Microbiologia Relatório 2 - Contagem

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
BACHARELADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
RELATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS EM PLACAS
ALUNO: GILVANDENYS LEITE SALES
Nº Mat. 471 567
PROFESSORA: Suzana Martins
Mestranda: Karoline Ramos
Prática realizada nos dias 16 e 23/09/2019 
Horário 10h às 12h
FORTALEZA- CE
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................3
2. OBJETIVOS..................................................................................................5
3. MATERIAL..................,.................................................................................5
4. PROCEDIMENTOS E MÉTODOS................................................................5
5. ANÁLISES E RESULTADOS.......................................................................6
6. CONCLUSÃO...............................................................................................7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................7
1. INTRODUÇÃO
Um dos métodos para enumeração de microrganismos é a contagem do número de células viáveis, uma célula viável é aquela capaz de multiplicar-se e gerar células filhas. Este método denomina-se Método de Contagem em Placas que é fundamentado no fato de que quando uma célula isolada cresce num meio sólido, dará origem a uma colônia visível a olho nu.
Desse modo, ao se semear uma diluição de uma suspensão bacteriana, pode-se determinar o número de bactérias viáveis na população original pela contagem do número de colônias que se desenvolveram após o período de incubação. Além desse aspecto, supõe-se que a suspensão bacteriana seja homogênea e que não existam agregados ou arranjos de células.
Caso a cultura tenha tendência de formar grupamento de células, como os cocos, as contagens serão inferiores do que o número de células individuais , pois cada um dos arranjos formará uma colônia, neste caso, a contagem é expressa como “Unidades Formadoras de Colônia (UFC)”, cuja unidade é UFC/g ou UFC/mL.
É comum e necessário diluir as amostras em estudo para poder quantificar/enumerar o número de bactérias por meio da Técnica de Diluição Seriada. Nesta, 1 mL da amostra a quantificar é diluído pela adição de 9 ml de uma solução esterilizada adequada (água, tampão fosfato, solução salina, etc.) resultando numa diluição de 1:10 ou 10-1 da amostra original (ou seja a amostra original é diluída para 1/10). De modo semelhante preparam-se as diluições em série 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3),1:10.000 (10-4), 1:100.000 (10-5), etc. (FIGURA 1).
Figura 1 - Diluição seriada de uma cultura de microrganismos
No fim, uma alíquota de 0,1 ml de cada diluição é retirada e plaqueada no meio sólido adequado. Os meios são incubados nas condições adequadas ao crescimento das bactérias em análise. O número de colônias que cresce em cada meio permite calcular a concentração de bactérias presente na amostra original, multiplicando-o pelo fator de diluição.
Plaqueamento é o acondicionamento desta diluição em placa de Petri contendo um meio sólido de crescimento. Existem três métodos básicos para aplicação da amostra em meio sólido: espalhamento em placa (spread plate), espalhamento em profundidade (pour plate) e pour plate alternate (FIGURA 2).
Figura 2 - Técnicas do "pour-plate" e "spread-plate"
A técnica do spread plate é mais usada para aeróbios estritos, afinal o inóculo espalha-se na superfície da placa em contato direto com o ar. A superfície do meio de cultura deve estar seca para que seja embebida pelo líquido inoculado. O espalhamento do inóculo sobre a superfície da placa é feita com auxílio de uma alça de Drigalsky, tendo-se o cuidado para não danificar o meio.
No espalhamento em profundidade, pour plate ou pour plate alternate, a diferenciação da técnica reside na forma de homogeneizar o inóculo com o meio de cultura. Na pour plate faz-se movimentos em forma de 8 na Placa de Petri para homogeneizar, já na pour plate alternate a adição de 1 mL da diluição do inóculo é homogeneizado direto com o meio no tubo. Neste método microrganismos aeróbios estritos tem seu crescimento limitado uma vez que foi homogeneizado, além de que, o meio à temperatura média de 45º não favorece esse crescimento.
· Esperar solidificar o meio, inverter as placas e incubá-las a 35°C/48h. Estas técnicas são precisas quando o número de colônias situa-se entre 30 e 300 e quando as condições culturais e ambientais estão adequadas para os microrganismos analisados. Para minimização dos erros o ideal seria fazer triplicatas para cada diluição.
2. OBJETIVOS
· Determinar o número de microrganismos viáveis presentes numa amostra de Bacillus subitilis.
· Analisar as diferentes técnicas de contagem em placas.
3. MATERIAL 
· Microrganismos: 
· Bacillus subtilis
· Meios de cultura e soluções:
· ATGE (Ágar-Triptona-Glicose-Extrato de levedura)
· Solução salina fisiológica (tubos com 9mL de NaCl 0,85%)
· Equipamentos:
· Estufa bacteriológica a 35ºC
· Bico de Bunsen
· Diversos:
· Alça de Drigalsky
· Agulha de inoculação
· Placas de Petri esterilizadas
· Pipetas esterilizadas de 1 mL e 2 mL
· Tubos de ensaio
4. PROCEDIMENTOS E MÉTODOS
No laboratório de microbiologia atentando-se às técnicas assépticas procedeu-se à seguinte sequência de ações:
4.1 Diluições seriadas
· Partindo de uma cultura de Bacillus subtilis, tomou-se uma colônia isolada e inoculou-se em 1 ml de solução de NaCl 0,85%, fechou-se e agitou-se o tubo de ensaio;
· Tomando este 1mL preparou-se em tubos contendo 9mL de NaCl 0,85%, diluições seriadas para plaqueamento de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6 e 10-7;
A seguir, partiu-se para a etapa do plaqueamento.
4.2 Plaqueamento
· Aplicou-se primeiro a técnica do Spread plate tomando 0,1 mL do inóculo da diluição 10-5 e em seguida a 10-4, as quais foram distribuídas e espalhadas suavemente com auxílio da alça de Drigalsky sobre placas de Petri já contendo de 15 a 20 mL do meio ATGE fundido e a 45ºC; A escolha de uma porção menor (0,1 mL) é para que a secagem fosse mais rápida. 
· Partiu-se para a técnica do Pour plate, tomando-se 1mL da diluição 10-4 e 10-5 por meio de uma pipeta estéril e vertendo este inóculo em placas de Petri esterilizadas, A seguir pegou-se 15 a 20 mL do meio estéril ATGE quente (45ºC) e distribuiu-se sobre a placa fazendo movimento de rotação a fim de homogeneizar o inóculo com o meio;
· Demonstrou-se logo em seguida a técnica do Pour plate alternate, cuja diferença foi somente na forma de homogeneizar o inóculo com o meio ATGE, que neste procedimento é feito num tubo de ensaio e, logo após a agitação entre as mãos, é transferido para a placa de Petri;
· Esperou-se solidificar, inverteu-se as placas e incubou-as a 37ºC numa estufa bacteriológica por 24 a 48h;
	Para cada diluição utilizou-se duas placas (teste em duplicata).
4.3 Contagem de colônias
 Após o período de incubação, as placas foram removidas da estufa e dispostas para a contagem de colônias em cada placa.
As contagens foram feitas preferencialmente nas placas com um número de colônias entre 30 e 300.
5. ANÁLISES E RESULTADOS 
Após incubação, as placas (FIGURA 3) foram organizadas segundo a diluição crescente em duplicatas (não foram feitas em triplicatas pela falta de placas em número suficiente). 
Figura 3 - Placas contendo colônias para contagem
 
