ISOLAMENTO MICROBIANO e ENUMERAÇÃOpratica

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ISOLAMENTO MICROBIANO 
• Estudar e caracterizar a espécie, condições para crescimento, identificação, 
exigências nutricionais 
• Separar numa amostra uma única espécie para avaliação das características 
• Ferramenta de diagnóstico clínico 
• Esgotamento do inóculo em placas 
• Estudar a amostra antes do isolamento, conhecer a espécie que se deseja 
isolar 
• Tomar cuidado com assepsia 
• Bioprospecção de fenótipos específicos 
• Características das amostras: microbiota normal, patógenos e contaminantes 
o existem microrganismos que estão normalmente presentes 
o separar os grupos 
o em amostras de água geralmente as células estão longes 
 
Esgotamento em placa 
• amostra com mistura de células 
• separar fisicamente e colocar no meio de cultura 
• incubação 
• formação de colônias (cada célula separa anteriormente vai dar origem a uma 
colônia) 
• conta-se as colônias depois 
• Decisões: 
o Qual meio de cultivo utilizar? 
o Quais tipos de demandas dos microrganismos que devem ser supridas 
pelo metabolismo? 
o Qual condição de incubação a ser utilizada? 
▪ Temperatura 
▪ Luz 
▪ pH 
▪ aerobiose ou anaerobiose 
o Quais fatores abióticos que podem influenciar o crescimento 
microbiano? 
▪ Atmosfera, pH, temperatura, luz 
• Técnicas de isolamento: estria simples e composta 
• Esgotamento do inóculo 
• Simples: alça de repicagem desliza em forma de estria em zig-zag usando toda 
extensão possível. Não voltar com a alça. 
• Composta: faz várias estrias em zig zag na mesma placa, divide em setores a 
placa. Puxa as estrias e para, flamba a alça novamente e espera a esfria, 
encosta no setor 1 e vai fazendo as estrias do próximo setor. 
o Formar colônias separadas/isoladas 
o Placa girada no sentido anti-horário 
o Estrias do último quadrante não devem tocar o inóculo do primeiro 
quadrante 
o Fazer marcações na placa, com os setores a serem feitas as estrias 
• Não aplicar pressão excessiva para evitar estragar o ágar 
• Possíveis erros: 
o Sobreposição de estrias (uma região fica com maior carga microbiana, 
atrapalha crescimento da cultura) 
▪ Não fez zig zag constante 
▪ Descontinuidade, parou e iniciou de novo 
o Não utilizar toda a extensão da superfície da placa 
▪ As estrias tem que ir de um lado ao outro 
o Na estria composta: não tocou no último setor para fazer o próximo 
o Ausência de esgotamento 
▪ Fez número pequeno de estrias 
• Quanto mais próximos os microrganismos estiverem, maior será a competição 
por nutrientes e as colônias vão se desenvolver menos 
• Quando estiverem mais longes, haverá menos competição e maior 
disponibilidade de nutrientes por área, sendo favorável ao crescimento das 
colônias 
• Estria simples não permite esgotamento quando a amostra tem densidade 
populacional muito grande, nesse caso o esgotamento eficiente será feito com 
estria composta 
• Uma colônia isolada nem sempre é uma cultura pura 
• Uma colônia pode ter mais de uma espécie de bactéria que vivem bem (até em 
simbiose) 
• O objetivo do isolamento é separar as espécies, mas nem sempre isso 
acontece 
• Para identificar se é colônia pura pode fazê-la crescer em um outro meio de 
cultura específico, ou fazer esfregaço e coloração de gram 
• Colônia pura só possui 1 espécie 
 
ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS EM AMOSTRA 
• Acompanhar curva de crescimento, observar a evolução 
• Contagem de colônias em placas 
• Contar somente microrganismos viáveis 
• Identificar se alimento está próprio para consumo 
• Saber se uma colônia é afetada por uma condição ambiental, comportamento 
em diferentes situações de cultivo 
• Verificar se água está potável 
• Métodos: 
o Contar diretamente no microscópio 
o Contadores eletrônicos 
o Número mais provável 
o Colônias em placa 
• Amostra natural: um único meio de cultivo não consegue simular as exigências 
de todos os microrganismos em uma determinada amostra natural 
o Diferentes espécies crescem em velocidades diferentes 
o Crescimento de uma colônia pode inibir a formação de outra 
o Período de incubação curto: valor real subestimado 
• Podemos usar diluição seriada + plaqueamento? 
o Usar diferentes meios de cultivo 
o Diferentes condições físico-químicas 9temperatura, pH, atmosfera, luz) 
o Tempo de incubação diferente (24 h, 3 dias, 7 dias, etc.) 
o Adição de agente inibidor (observar fungos, matar bactérias) 
o Usar ou não enriquecimento 
o Repetições: duplicata, triplicata, quadriplicada (ter resultado mais 
representativo) 
• Procedimentos para diluição seriada: 
o Identificar os tubos com diluições diferentes (contagem de densidade 
populacional em diferentes diluições) 
o Pipetar uma amostra de 1 ml, transferir para o tubo com 9 ml de salina 
(diluição de 10-1) 
o Pipetar 1 ml para tubo com 9 ml de salina (diluição de 10-2) 
o Repetir esses procedimentos até diluição 10-7 
o Identificar a diluição e espécie na borda da placa de Petri 
o Fazer plaqueamento com método de semeadura em profundidade (pour 
plate) 
▪ Homogeneizar a amostra e pipetar 1 ml 
▪ transferir para placa estéril sem meio de cultivo (placa vazia) 
▪ Verter meio de cultivo fundido na placa (meio sólido em forma 
líquida) 
▪ Homogeneizar a amostra e meio de cultivo, movimentos em 
sentido horário e anti-horário, ou forma de infinito (melhor). Fazer 
6 vezes em um sentido e 6 vezes no outro. 
▪ Fazer incubação, depois de 10 minutos (tempo de solidificação e 
esfriar) 
▪ Colônias crescem na superfície e interior do ágar 
o Método da semeadura em superfície (spread plate) 
▪ Meio já está solidificado na placa 
▪ Usar alça de Drigalsky (de vidro em formato de L) para espalhar 
a amostra na superfície do meio 
▪ Usar alíquota de 0,1 ml 
▪ Esterilizar a alça (chama do BB) e esfriar no interior da tampa da 
placa 
▪ Fazer movimentos por toda placa até que sinta resistência (quer 
dizer que já foi tudo absorvido pelo meio) 
▪ Devolver a alça para o pote com álcool 
▪ Colônias irão crescer na superfície do meio 
▪ Incubar as placas (fundo para cima e tampa para baixo) 
 
 
• Selecionar placas com 30-300 colônias 
• Nessa foto a diluição que contem esse número é a placa com diluição 10-4 
• A contagem é realizada com o auxílio de um contator de colônias (possui uma 
lupa e apoio para placa, lâmpada, caneta eletrônica (vai marcando as colônias 
e ele registra no sistema e aparece na tela o número de colônias) 
• Tem também o contador manual, vai apertando o botão 
• Calcular a densidade populacional expressa em UFC/mL 
 
 
Cálculo do número de UFC/ml 
• Pegar número de colônias na placa com diluição que contenha de 30-300 
colônias 
• Encontrar a média do número de colônias (somar as contagens e dividir 
pelo número de placas que foram feitas) 
• Multiplicar o nº médio de colônias pelo FD (fator de diluição) 
• Depois dividir pelo volume da alíquota plaqueada (ml) 
• Pronto, tem-se o número de células 
• FD é correção 
• Colocar o resultado em notação científica, exemplo: 3,7 x 107 UFC/ml 
• Considerando que a diluição seriada foi de 1 grama de solo + 9 ml de salina 
(85%), podemos escrever o resultado assim: 3,7 x 107 UFC/g de solo 
• Se 2 diluições tiverem na faixa de 30-300 colônias, faz a contagem 
separada. Se o resultado de uma for mais que o dobro de outra, iremos usar 
a diluição menor. Se o resultado for menor que o dobro, podemos somar os 
2 resultados e tirar média 
• A diluição menor tem menos erros experimentais 
 
Contagem microbiana em amostras naturais (outros métodos) 
• Citometria de fluxo 
• Sequenciamento de DNA metagenômico 
• Possível contar: células totais, grupos específicos, células metabolicamente 
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