Técnicas Citohistoquimicas

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Técnicas Citohistoquímicas 		Resumo
Índice
Colorações	7
Composição da luz branca e complementares	7
Auxocromo e cromóforos	8
Classificação de corantes	9
Mecanismo de ligação	9
Tecido Conjuntivo	10
Fibras de colagénio	10
Fibras Elásticas	10
Técnicas de Eleição fibras elásticas:	10
Fibras de Reticulina	11
Técnicas de eleição:	11
Membrana Basal	11
Hidratos de Carbono	12
O que são?	12
Mucinas neutras	12
Mucinas ácidas	12
Mucinas (glicoconjugados)	12
Proteoglicanos (glicoconjugada tecido conjuntivo)	12
Polissacárido (glicogénio)	12
Amiloide	13
Introdução	13
Tipos de amiloidose	13
Sintomas	14
Amiloidose primária:	14
Amiloidose secundária	14
Amiloidose Hereditária	14
O que cora?	14
Patologia Gástrica	15
Gastrite Crónica	15
Neoplasia Gástrica	15
Patologia Hepática	15
Cirrose Hepática	15
Hepatocarcinoma	15
Alteração hialina de Mallory	15
Pigmentos	16
Substâncias Endógenas:	16
Melanina	16
Hemoglobina e Mioglobina	16
Bilirrubina e Biliverdina	17
Ferro	17
Substâncias Exógenas	17
Carvão	17
Sílica	18
Asbestos	18
Silicone	18
Talco	18
Pó de Luvas	18
Artefactos	19
Pigmento Formalínico	19
Pimento de Mercúrio	19
Pigmento de Dicromato	19
Microrganismos	19
Bactérias	20
Cocos – Estafilococos	21
Cocos – Estreptococos	21
Cocos – Neisseria	21
Bacilos – Micobactérias	21
Bacilos Gram + e Gram –	21
Bactérias curvas ou espirais	22
Bactérias filamentosas/ miceles	22
Micobactérias	22
Fungos	22
Classificação histológica	23
Filamentosos	23
Esporulares	23
Idênticos a esporos	23
Dimórficos	23
Dermatofíticos	23
Micoses Profundas	23
Candida albicans	23
Aspergillus	24
Criptococcus neoformans	24
Histoplasma capsulatum	24
Protozoários	24
Entamoeba histolytica	25
Giardia lamblia	25
Trichomonas hominis	25
Leishmania	25
Plasmódio de Malária	25
Toxoplasmose	25
Pneumocystis carinii	26
Helmintos (verme parasita)	26
Vírus	26
Herpes	26
Citomegalovirus	27
Aplicações em anatomia patológica	27
Protocolos para 2º teste	27
Fontana Masson	27
Protocolo	27
Fundamento	27
O que cora?	27
Doenças	28
Fouchet-Sirius Red	28
Protocolo	28
Fundamento	28
O que cora?	28
Doenças	28
Azul da Prússia de Perls	29
Protocolo	29
Fundamento	29
O que cora?	29
Doenças	29
Gram (em cortes de parafina)	30
Protocolo	30
Fundamento	30
O que cora?	30
Cuidados:	30
Doenças	30
Ziehl-Neelsen (em cortes de parafina)	31
Protocolo	31
Fundamento	31
O que cora?	31
Doenças/ aplicações	31
Fite – Mycobacterium leprae (técnica de Wade Fite??)	32
Protocolo	32
Fundamento	32
O que cora?	32
Doenças/ aplicações	32
Warthin-Starry	32
Protocolo	32
Fundamento/ técnica	32
O que cora?	33
Doenças	33
Giemsa Modificada (em cortes de parafina)	33
Protocolo	33
Fundamento	33
O que cora?	33
Doenças	33
Grocott (em cortes de parafina)	33
Protocolo	33
Fundamento	34
O que cora?	34
Doenças	34
Gridley (em cortes de parafina)	34
Protocolo	34
Fundamento	34
O que cora?	34
Exógenos - continuação	35
Cálcio	35
Cobre	35
Técnica de Rodadina	35
Protocolo	35
Fundamento	35
O que cora?	35
Doenças	36
Von Kossa	36
Protocolo	36
Fundamento	36
O que cora?	36
Doenças	36
Lipofuscina	36
Histoquímica Enzimática	37
Fixação	37
Biópsia do Colon	38
Biópsia musculo	38
Histoquímica – combinação das disciplinas de Histotecnologia, química orgânica e bioquímica
Definição – estudo de células e componentes tecidulares através da reação química que os diferenciam e permite visualização ao microscópico (obtém-se um diagnostico diferencial fidedigno)
Corantes não vitais – aplicado para corar tecidos previamente fixados
Corantes vitais – cora células em cultura e por isso utilizam-se corantes que não provocam dano à célula
Colorações
· Corantes não vitais – Hematoxilina, eosina, fucsina, entre outros
· Corantes vitais – azul de metileno, entre outros
· Para que se possa visualizar as estruturas teciduais ao microscópio é necessário aplicar corantes uma vez que o tecido é transparente após passar pelas variadas fases da Histotecnologia
· Objetivo – atribuição de cor às células e seus constituintes para que se possa visualizar e distinguir ao MO
· Histoquímica é uma das técnicas mais antigas no estudo das células (expandiu-se nos anos 50)
· Existem vários tipos de protocolo de coloração que ainda são utilizados em anatomia patológica
· Tecidos de origem animal – transparentes (com exceção dos tecidos que tenham vitais
· )
Composição da luz branca e complementares
· Luz do sol – luz ‘branca’ (é uma composição de cores)
· Isaac Newton era um génio – utilização de prisma para separar as várias cores
· Fenómeno de dispersão/ decomposição da luz solar
· Luz – radiação de natureza eletromagnética
· Cores – todas têm diferentes ondas eletromagnéticas (diferenciam-se através do comprimento de onda)
· Cor de um objeto – Fatores:
- Características físicas do objeto
- Iluminação
- Estrutura do nosso sistema visual
- Objetos opacos – depende da absorção/ reflexão de determinadas ondas eletromagnéticas (ou seja, a maçã é vermelha porque reflete essa cor e absorve as outras todas)
- A cor também vai depender do comprimento de onda (cor) que incide sobre o objeto
· A luz visível chega à retina (que tem cones que são células sensíveis à radiação visível e estão agrupados de acordo com o comprimento de onda a que são mais sensíveis)
· Cores percecionadas => combinação de estímulos que recebemos dos 3 tipos de cones
Efeito batocromo - efeito que provoca a alteração na banda de absorção para comprimentos de onda maiores (deslocam-se para o vermelho)
