TÉCNICAS HISTOLÓGICAS patologia

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TÉCNICAS HISTOLÓGICAS – UMA ABORDAGEM PRÁTICA
🛑Muitas doenças e processos fisiológicos so puderam ser compreendidos após o desenvolvimento do microscópio. Com o tempo se utilizou técnicas de coloração, nasceu assim a técnica histológica ou histotecnologia que é o conjunto de procedimentos que envolvem as seguintes etapas: coleta de material; fixação; clivagem; descalcificação; processamento; inclusão microtomia; coloração; selagem; observação ao microscópio.
🛑Coleta: é um procedimento de retirada da amostra biológica de um organismo vivo ou morto. Obtidas através de biopsias, peças cirúrgicas e necrópsias. Antes de proceder a coleta, deve organizar o espaço, separar os utensílios que serão utilizados e preparar o liquido fixador. O tecido é imerso em um frasco contendo a solução fixadora que deve ser bem fechado, evitando assim que ocorra a evaporação do fixador ou mesmo que estes vapores tóxicos contaminem o meio ambiente; este procedimento deve ser realizados no interior de cabines.
🛑Fixação: é a principal etapa da técnica histológica, pois o restante do processo so poderá acontecer se a fixação estiver adequada, ou seja, material preservado. Após a retirada de partes do tecido do organismo as amostras naturalmente se deterioram pela ação de enzimas, e os objetivos da fixação dos tecidos são: evitar a autólise e a proliferação bacteriana; parar o metabolismo celular, mantendo o conteúdo bioquímico e preservando antígenos; preservar os tecidos para futuras colorações; manter as relações topológicas e morfológicas das biomacromoleculas o mais próximo da situação “in vivo”; melhorar a diferenciação ótica das células preservando sua identidade.
Existem varias formas de fixação, a fixação física promove a conservação da amostra através do aquecimento ou resfriamento, a fixação química é o processo de estabilização de biomoléculas pela ação de agentes químicos. Os principais grupos de fixação são: agentes oxidantes e desnaturantes, fixadores de mecanismos desconhecidos; fixadores aldeídos e combinações. 
🛑Clivagem: é o processo de redução de tamanho e espessura dos fragmentos  fixados, permitindo de forma mais eficaz a penetração do fixador no interior das amostras. Com o tecido fixado por algumas horas pode-se proceder a clivagem com o auxilio de instrumentos bem afiado. Ao término do tempo estipulado de fixação deve retirar a amostra do liquido fixador, proceder a lavagem recomendada a cada tipo de fixador e acondicionar a amostra em álcool 70%, caso esta não seja encaminhada imediatamente ao processamento.
🛑Descalcificação: O tecido ósseo apresenta uma matriz extracelular com componentes minerais e orgânicos de consistência petria que não permite os seus seccionamentos e consequente, visualização microscopia de luz. Para observação desse tipo de tecido ou diagnostico de algumas patologias deve se proceder a descalcificação. Os descalcificadores podem ser a base de ácidos, histoquímicos, soluções descalcificadas panteadas, resinas de troca iônica e descalcificadores eletrolíticos. Podemos classificar os descalcificadores ácidos como: Ácidos fracos e fortes.
Procedimento de Descalcificação: os tecidos mineralizados se já bem fixados devem ser lavados em agua corrente. Em seguida deve ser envolto em uma gaze e amarrado com um barbante. O liquido descalcificador deve ser despejado em um frasco de boca larga. Com uma ponta do barbante deve ser amarrado em um bastão de vidro. O tecido é imerso na solução calcificadora, e o frasco é colocado sobre uma placa agitadora para acelerar a descalcificação. Ao término da descalcificação os tecidos devem ser lavados em água corrente. O material descalcificado assim como o material não mineralizado seguem então para a clivagem e depois o processamento.
🛑Processamento: Reúne procedimentos que visam substituir a água que se encontra nos tecidos por um meio mais sólido que confira resistência e dureza suficiente para ser cortado. Existem várias substâncias onde podemos incluir uma amostra. O OCT, resinas hidrofílicas e hidrofóbicas, a parafina entre outras. O processamento se caracteriza pela difusão de substâncias apropriadas para dentro e fora do tecido, até atingir um ponto onde a concentração dos reagentes e do interior tecido se torne igual.
1)Desidratação: visa remover a água os fluidos teciduais e fixadores aquosos por difusão de agentes desidratantes. Existem vários agentes desidratantes, e o etanol o mais comum. A maioria dos agentes desidratantes não é miscível com a parafina, portanto, é necessária uma etapa intermediária entre a desidratação e a infiltração, ou seja, a clarificação.
