
· Lavar com água corrente
· Contraste com azul de metileno
· Passar por água
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Microrganismos ácido-resistentes – muitos não coram através da técnica de Gram embora alguns Gram negativos possam ser evidenciados e esta técnica é mais agressiva o que possibilita isto
· Fucsina básica – liga-se às cadeias de ácido micólico dos lípidos insaturados que se encontram na membrana celular das micobactérias
· Fucsina – menos liofilica que o violeta de cristal o que torna a penetração do corante mais difícil e por isso para sobrepor a barreira adiciona-se fenol à solução
· Quando o corante se liga aos grupos ácidos da membrana é impossível remover o corante mesmo que se recorra a soluções ácidas ou alcoólicas 
O que cora?
· Bacilos álcool-ácido resistentes (Koch e Hansen) – Vermelho
· Fundo – Azul
Doenças/ aplicações
· Tuberculose
· Lepra
Fite – Mycobacterium leprae (técnica de Wade Fite??)
Protocolo
· Começar por desparafinar em Xilol-óleo amendoim
· Corar com carbolfucsina 
· Escorrer o corante das lâminas e deixar secar ao ar
· Diferenciar com ácido sulfúrico em álcool a 25%
· Lavar com água corrente
· Contraste com azul de metileno
· Passar por água
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Pelo que entendi esta é uma modificação á técnica de Ziehl-neelsenporque a cápsula desta micobactéria tem menor camada lipídica e por isso é menos ácido-álcool resistente assim como é menos resistente aos solventes orgânicos 
· Óleo de amendoim na desparafinação – ajuda na conservação da camada lipídica e numa diferenciação mais suave
O que cora?
· Mycobacterium leprae – Vermelho
· Fundo – Azul-pálido
Doenças/ aplicações
· Tuberculose
· Lepra
Warthin-Starry
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar (acho que tem de ser incluído em celoidina)
· Tampão de acetato
· Passar para uma solução de nitrato de prata e incubar a 60º
· Passar as lâminas para a solução reveladora e manter em banho-maria a 60º
· Lavar com água quente
· Passar para o tampão de acetato
· Passar por água
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento/ técnica
· Técnicas que utilizem prata permite diagnóstico quando a morfologia das bactérias é característica (espiroquetas)
· Utilização de celoidina que é, tal como a parafina, utilizado para realizar a inclusão
· Revelação – solução de prata liga-se às bactérias e depois é reduzida a prata visível pela hidroquinona que é o revelador
O que cora?
· Helicobacter pylori – preto
· Espiroquetas – preto
· Fundo – amarelo-dourado ou castanho
Doenças
· Gastrite devido a ação de H. pylori
· Gastrite crónica
Giemsa Modificada (em cortes de parafina)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Solução de Giemsa a 4%
· Lavar em água 
· Diferenciar com solução álcool acético ou álcool
· Diafanizar e montar
Fundamento
· Identifica e deteta ferro ferroso (Fe3+)
· O ferro ferroso reage com ferrocianeto de potássio e adquire coloração azul-escuro que é característico de ferrocianeto férrico
· Objetivo – distinção entre pigmentos de cor acastanhada e hemossiderina
O que cora?
· Depósitos de ferro/ ferro ferroso – azul
· Núcleos – vermelho
Doenças
· Gastrite crónica
Grocott (em cortes de parafina)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Oxidar cortes com ácido crómico
· Lavar em água corrente e de seguida em água destilada
· Lavar com bissulfito de Na
· Lavar com água corrente e depois água destilada
· Submergir lâminas numa solução de prata e incubar a 60º
· Várias lavagens em água destilada
· Tratar com cloreto de ouro
· Várias lavagens em água destilada
· Fixar em tiossulfito de Na
· Contrastar com verde luz
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Técnica de eleição para demonstrar fungos
· Impregnação por prata assim como a sua redução através dos grupos aldeído que surgem após ocorrer a oxidação dos componentes celulares do fungo pelo ácido crómico
O que cora?
· Fungos – delineados a negro
· Fundo – verde-pálido/ verde
Doenças
· Candidíase
Gridley (em cortes de parafina)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Oxidação dos cortes com ácido crómico
· Lavar em água corrente
· Reagente Schiff
· Lavar com solução ácida
· Corar com fucsina aldeídica
· Lavem alcoólica, seguida de lavagem com água corrente
· Contrastar com amarelo de metalino
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Permite visualização detalhada da estrutura interna do fundo comparada com Grocott
· Falível quando se pretende identificar fungos em pequena concentração no tecido
· Técnica é um PAS modificado (protocolo semelhante)
O que cora?
· Fibras elásticas – Azul
· Hifas e esporos – Vermelho
· Fundo - Amarelo
Substâncias Exógenas
Carvão
Sílica
Asbestos
Silicone
Talco
Pó de luvas (amido)
Pigmentos artefactos
Formalínico
Mercúrio
Dicromato
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