Efeito hipsocromo - feito que provoca a alteração na banda de absorção para comprimentos de onda menores (deslocam-se para o violeta)
Corantes – compostos orgânicos, aromáticos e ionizáveis que estão fundamentalmente baseados na estrutura do benzeno; tem a capacidade de se ligar e atribuir cor a uma determinada estrutura tecidular
Corantes naturais – obtidos através de plantas, animais ou minerais 
Corantes sintéticos – corantes artificiais sintetizados em laboratório (tem muitas vezes origem nos naturais) e são mais baratos, cor mais intensa, mais fáceis de utilizar; primeiro corante – mauveina (Willian Henry Perkin, 1856)
Auxocromo e cromóforos
· Anéis aromáticos – ligados através de grupos que se designam Cromóforos (N=N) que são responsáveis pela cor 
· Para promover a ligação entre o tecido e intensificar a cor adicionam-se os auxocromo
· Cromóforo:
- Mais importantes – C=O (carbonilo); C=C (etileno); C=N (imina); N=N (nitroso); NO2 (nitroso)
- Mais cromóforos – mais intensidade cor
- Absorve radiação no espectro do visível (excitação da molécula e consequente normalidade que liberta energia sob a forma de radiação eletromagnética)
· Cromogéneo – complexo que formado pelo anel de benzeno e o grupo cromóforo
· Auxocromo:
- Não atribui cor à molécula, mas tem a capacidade de a intensificar/ alterar a cor de um determinado corante porque alteram o comprimento de onda que é absorvido e depois emitido (efeito batocromo) também podem potenciar a capacidade de ligação à molécula que vai ser corada
- Mais comuns: -OH (hidroxilo); -CHO (aldeído); -NH2 (amina); -SCH3 (metilmercaptano); -F, -CL, -Br, -I (halogênios)
Classificação de corantes
· ÁCIDOS 
- Carga elétrica negativa (auxocromo aniónico) 
- Afinidade para estruturas acidófilas do tecido (bases) que tenham carga negativa (Ex: citoplasma)
- Ex: eosina, fucsina ácida
· BÁSICOS
- Carga elétrica positiva (auxocromo catiónico) 
- Afinidade para estruturas basófilas do tecido (bases) que tenham carga positiva (Ex: ácidos nucleicos no núcleo)
- Ex: hematoxilina, azul de toluidina
Mecanismo de ligação
- Intramoleculares (iónica/ electroestática, covalente)
- Intermoleculares (van der waals, hidrogénio)
Iónica – forças electroestáticas/ atração entre iões de cargas opostas; doação de eletrões entre átomos
Covalentes – partilha de eletrões e ocorre normalmente entre átomos com 4 a 7 eletrões na camada de valência (pode ser simples como o CL2, dupla como o O2, tripla como o N2 ou dativa como o SO2)
Van Der Waals – atração entre nuvens de eletrões e núcleos de átomos; podem ser forças de Keeson (dipolo-dipolo que é entre moléculas dos polos) / forças de Debye (dipolo-dipoloinduzido que é dipolo-nuvem eletrónica) / forças de London (dipolo instantâneo-dipolo induzido)
· Ligações de Hidrogénio
- Resultam da atração mútua entre átomo de hidrogénio com carga positiva e um átomo muito negativo (O, F, N)
- Ligações intermoleculares mais fortes
Tecido Conjuntivo
Fibras de colagénio
· Colagénio – sintetizado e secretado pelas células do tecido conjuntivo
· É uma proteína fibrosa que confere elasticidade aos tecidos
· Localização – pele, ossos, tendões, cartilagem, vasos sanguíneos
· Apresenta cor branca e em lâmina fica rosa quando corada com HE (por causa da eosina)
· Tipos de colagénio
- Tipo I – corado com corantes ácidos (eosina, picro-sirius); tendões and so on
- Tipo II – Coram de vermelho com o sirius red; cartilagem hialina e elástica
- Tipo III – Associado ao tipo I
-Tipo IV – Lâmina basal do tecido epitelial
- Tipo V – vasos e artérias assim como em membranas fetais
Fibras Elásticas
· Coram com eosina, mas para distinguir melhor utilizam-se corantes especiais (Orceína, van Gieson)
· Fibras elásticas = núcleo central + um anel de microfibrilas
· Localizam-se preferencialmente nas artérias elásticas, ligamento vertebrais e na laringe
· Patologias?
- Enfisema pulmonar
- Aterosclerose
- Nefrosclerose
- Aneurisma
Técnicas de Eleição fibras elásticas:
· Verhoeff – mais indicado para enfisema pulmonar e aterosclerose
- Fibras elásticas – Negro
- Núcleos – Castanho
-Colagénio – Vermelho
- Outras estruturas - Amarelo
· Orceína – enfisema pulmonar e aterosclerose
- Fibras elásticas – Castanho-escuro
- Núcleos – Azul
- Colagénio - Vermelho
· Weigert – Enfisema pulmonar e Nefrosclerose
- Fibras elásticas – Púrpura/ azul-negro
- Citoplasma – Rosa
Fibras de Reticulina
· Rede de suporte para os constituintes celulares de vários órgãos e tecidos
· Formam rede delicada (células parenquimatosos como glândulas endócrinas) e rede flexível (órgão que tenham mudanças de volume ou forma como o baço, fígado e artérias)
· Abundante no musculo liso (órgãos hematopoiéticos)
· Colagénio tipo III – glicoproteína e proteoglicanos
· Reticulina – PAS positivo
· Visíveis quando estão coradas de preto devido à impregnação com sais de prata 
Técnicas de eleição:
· Métodos de prata amoniacal
- Gomori – cirrose hepática, carcinoma e sarcoma
Fibras – Preto
Colagénio – Cinzento
Fundo – Vermelho (van Gieson) / verde (verde luz)
- Gordon and Sweet - o mesmo de cima
Fibras – Preto
Colagénio – Cinzento
Fundo – verde (verde luz) / vermelho (van Gieson)
· Métodos de Prata Metanamina
- P.A.S.M
Membrana Basal
· Suporte elástico e serve de barreira filtrante
· Constituintes – proteínas, colagénio IV e laminina
· Patologias – Alteração na estrutura e função da membrana basal
· Desvantagem – Identificação com coloração HE é difícil, mas como possui uma grande quantidade de hidratos de carbono é PAS positivo
Hidratos de Carbono
O que são?