2)Clarificação: remoção do álcool dos tecidos, utilizados durante a desidratação através de um agente clarificador. O xilol é a solução mais utilizada na rotina em histologia. Para esse procedimento ser bem executado é fundamental a completa remoção do álcool pelo xilol para que a parafina possa penetrar completamente no interior dos tecidos.
3)Infiltração: é a saturação da cavidade dos tecidos e das células por uma substância que é geralmente o meio em que estes serão inclusos. A parafina é utilizada nessa etapa. Deve estar totalmente em sua forma líquida para uma infiltração eficiente.
🛑Inclusao: processo em que o tecido é colocado em molde coberto por parafina fundida, após ser totalmente infiltrado. Pode ser realizada com a parafina ou com auxilio de uma central de inclusão que são aparelhos confeccionados para facilitar o ato de incluir, garantindo uma distribuição perfeita. Durante a inclusão deve-se se seguir algumas recomendações importantes que irão facilitar a microtomia, e ao mesmo tempo permitindo uma analise correta do fragmento.
🛑Microtomia: é um procedimento delicado, que depende de um profissional bem treinado e equipamentos específicos, e cuidados que irão assegurar a execução de cortes de alta qualidade. Eles são: a estrutura do Micrótomo; navalhas (é necessário o uso de navalhas extremamente afiadas); procedimento de lavagem e identificação das lâminas (as lâminas devem ser identificadas de acordo com os blocos que serão cortados no micrótomo); a utilização de substâncias adesivas (albumina de Meyer, Gelatina, Caseína, Silano, entre outras); a execução da microtomia; problemas técnicos mais comuns (geralmente gerados pela má fixação e o acondicionamento das amostras, pela descalcificação, pelo processamento e a natureza própria do tecido).
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Algumas recomendações importantes para microtomia
Terminando os cortes de cada bloco, o técnico tem a responsabilidade de passar um papel toalha sobre o banho-maria, retirando qualquer resíduo de tecido, antes de cortar um novo bloco.  Esse ato minimiza a contaminação cruzada de uma amostra com fragmento de tecido de outro bloco. Após a microtomia, os blocos de tecido deverão ser cobertos com parafina fundida, para formar uma capa protetora que impedirá o ressecamento dos mesmos. Feito isso, estarão prontos para serem arquivados para posterior consulta. 
🛑Congelação de tecidos e Criomicrotomia: consiste na fixação física a frio por congelação, seguida do corte desse tecido ainda congelado. É o processamento empregado na rotina de centros cirúrgicos, pois permite rápido diagnóstico. Para obter um bom resultado nessa técnica existem algumas regras e conceitos. 
Propriedades dos corantes
Hematoxilina e eosina: A coloração pela hematoxilina e eosina é a mais utilizada nos laboratórios de anatomia-patológica em todo o mundo. Permite a visualização geral das estruturas teciduais, realçando o núcleo em azul e o citoplasma em róseo. A hematoxilina propriamente dita não é um corante, mas um produto da sua oxidação, chamado hemateína. Alguns corantes podem ser usados como contraste, mas o mais adequado é a eosina, seu principal objetivo é ser contrastante com dupla coloração para a hematoxilina.
Procedimentos gerais das colorações: o processo de coloração pode ser realizado mergulhando as lâminas individualmente em Borreis, ou em cubas de vidro onde as soluções são despejadassobre as lâminas. Para iniciar a coloração a parafina deve ser retirada para que os corantes possam penetrar e combinar com os tecidos (desparafinização) e é realizado pelo Xilol. Depois da desparafinização vem a hidratação, para retirar o Xilol, finalizada na água. No caso de eosina alcoólica, resorcina, orceína, deve parar-se a hidratação com álcool 70. Depois disso a lâmina está pronta para a coloração. No caso hematoxilina e eosina cortes hidratados devem ser mergulhados na solução de Mayer por 20 minutos, e depois colocados em água corrente por 25 minutos, em seguida as lâminas são misturadas em álcool 70% por 3 minutos, os cortes são corados por 1 minuto e lavados rapidamente  em seguida por álcool 95% parar retirar o excesso do corante. A desidratação deve continuar no álcool 100%. Em seguida inicia-se a clarificação. Após a coloração, as lâminas devem ficar em um meio de selagem permanente, para que analises futuras possam ser realizadas. A histotecnologia acelera o diagnóstico e da maior confiabilidade aos exames.