Por observação direta a olho nu foram identificadas e devidamente contadas as colônias em cada placa.
Calculou-se a concentração média, em unidades de UFC/mL, tomando-se o número média de colônias e multiplicando pelo Fator de diluição (número correspondente ao inverso da diluição).
 No caso das colônias originadas de Spread plate, onde se usou 0,1 mL do inóculo, o resultado deve ser multiplicado por um fator 10.
Além de Contagem padrão em placas, tratou-se também de Contagem estimada em placas, quando as placas apresentam mais de 300 colônias e devem ser divididas em seções radiais de 2, 4, ou 8 setores, entãoverifica-se o número de colônias de um setor e multiplica-se pelo total de seções..
 Apresentam-se alguns resultados obtidos e demonstrados em sala (TABELA 1).
Tabela 1 - Registro tabular de contagem
	Diluição
	Contagem (colônias/placa)
	Concentração média
(UFC/mL)
Pour plate
	Concentração média
(UFC/mL)
Spread plate
	1 x 10-4
	>300
	-
	-
	1 x 10-4
	>300
	
	
	1 x 10-5
	220
	280.105
ou
2,8 . 107
	2,8 . 107. 10
ou
2,8 . 108
	1 x 10-5
	340
	
	
	1 x 10-6
	170
	180 . 106
ou
1,8 . 108
	1,8 . 108. 10
ou 
1,8 . 109
	1 x 10-6
	190
	
	
Há uma norma para a interpretação e contagem padrão em placas que estabelece que se o quociente entre o maior e o menor valor do número de colônias for inferior a dois, basta fazer a média entre estes valores, mas se este quociente for maior que dois, deve-se tomar o menor valor de colônias.
6. CONCLUSÃO
A experimentação tratou da Diluição seriada, Plaqueamento e Contagem de colônias previamente preparadas em placas de Petri num meio de cultura ATGE.
Pode-se observar o crescimento de colônias de Bacillus subtilis e determinar o número destes microrganismos viáveis nas placas, bem como analisar as diferentes técnicas de contagem: spread plate, pour plate e pour plate alternate. 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SOARES, Juarez Braga; CASIMIRO, Antônio R. S de; AGUIAR, Laurência M. B. Microbiologia Básica. Fortaleza, Edições UFC, 1987. 175p.