· Células teciduais encontram-se numa matriz aquosa viscoelástica ricas em hidratos de Carbono
· Tem como função auxiliar no metabolismo celular, adesão celular, atividades enzimáticas, regulação de proliferação
· Ajudam a caracterizar patologias (inflamação, Neoplasia, autoimunes, doenças infeciosas)
· Maiores componentes dos hidratos de carbono? Glicogénio e mucinas
· As mucinas podem classificar-se em? Ácidas fortemente ou fracamente sulfatadas ou neutras
Mucinas neutras
· Não tem ácidos reativos
· PAS positivas
· Origem epitelial – células de revestimento gástrico e em várias células epiteliais muco-secretoras do trato GI e respiratório
Mucinas ácidas
· pH baixo com corantes catiónicos = PAS negativas
· Pouco ácidas ao reagir com um pH mais elevado com corantes catiónicos = PAS positivas
Mucinas (glicoconjugados)
· Localização – tecido conjuntivo e epitelial
· Função – lubrifica e protege as células e tecidos das imediações
· Doença associada – deteta as mucinas presentes num tumor e ajuda a identificar a sua malignidade
Proteoglicanos (glicoconjugada tecido conjuntivo)
· Localização – cartilagem, tendões, ligamentos, vasos sanguíneos, válvulas do coração e pele
· Função – atração de água para o tecido e atua como um estabilizador e suporta todos os elementos fibrosos do tecido conjuntivo
· Doença associada – vários sarcomas e alguns carcinomas
Polissacárido (glicogénio)
· Localização – Fígado, musculo esquelético, muscular cardíaca, entre outros
· Função – Reserva de hidratos de carbono (energia)
· Doença associada – várias malignidades (sarcoma de Ewing, seminoma) ou desordens no armazenamento do glicogénio (fígado evidencia acumulações massivas de glicogénio)
Amiloide
Introdução
· Amiloide - substância de natureza proteica que se deposita no espaço extracelular de vários tecidos
· Amiloidose – grupo de doenças raras que se caracterizam pela acumulação desta proteína em vários tecidos; são doenças progressivas e potencialmente fatais.
· Problema – proteínas dobradas numa configuração altamente estável e rígida (folhas de praguejamento ‘’beta’’); o diagnóstico costuma ser tardio (pelo que está numa fase mais avançada)
· Como é que a birrefringência à luz polarizada acontece? Porque as proteínas ao agregarem-se formam fibrilas e com a aplicação de vermelho do congo produz birrefringência à luz polarizada. 
· Vários tipos de amiloidose – definem-se de acordo com a proteína que forma as fibras de amiloides e a distribuição dos depósitos
· Quanto à distribuição – pode ser sistémica ou localizada
· Amiloidose sistémica – mais comum e pode afetar variados órgãos como coração, rins, intestino/ trato gastrointestinal, músculos, pele, ligamentos, articulações, baço, pâncreas, fígado, nervos, o que provoca a falência de órgãos
Tipos de amiloidose
1. Sistémica – alta mortalidade por causa da deposição lenta de amiloide em órgãos vitais
· Serum amyloid A (AA) – associada a doenças inflamatórias
· Cadeias leves das imunoglobulinas (AL) – associado a mieloma múltiplo
· Cadeias pesadas (AH) - genética 
· Proteínas ligadas com amiloidose hereditária = transtirretina, lisozima, apolipoproteína, gelsolina e cistatina
· Terapêutica = depende da fase em que a doença se encontra e vai ajudar a diminuir ou impedir a deposição destas proteínas 
· Diagnóstico – coloração com vermelho do Congo que confere uma aparência vermelho/ laranja no MO de luz e tem birrefringência com luz polarizada
- Teste de positividade por vermelho do Congo:
-> elevado em tecidos com evidencias clínicas
-> é possível confirmar com biópsia ou aspiração de gordura abdominal (o que confere a esta técnica ma vantagem uma vez que não é necessário realizar exames mais invasivos)
-> ausência de positividade na coloração da amostras não exclui o diagnóstico de amiloidose
Sintomas 
Amiloidose primária:
· Doença cardíaca e arritmia
· Doença renal, incluindo insuficiência
· Distúrbios gastrintestinais, como perfuração, sangramento, dismotilidade e obstrução
· Hepatomegalia
· Redução da função do baço
· Insuficiência adrenal e outras glândulas
· Neuropatia (pode levar a impotência, problemas do GI, hipotensão ortostática)
· Síndrome do túnel do carpo
· Alterações neurológicas (espessamento, mudança de cor, púrpura ao redor dos olhos
· Aumento na língua, dificulta a respiração e provoca apneia noturna
· Doenças pulmonares
· Inchaço nas articulações dos ombros
· Facilidade de sangramento
Amiloidose secundária
· Doença renal, incluindo insuficiência (causa de óbito nos 40-60% dos casos)
· Hepatomegalia
· Esplenomegalia
Amiloidose Hereditária
· Distúrbios do sistema nervoso
· Distúrbios gastrointestinais (diarreia ou perda de peso)
· Doenças cardíacas
· Doenças renais
O que cora?
· Depósitos de amiloide:
- MO – vermelho/ laranja na zona de depósitos, mas pode originar falsos negativos
- Luz polarizada – verde maçã (tipo Granny Smith) para confirmar diagnóstico/ positividade
· Ph
Patologia Gástrica
Gastrite Crónica
· Proximidade da úlcera pode apresentar gastrite crónica que pode levar à formação de folículos linfoides
· Helicobacter pylori é o principal agente das gastrites crónicas e úlceras
· Coloração mais típica é por HE e Warthin-StarryNeoplasia Gástrica
· Adenocarcinoma gástrico é o mais comum de todos os tumores malignos gástricos
Patologia Hepática
Cirrose Hepática
· Pseudoglóbulos separados por traves de tecido fibroso denso
· Hepatócitos nos Pseudoglóbulos tem morfologia normal, sem esteatose e sem corpos de Mallory
· Dispostos em trabéculas como hepatócitos normais
· Normal – trabéculas radiadas, com trajeto de sangue que ocorre na periferia para o centro do lóbulo
· Nos Pseudoglóbulos esta arquitetura desaparece, trabéculas desorganizadas e hepatócitos regeneram-se, mas num padrão anárquico
· Cor menos intensa no tumor enquanto na cirrose se mantém um magenta vivo
Hepatocarcinoma
· Tumor maligno com origem nos hepatócitos que apresenta desorganização da arquitetura mais acentuada que na cirrose
· Hepatócitos neoplásicos estão distribuídos aleatoriamente (não formam trabéculas)
· Traves irregulares de fibrose que atravessa o tumor
· Apesar de maligno não se observa figuras de mitose ou áreas de necrose
Alteração hialina de Mallory
· Observação de células de tumor que apresentam um citoplasma com material cor rosa e homogéneo que se destaca através do citoplasma finamente granuloso
- Hepatócitos não neoplásicos não há corpúsculos de Mallory
Pigmentos
Pigmento – substância química que confere cor aos tecidos vivos; são solúveis na maioria dos solventes (exemplo: melanina)
Minerais – definem-se pela inclusão de toda a matéria inorgânica
Podem dividir-se em:
· Endógenos – melanina, hemoglobina e derivados, lipofuscina, Fe, Ca, Cu, entre outros
· Exógenos – Si, carvão, asbestos, talco, silicone, entre outros
· Artefactos – formalina, mercúrio, oxido de crómio, entre outros
- Os dados clínicos costumam identificar a substância pelo que é irrelevante a realização de técnicas de histoquímica
- As colorações de histoquímica são mais utilizadas quando necessário diferenciar muitas substâncias com a mesma aparência (melanina, lipofuscina, hemossiderina)
Substâncias Endógenas:
Melanina
· É um pigmento negro e acastanhado que está presente na pele, olhos e em partes do cérebro
· Produto da oxidação da tirosina e está ligado proteicamente a organelos (melanossomas - corpúsculos intracelulares que armazenam a melanina da pele)
· Melanócito – célula que contem o corpúsculo intracelular e tem como função produzir melanina (serve de barreira contra os raios UV)
· A melanina existe também como uma fina camada a revestir a esclera, o corpo ciliar e a iris e evita a reflexão interna
· Diagnóstico de tumores melanócitos – não é requisito identificar a melanina, mas hoje em dia a diferenciação é feita com base em marcadores imunohistoquímicos de diferenciação melanocítica 
· Utilidade desta coloração histoquímica – diferenciar entre pigmentos de cor castanhas ou localizá-lo com precisão
· Fontana Masson – identifica melanina
Hemoglobina e Mioglobina
· Hemoglobina – pigmento que realiza o transporte de O2 e CO2 do aparelho cardiovascular; está sempre a ser sintetizada e degradada
· Mioglobina – pigmento que armazena e transporte o O2 e CO2 no músculo
· Eritrócitos – 34% do citoplasma é hemoglobina e está presente em todos os vasos vascularizados; de fácil identificação devido à sua eosinofilia e morfologia
Bilirrubina e Biliverdina
· Bilirrubina – pigmento derivado da degradação dos eritrócitos 
· Biliverdina – o grupo Heme é separado devido à ação da enzima heme-oxidase -> heme perde o Fe e porfirina tem o anel tetrapirrólico aberto -> biliverdina; transportada para o fígado onde a enzima biliverdina-redutase a transforma em bilirrubina (pigmento de cor amarela)
· Bilirrubina+ácido glucurónico = torna-se hidrossolúvel e é secretada pelos hepatócitos
· Icterícia - defeito do metabolismo da bilirrubina que levam à sua acumulação em circulação e em casos graves esta condição estende-se aos órgãos (rins e fígados)
· Coloração por HE – depósitos de cor amarelo acastanhados (cor característica)
· Coloração Fouchet-Sirius Red – Biópsia hepáticas
· Objetivo de colorações histoquímicas – identificação mais rápida quando a concentração de bilirrubina é reduzida 
Ferro
· Componente essencial da hemoglobina, mioglobina e citocromas, cofator de várias enzimas
· Metabolismo – destruição de hemácias, circulação no plasma ligado á transferrina e armazenado na forma férrica ligado a apoferritina
· Armazenado – fígado, baço, medula óssea e músculo
· A deficiência ou o excesso está na origem de várias patologias como a anemia ferropénica
· Evidência histológica – hemossiderina
· Hemossiderina – acumulação de ferro em excesso
· Hemossiderina vs pigmentos de cor castanha – reação por azul da Prússia de Perls
Substâncias Exógenas
Carvão
· Pigmento inerte mais comum devido à inalação de ar poluído e que se encontra presente nos pulmões e não costuma originar doenças
· Casos mais graves – exposição elevada pode originar pneumoconiose e fibrose pulmonar massiva
· Em ambos os casos – observa-se extensa coloração negra no tecido pulmonar
· Pode estar presente em: tatuagens, articulações prostéticas, marcador cirúrgico, pulmões (mineiros, poluição doméstica e industrial, vítima de incendio, bombeiros)
Sílica
· Substância - Forma cristalina ou amorfa facilmente inalada e presente universalmente
· Utilização - indústria vidreira, pedreiras, fundições (minérios)
· Observação MO – depósitos de material birrefringente no tecido pulmonar e gânglios linfáticos anexos
· Associado – com carvão e outras partículas
· Exposição – pode originar silicose:
- Aguda – exposição elevada pode causar inflamação pulmonar e edema
- Crónica – exposição com longa duração (20/ 30 anos) pode provocar doença fibrosante nos tecidos pulmonares
Asbestos
· Substância – deriva da sílica e tem uma estrutura fibrosa
· Patologias – asbestose (fibrose progressiva do tecido pulmonar), mesotelioma maligno (tumor maligno da pleura) ou carcinoma broncogénico
· Observado – tecido pulmonares ou expetoração 
· Aspeto – fibras pequenas, finas e incolores
· Identificação – utilização da técnica de Perls que é uma mistura com sais férricos que conferem uma cor acastanhada e aparência perlada 
Silicone
· Substância – composto polimérico que é utilizado na construção de próteses mamárias
· Patologias – reação inflamatória granulomatosa nos tecidos circundantes à prótese (devido à reação com o silicone que ‘’escapou’’)
· Observado – doente em diálise devido aos tubos feitos de silicone 
Talco
· Substância – silicato de magnésio em pó 
· Patologias – reação granulomatosa (nódulos compostos por células gigantes multinucleadas contendo cristais de talco)
· Observado – pulmões e fígado dos toxicodependentes uma vez que esta substância é muito utilizada para cortar drogas ilegais
Pó de Luvas
· Substância – amido em pó
· Patologias – reação granulomatosa (pouca frequência)
· Observado – cortes histológicos devido à manipulação dos fragmentos com luvas
· Aspeto – grânulos redondos de cor azul na HE e coram fortemente pela reação de PAS
Artefactos
Pigmento Formalínico
· Surge – facilmente em soluções formalina incorretamente tamponadas ou existe um prolongamento do tempo de fixação
· Remoção – pré-tratamento com solução de ácido pícrico
· Cor – pigmento castanho/ escuro em tecidos fixados em formalina
· Presente – tecidos muito vascularizados (baço), congestionados ou hemorrágicos (lesões)
· Distinguir – devido á birrefringência sob a luz polarizada é possível distinguir dos endógenos
Pimento de Mercúrio
· Surge – com a utilização de fixadores com conteúdo mercúrio (solução de Zenker) pode originar pigmentos acinzentados nos tecidos
· Remoção – utilizando uma solução alcoólica de iodina e tiossulfato de sódio antes da coloração é possível eliminar estes depósitos
Pigmento de Dicromato 
· Substância – pigmento extracelular de cor negra amarelada (devido ao óxido de crómio)
· Surge – utilização de solução fixadora que tem dicromatos ou ácido crómico
· Possível reduzir este pigmento com lavagens do tecido com álcool antes da fixação
· Remove-se dos tecidos com o auxílio de solução alcoólica acidificada
Microrganismos
· São extremamenteabundantes 
· São apenas visíveis ao MO
· Quando não existe infeção é necessário realizar a identificação histológico para se poder estabelecer um diagnóstico definitivo
· Coloração HE – apresentação de alterações morfológicas consistentes com um processo infecioso devido a infeção de um microrganismo desconhecido
· Os Mo provocam reações especificas nos tecidos que vão variando com o estado da infeção
· Com o auxílio de dados morfológicos e clínicos é possível diminuir o número de microrganismos que estão a causar a alteração tecidual identificada
· Existem várias técnicas imunohistoquimicas e de biologia molecular que permitem diagnosticar diferencialmente os vários microrganismos;
· Biologia molecular - estas técnicas costumem ser muito dispendiosas e não são mais eficazes que colorações histoquímicas
· Os agentes patogénicos principalmente detetados – bactérias, vírus, fungos, protozoários e helmintes 
Bactérias
· Parede celular que tem na sua composição lípidos e glicolípidos e tanto a sua quantidade como o seu grau de saturação ditam o sucesso da coloração
· Lípidos insaturados – grande quantidade de grupos de ácidos carboxilo e ácidos hidroxilo (fucsina e violeta de cresil)
· Os métodos utilizados para evidenciar bactérias sofreram poucas mudanças
· Coloração HE – aparecem como massas azul acinzentadas quando em grande quantidade, mas quando em pequena quantidade a sua visualização é difícil
· Coloração PAS – certifica que as bactérias possuem glicolípidos na membrana celular
· Giemsa – cora a maioria das bactérias
· Prata – técnicas que utilizem este mineral permitem o diagnóstico quando a morfologia das bactérias é característica (espiroquetas)
Método de eleição:
· Coloração de Gram foi desenvolvido em 1884 por Hans Christian Gram e divide/ classifica as bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas de acordo com as suas afinidades tintoriais
· Bactérias Gram negativas – possuem maior quantidade de lípidos na membrana celular e uma camada mais fina de peptidoglicano
	Positivas
	Negativas
	Estafilococos
	Neisseria
	Estreptococos
	Salmonela
	Clostridium
	Pseudomonas
	Listeria
	Brucela
	Micobactéria (fracas)
	Escherichia coli
	etc
	Klebsiella
· Utiliza o violeta de cristal que possui maior lipossolubilidade e é três vezes mais solúvel em álcool que a fucsina e é também um corante catiónico (básico) pelo que tem uma maior afinidade para com a cromatina nuclear assim como para com as outras estruturas (que são ácidas/ aniónicas)
· Coloração de Ziehl-Neelsen, desenvolvida por Franz Ziehl e Friedrich Neelsen, a partir do método de Ehrlich sendo o mais indicado para micobactérias
· Utiliza fucsina básica para corar microrganismos sendo também um corante catiónico
Cocos – Estafilococos
· Gram positivos
· Maior relevância – Estafilococcus aureus
- Lesões cutâneas – septicemia fatal
- Multirresistentes
-Infeções nosocomiais
- Argumentos tridimensionais irregulares
Cocos – Estreptococos
· Gram positivos
· Maior relevância – Streptococcus pneumoniae
- Podem provocar infeções a nível da cavidade oral, sistema linfoide, tecido cardíaco ou intestinal
- apresentam-se aos pares ou cadeias curtas
Cocos – Neisseria
· Gram negativos
· Difícil visualização histológica
- Coloração – assemelha-se a grãos de café 
· Neisseria meningites – causa meningite
Bacilos – Micobactérias
· Gram positivos
· Maior relevância: M. tuberculosis e M. leprae
· Tuberculosis
- Lesões nodulares granulomatosas com necrose
- Estão isoladas, pares ou pequenos agrupamentos
· Leprae
- Destrói nervos especialmente na pele
- Estão em grandes agrupamentos paralelos
· Ambos gram positivos e com Giemsa coram de igual maneira
· Através de ziehl-neelsen têm uma coloração resistente aos ácidos
Bacilos Gram + e Gram –
· Gram positivos
- bacillus anthracix
- Clostridium
· Gram negativos
- E. coli
- Salmonella typhi
- Pseudomonas
- Legionalla
Bactérias curvas ou espirais
· Gram negativo – vibrio cholerae, camphylobacter, treponema pallidum
· Gram positivo – H. pylori
Bactérias filamentosas/ miceles
· Bactérias que se assemelham a fungos devido aos filamentos que criam
· Gram positivo – actinomices
- Agrupamentos densos com formação filamentosa
· Gram negativo – nocardia asterioides
- Não forma colónias apenas uma estrutura filamentosa em ângulos retos
Micobactérias
· Parede celular rica em cadeias lipídicas de ácido micólico 
· Técnica de Gram – difícil demonstração/ evidenciação sendo que algumas são Gram+
· Devido à cápsula são difíceis de demonstrar através da coloração de Gram
· Designam-se por bacilos ácido-álcool resistentes (BAAR) por serem resistentes à remoção dos corantes por ácidos e álcoois
· O ácido fenólico é utilizado nestas colorações para aumentar a porosidade da cápsula o que faz aumentar a penetração do corante (o calor também ajuda)
Fungos
· Grandes com membrana celular rica em polissacáridos
· Micoses são as infeções por fungos e costumam estar associados a infeções oportunistas em imunodeficiência
· Inofensivas – pé de atleta 
· Graves – infeção sistémica que levam à morte (sistema imunitário comprometido)
· Visualizados o suficiente com HE 
· Bem demonstrado – Grocott e PAS
Classificação histológica
Filamentosos
· Produzem esporos que se alojam nos tecidos
· Crescem como filamentos que se ramificam e formam uma rede entrecruzada (micélio)
Esporulares
· São unicelulares de forma esférica
Idênticos a esporos
· Existem parcialmente na forma de esporos, mas formam longas estruturas filamentosas, pseudo-micélio
Dimórficos
· In vivo - forma de esporos
· In vitro – forma filamentosa
Dermatofíticos
· Provocam as principais micoses cutâneas (microsporum, trychophiton, epidermophiton)
· Têm a capacidade de digerir queratina assim como parasitar estruturas queratinosas
· Identificadas através de HE e PAS
· São PAS positivo 
· Podem também ser utilizadas colorações argênticas para identificação
 Micoses Profundas
· Sintomas – afetam principalmente o aparelho respiratório e a pele e depois podem disseminar-se pelo restante organismo
· Maior risco – trabalhadores rurais
· Utentes mais acometidos – imunodeficientes e toxicodependentes ou como complicação de infeção já existente (oportunista)
Candida albicans
· Organismos comensal que se torna patogénico quando tem oportunidade para tal
· Lesões:
- Simples lesões cutâneas da mucosa oral ou vaginal
- Sistémica – Imunodeficientes que envolve normalmente o aparelho respiratório (meningite ou endocardite)
· Aspeto:
- Forma arredondada em que se pode observar divisões ou formações com filamentos não ramificados
- Esporos – gram negativos
- Ambas as formas podem ser evidenciadas pela coloração de PAS
Aspergillus
· Organismo comensal que se torna patogénico quando tem oportunidade
· Normalmente observa-se estruturas produtoras de esporos na porção ramificada das hifas
· Aspeto:
- Filamentoso cujas hifas são septadas e se ramificam de forma dicotómica
- Hifas podem ser basófilas (quando aplicado HE) e são bem identificadas com PAS e Grocott
Criptococcus neoformans 
· Causador de infeções oportunistas do aparelho respiratório e podem estar na origem de meningites e lesões cutâneas
· Aspeto:
- No MO demonstras um halo branco devido à presença de uma cápsula extracelular polissacárido
- apresenta-se unicamente na forma de esporos
· Evidenciados:
- Gram positivo
- Também cora com PAS e Azul de Alcião
- É possível usar Prata, mas a cápsula não fica impregnada
Histoplasma capsulatum
· Provoca histoplasmose assim como reações granulomatosa com células de tipo epitelioide o que pode induzir em erro de se tratar de uma tuberculose não caseosa
· Aspeto – esporular, oval, em macrófagos é um parasita intracelular
· Colorações:
- HE – não específico
- Prata – determina a natureza fúngica deste microrganismo
Protozoários
· Unicelulares com estruturas complexas e o meio de locomoção auxilia a sua classificação
- Amibas movem-se com a utilização de pseudópodes
- Outros utilização cílios ou flagelos
· Coloração:
- HE – bem caracterizados e observados
- Giemsa, PAS, Grocott – auxilia na identificação do protozoárioEntamoeba histolytica
· Patologias – disenteria e a sua ação provoca muitas vezes necrose, ulceração e/ ou perfuração do intestino grosso
· Aspeto – núcleo pequeno, citoplasma espumoso e parasita macrófagos
· Coloração:
- HE – observa-se facilmente 
- PAS – quistos têm uma parede rica em glicogénio pelo que são mais bem observados com esta coloração
Giardia lamblia
· Patologias – distúrbios gastrointestinais
· Aspeto – flagelados e podem ter a forma de foice, triangular, quadrangular 
· Coloração:
- HE – adquire coloração azulada 
- Giemsa – melhor evidencias
Trichomonas hominis
· Patologias – habita no intestino grosso e por isso está associada a disenteria e diarreia
T. vaginalis – provoca uretrite nos homens e vaginite nas senhoras
Leishmania
· Patologias – simples lesões cutâneas a doenças viscerais graves
· Aspeto – podem ser encontradas em grande número no citoplasma de histiócitos inchados e podem também originar lesões na derme
· Coloração:
- HE – observadas
- Giemsa – evidenciadas facilmente
Plasmódio de Malária
· Patologias – várias espécies com patologias diferentes
· Aspeto – produz um pigmento malárico que por vezes escurece-os
· Coloração:
- HE – observado 
- Giemsa – mais bem evidenciado
Toxoplasmose
· Patologias – doença infeciosa (provocada pelo toxoplasma gondii) e pode levar à morte do feto ou provocar malformações
· Aspeto – forma arredondada ou crescente e observa-se como inclusão citoplasmática
· Coloração:
- HE – observada (tecido cardíaco – quistos) 
- Giemsa – observa-se facilmente 
Pneumocystis carinii
· Patologias – provoca pneumonia em imunodeprimidos
· Aspeto – pode ter forma de parasita livre ou enquistado
· Coloração:
- HE – não se visualiza o parasita livre
- Giemsa – observa-se o parasita livre 
- Grocott – quistos são observados devido à espessura da parede que marca positiva para colorações com prata
Helmintos (verme parasita)
· Parasitas dos intestinos e podem ser observados macroscopicamente 
· Membros – nematodes (Ascaris lumbricoides), Sestodes (Taenia saginata), Trematodes (Schistosoma)
· Coloração:
- HE – observa-se facilmente os ovos
Vírus
· Organismos acelulares com cápsula proteica que protege o genoma
· MO – não é possível a observação das partículas virais apenas os efeitos que provoca a sua ação nas células
· Inclusões virais – formação de estruturas no interior das células que são observáveis durante a replicação
· Devido a terem ácidos nucleicos podem ser evidenciados por técnicas que corem este tipo de estrutura
· HE – podem ocorrer no citoplasma, núcleo ou ambos
· Eosina – estruturas acidófilas
Herpes
· Patologias – formação de inclusões intranucleares nas células que rodeiam a lesão principal; podem originar células multinucleadas com inclusões intranucleares.
· Aspeto – microscopicamente a inclusão adquire uma semelhança de vidro de fundo de garrafa
· Coloração:
- HE – cor vermelha no núcleo 
Citomegalovirus
· Patologias – infeção pulmonar oportunista (inflamação, necrose, consolidação focal ou completa do pulmão afetado)
· Aspeto – inclusão intranuclear (eosinofílica) com o especto característico de olho de mocho; as células infetadas podem apresentar pequenos corpos intracitoplasmáticos basofilicos
· Coloração - Técnica do Ácido fosfotúngstico-eosina
Aplicações em anatomia patológica
· Meningite purulenta
· Encefalite viral
· Infeção por herpesvirus
Protocolos para 2º teste
Fontana Masson
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Solução de nitrato de prata amoniacal a 10%
· Passar em água destilada
· Tratar com solução de tiossulfato de sódio
· Passar em água destilada
· Contrastar com vermelho neutro
· Lavar em água
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Com o poder redutor da melanina existe a transformação do sal de Ag em prata metálica visível, ou seja, reduz a prata amoniacal que se deposita no pigmento
· Não especifica para melanina
· Objetivo principal – diferenciação entre pigmentos de cor acastanhada (HE) e pigmento de Melanina
O que cora?
· Melanina – preto/ castanho-escuro
· Outras substâncias argentafins – Preto
· Fundo - vermelho
Doenças
· Tumores dos melanócitos
Fouchet-Sirius Red
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Reagente de Fouchet
· Lavar em água destilada
· Contrastar com Sirius Red
· Secar ao ar
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Oxida a bilirrubina em biliverdina
· Coloração de fibras de reticulina e colagénio que rodeiam os hepatócitos
· Objetivo – identificação mais rápida quando a concentração de bilirrubina é reduzida
O que cora?
· Pigmentos de bílis – verde acastanhado
· Músculo – amarelo
· Fibras de reticulina e colagénio – vermelho
Doenças
· Identificação de doença metabólica a nível da bilirrubina??
Azul da Prússia de Perls
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Solução de ferrocianeto de potássio acidificada
· Lavar em água destilada
· Contrastar com eritrosina ou vermelho neutro
· Lavar com água destilada
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Identifica e deteta ferro ferroso (Fe3+)
· O ferro ferroso reage com ferrocianeto de potássio e adquire coloração azul-escuro que é característico de ferrocianeto férrico
· Objetivo – distinção entre pigmentos de cor acastanhada e hemossiderina
O que cora?
· Depósitos de ferro/ ferro ferroso – azul
· Núcleos – vermelho
Doenças
· Depósitos de ferro ferroso (hemossiderose)
Gram (em cortes de parafina)
Protocolo
· Desparafinar e hidratar
· Corar com solução filtrada de violeta de cristal
· Lavar os cortes com solução de iodina
· Diferenciação com álcool-acetona
· Lavar em água corrente
· Contrastar com vermelho neutro
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· A diferença de coloração depende da parede celular de cada uma das bactérias
· Gram positiva – camada de peptidoglicanos que retêm o corante (os poros por ação do mordente e a diferenciação não afeta)
· Gram negativa – possuem maior quantidade de lípidos na membrana celular e uma camada mais fina de peptidoglicano
· Solução de iodada (mordente) – que serve para fechar intensificar a cor 
· Álcool-acetona – vai diferenciar (‘varre’ a primeira camada de peptoglicanos dos Gram negativos e possibilita a ação do 2º corante)
· Violeta de Cristal - possui maior lipossolubilidade e é três vezes mais solúvel em álcool que a fucsina e é também um corante catiónico (básico) pelo que tem uma maior afinidade para com a cromatina nuclear assim como para com as outras estruturas (que são ácidas/ aniónicas); após fechar os poros não é possível remover
O que cora?
· Gram negativas – azul
· Gram positivas – vermelho
· Fundo – vermelho
Cuidados:
· Diferenciação – preciso ter atenção ao tempo (demasiado tempo leva à remoção de todo o corante de todas as bactérias)
· Mordente (iodo) – formação de um complexo com o violeta de Cristal que vai tornar o complexo menos lipofílico e acelera a remoção do corante das Gram negativas
Doenças 
· H pylori – gram+ - neoplasia gástrica
· Treponema pallidum – gram- - causa sífilis 
Ziehl-Neelsen (em cortes de parafina)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Corar com carbolfucsina a 65º
· Escorrer o corante das lâminas e deixar secar ao ar
· Diferenciar cem álcool ácido
· Lavar com água corrente
· Contraste com azul de metileno
· Passar por água
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Microrganismos ácido-resistentes – muitos não coram através da técnica de Gram embora alguns Gram negativos possam ser evidenciados
· Fucsina básica – liga-se às cadeias de ácido micólico dos lípidos insaturados que se encontram na membrana celular das micobactérias
· Fucsina – menos liofilica que o violeta de cristal o que torna a penetração do corante mais difícil e por isso para sobrepor a barreira adiciona-se fenol à solução
· Quando o corante se liga aos grupos ácidos da membrana é impossível remover o corante mesmo que se recorra a soluções ácidas ou alcoólicas 
O que cora?
· Bacilos álcool-ácido resistentes (Koch e Hansen) – Vermelho
· Fundo – Azul
Doenças/ aplicações
· Tuberculose
· LepraFite – Mycobacterium leprae (técnica de Wade Fite??)
Protocolo
· Começar por desparafinar em Xilol-óleo amendoim
· Corar com carbolfucsina 
· Escorrer o corante das lâminas e deixar secar ao ar
· Diferenciar com ácido sulfúrico em álcool a 25%
· Lavar com água corrente
· Contraste com azul de metileno
· Passar por água
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Pelo que entendi esta é uma modificação á técnica de Ziehl-neelsen porque a cápsula desta micobactéria tem menor camada lipídica e por isso é menos ácido-álcool resistente assim como é menos resistente aos solventes orgânicos 
· Óleo de amendoim na desparafinação – ajuda na conservação da camada lipídica e numa diferenciação mais suave
O que cora?
· Mycobacterium leprae – Vermelho
· Fundo – Azul-pálido
Doenças/ aplicações
· Tuberculose
· Lepra
Warthin-Starry
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar (acho que tem de ser incluído em celoidina)
· Tampão de acetato
· Passar para uma solução de nitrato de prata e incubar a 60º
· Passar as lâminas para a solução reveladora e manter em banho-maria a 60º
· Lavar com água quente
· Passar para o tampão de acetato
· Passar por água
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento/ técnica
· Técnicas que utilizem prata permite diagnóstico quando a morfologia das bactérias é característica (espiroquetas)
· Utilização de celoidina que é, tal como a parafina, utilizado para realizar a inclusão
· Revelação – solução de prata liga-se às bactérias e depois é reduzida a prata visível pela hidroquinona que é o revelador
O que cora?
· Helicobacter pylori – preto
· Espiroquetas – preto
· Fundo – amarelo-dourado ou castanho
Doenças
· Gastrite devido a ação de H. pylori
· Gastrite crónica
Giemsa Modificada (em cortes de parafina)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Solução de Giemsa a 4%
· Lavar em água 
· Diferenciar com solução álcool acético ou álcool
· Diafanizar e montar
Fundamento
· Identifica e deteta ferro ferroso (Fe3+)
· O ferro ferroso reage com ferrocianeto de potássio e adquire coloração azul-escuro que é característico de ferrocianeto férrico
· Objetivo – distinção entre pigmentos de cor acastanhada e hemossiderina
O que cora?
· Depósitos de ferro/ ferro ferroso – azul
· Núcleos – vermelho
Doenças
· Gastrite crónica
Grocott (em cortes de parafina)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Oxidar cortes com ácido crómico
· Lavar em água corrente e de seguida em água destilada
· Lavar com bissulfito de Na
· Lavar com água corrente e depois água destilada
· Submergir lâminas numa solução de prata e incubar a 60º
· Várias lavagens em água destilada
· Tratar com cloreto de ouro
· Várias lavagens em água destilada
· Fixar em tiossulfito de Na
· Contrastar com verde luz
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Técnica de eleição para demonstrar fungos
· Impregnação por prata assim como a sua redução através dos grupos aldeído que surgem após ocorrer a oxidação dos componentes celulares do fungo pelo ácido crómico
O que cora?
· Fungos – delineados a negro
· Fundo – verde-pálido/ verde
Doenças
· Candidíase
Gridley (em cortes de parafina)
Protocolo
· Começar por desparafinar os cortes e hidratar
· Oxidação dos cortes com ácido crómico
· Lavar em água corrente
· Reagente Schiff
· Lavar com solução ácida
· Corar com fucsina aldeídica
· Lavem alcoólica, seguida de lavagem com água corrente
· Contrastar com amarelo de metalino
· Desidratar, diafanizar e montar
Fundamento
· Permite visualização detalhada da estrutura interna do fundo comparada com Grocott
· Falível quando se pretende identificar fungos em pequena concentração no tecido
· Técnica é um PAS modificado (protocolo semelhante)
O que cora?
· Fibras elásticas – Azul
· Hifas e esporos – Vermelho | o Fundo – Amarelo
Exógenos - continuação
Cálcio
· Parte constituinte de ossos e dentes (com HE cora de Roxo)
· Patologias por depósito de Ca:
- Áreas de necrose associada a tuberculose
- Enfarte (Grandy-Gamma Bodies – focos de hemorragia no baço devido à hipertensão; contem hemosiderina. Tecido fibroso e cálcio))
- Ateroma (vasos)
- Malacoplasia (doença inflamatória crónica que afeta principalmente o sistema urogenital) na bexiga
· Von Kossa – método de eleição para demonstrar o cálcio uma vez que permite visualização de depósitos grandes (existem outros métodos, mas apenas demonstram estes) e de pequenas dimensões
Cobre
· Associado à função de muitas enzimas (cofator)
· Patologias por depósito de Ca – doença de Wilson’s
- Patologia hereditária autossómica recessiva
- Caracterizada pela acumulação de Cu nos tecidos de órgãos como o fígado e cérebro (principalmente) mas também pode ocorrer acumulação nos olhos (anel de Kayser-Fleisher), rins e coração.
· Método de Rodadina – método de eleição para demonstração de Cu; existe também o método de ácido rubeânico
Técnica de Rodadina
Protocolo
· Solução de trabalho de Rodadina (solução de Rodadina alcoólica + acetato Na)
· Hematoxilina alumínica (utilizada em tecidos fixados para evidenciar ácidos nucleicos)
· Passar em água destilada
· Desidratar e clarificação rápida (degrada-se no xilol)
Fundamento
· Mecanismo de ligação – ligação do corante à proteína (proteínas citoplasmáticas nos hepatócitos) a que o Cu se encontra ligado 
· Não especifica para melanina
· Objetivo principal – evidenciar depósitos de Cu
O que cora?
· Núcleos - azul
· Cu - vermelho
Doenças
· Doença de Wilson’s
Von Kossa
Protocolo
· Nitrato de Prata a 1% sob luz violeta/ lâmpada de 100 W
· Tiossulfato de Na 5%
· Contrastar com vermelho neutro/ Kernechtrot/ Nuclear Fast Red
Fundamento
· Substituição dos iões de Ca por iões de Ag que se encontram presentes na solução Nitrato de Ag
· Sob a luz violeta ocorre a transformação da Ag metálica visível num precipitado 
· Objetivo principal – evidenciar depósitos de Ca (pequenos ou grandes)
O que cora?
· Ca – preto
· Fundo - vermelho
Doenças
· Áreas de necrose associada a tuberculose
· Enfarte (Grandy-Gamna Bodies)
· Ateroma dos vasos
· Malacoplasia na bexiga
Lipofuscina 
· Pigmento depositado na célula que serve para detetar o tempo de vida celular. Está presente em células que não se multiplicam muito e têm vida longa, como as musculares do miocárdio e os neurônios. Normalmente, quanto mais lipofuscina presente, mais velha é a célula;
· Encontra-se em várias zonas do corpo e pensa-se que é o resultado de processos lentos e progressivos da oxidação de lípidos e lipoproteínas (por ser longo e progressivo adquire muitas tonalidades)
· Para ter a certeza de que estamos na presença deste pigmento é necessário realizar várias colorações de Histoquímica
· Colorações com que reage:
- PAS
- Fontana Masson
- Schmorl’s (método que uso as propriedades de redução da melanina para corar grânulos de cor azul-verde; mais aconselhado para cortes congelados, mas se os tecidos estiverem bem fixados também é possível utilizar tecidos incluídos em parafina)
Sudão Negro B
- Ziehl-Neelsen (método longo)
- Etc
· Acumulada principalmente em:
- Hepatócito do fígado
- Músculo cardíaco
- Glândulas suprarrenais
- Testículos
- Ovário
- Neurónios (forma de inclusões citoplasmáticas)
- Desordens de acumulação de lípidos
- Outros tecidos: Rim, MO
Histoquímica Enzimática
· Princípio - Com a demonstração da relação entre a atividade enzimática e os tecidos é possível estudar diversas patologias
· Enzimática – oxidorredutase (oxidase, peroxidase, etc), transferase, hidrólase (lípase, peptidase)
· Principal aplicação – biópsia do colon em suspeita de doença de Hirshsprung’s e biópsia de musculo
· Objetivo – Classificar certas patologias de acordo com a atividade enzimática analisada na peça
· Problema – com a fixação as enzimas vão ser inibidas ou até destruídas
· Contornar problema – utilização de tecido congelado com posterior fixação com formol – Ca; utilizar esfregações ou ‘imprints’ (lâmina adere à zona do tumor)
· O que classifica – miopatias, doenças osteoarticulares, metabolismo de glícidos, entre outros
Fixação
· Problema quando se pretende realizar este tipo de métodosuma vez que há inativação das enzimas
· Método alternativo:
- Cortes de congelação
- Fixação em formol-cálcio a 4º
- Utilização de esfregaços
· Tipo de fixação a utilizar depende do tipo de enzima que se pretende estudar
- Biópsia de musculo – congelado
- Colon - congelado e depois cortado fixado em formol-cálcio
Biópsia do Colon
· Suspeita de doença de Hirshsprung’s em crianças
- devido à inexistência de gânglios existe mobilidade intestinal deficiente o que vai provocar obstrução a nível intestinal
- Não tratada – pode provocar megacólon toxico (pode ser fatal)
· Diagnóstico com histoquímica enzimática:
- Acetilcolinesterase – ausência de coloração das fibras nervosas prova a inexistência dos nervos e notoriamente a falta de mobilidade intestinal
- Resultados: Fibras nervosas – Castanho-escuro/ preto 
 Células com acetilcolinesterese – castanho-escuro/ preto
Biópsia musculo
· Histoquímica enzimática
- Permite estudar os tipos de musculo (estuda as fibras e o envolvimento em processos patológicos)
- Permite estudar arquitetura das fibras
- Permite estudar a ausência de atividade enzimática
· Objetivo – estudar e compreender o desenvolvimento e progressão das desordens neuromusculares
Fibras musculares
· ATPase (Adenosina trifosfatase):
- Classifica vários tipos de fibras que estejam associadas a uma determinada patologia
- Esta análise utiliza diferentes níveis de pH para diferenciar as fibras
· NADH-TR (nicotinamida adenina dinucleotideo tetrazólio redutase)
- Permite diferenciar entre as diferentes fibras
· SDH (sucinato desifrogenase)
· COX (citocromo oxidase)
- Coloração mais escura em zonas com atividade da citocromo oxidase (complexo IV da cadeia de eletrões) SDH – Azul
Cox - castanho
· COX-SDH
- Com a combinação destas duas técnicas é possível perceber localmente a prevalência qual o tipo de fibras mais prevalente/ No campo analisado – qual a atividade enzimática mais prevalente
- Mais utilizado – estudo de desordens associadas a mitocôndrias