Aula2EspectrofotometriaPrincpioseAplicaes_20220303105941

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Espectrofotometria
Princípios e Aplicações
Profª Drª Lilian Rodrigues Alves
Jaboatão dos Guararapes 
2022
Espectrofotometria
• A espectrofotometria é um método que estuda a interação da luz
com a matéria e a partir desse princípio permite a realização diversas
análises.
• Cada composto químico absorve, transmite ou reflete luz ao longo de
um determinado intervalo de comprimento de onda.
Espectrofotometria
• A espectrofotometria pode ser utilizada identificar e quantificar
substâncias químicas a partir da medição da absorção e transmissão
de luz que passa através da amostra.
• Absorbância
• Transmitância
Espectrofotometria
• Vamos supor que você olhe para duas soluções
da mesma substância, uma com maior
intensidade de cor que a outra.
• O que o senso comum diz? Que o mais escuro é o
mais concentrado.
Espectrofotometria
• Assim, tal como a cor da solução se intensifica,
sua concentração também aumenta.
• Esta é uma analogia com o princípio da
espectrofotometria: a intensidade da cor é a
medida da quantidade de um material em
solução.
Espectrofotometria
• Um segundo princípio é que cada substância absorve ou
transmite certos comprimentos de onda, mas não outros.
• Por exemplo, a cor de uma folha está relacionada com
comprimento de onda de luz.
• Cada cor tem um comprimento de onda diferente, então
quando a luz atinge um objeto, alguns comprimentos de
onda são absorvidos e outros transmitidos/refletidos de
volta.
Espectrofotometria
• A clorofila absorve luz vermelha e violeta,
enquanto que transmite amarela, verde e azul.
• Os comprimentos de onda transmitidos e
refletidos nos fazem perceber a cor verde.
Espectrofotometria
• É esse mesmo princípio de cor e comprimento de onda em que um
espectrofotômetro se baseia.
• Esse equipamento mede e compara a quantidade de luz que uma
substância absorve.
• Dessa forma é possível realizar uma análise quantitativa e qualitativa,
identificando e determinando a concentração das substâncias
conforme a interação com a luz.
Uso e Aplicação da Espectrofotometria
• É uma ferramenta importante e versátil amplamente utilizada para a
análise em diversas áreas como química, física, biologia, bioquímica,
materiais, engenharia química e aplicações clínicas e industriais.
Uso e Aplicação da Espectrofotometria
O espectrofotômetro é usado para medir:
• o crescimento bacteriano;
• determinados ingredientes em uma droga;
• diagnosticar um paciente com base na quantidade de ácido úrico 
presente em sua urina ou soro;
Uso e Aplicação da Espectrofotometria
• Sendo que as análises podem ser quantitativas (identificação da
concentração da substância) e qualitativas (identificação de uma
substância desconhecida), já que cada substância irá refletir e
absorver a luz de forma diferente.
Cores em Espectrofotometria
• A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui
características de onda e de partícula (fóton).
• E como já foi dito, os diferentes elementos absorvem energia em
comprimentos de onda específicos.
Cores em Espectrofotometria
• A cor de uma solução está relacionada ao comprimento de onda
complementar ao apresentado.
• Portanto, uma solução aparece como branca porque transmite luzes de
todas as cores.
• Quando absorve luzes de todas as cores, a solução é preta.
• Finalmente, a solução é verde quando absorve luz púrpura e transmite luz
verde, esta denominada de cor complementar.
Cores em Espectrofotometria
• As radiações eletromagnéticas com comprimento de onda entre 380
e 780 nm são visíveis ao olho humano.
• Abaixo de 380 nm é denominada ultravioleta (UV) e acima de 780 nm
correspondem à zona infravermelha.
Radiação Eletromagnética
Relação entre 
comprimento de onda e 
as características de cor
Princípio do Espectrofotômetro
• O espectrofotômetro é o equipamento utilizado para determinar os
valores de transmitância (luz transmitida) e absorbância (luz
absorvida) de uma solução em um ou mais comprimentos de onda.
• Ele mede a quantidade de fótons (a intensidade da luz) absorvida
depois de passar pela amostra. A quantidade de uma substância
química conhecida (concentração) também pode ser determinada.
Espectrofotômetro
Componentes do Espectrofotômetro
• Alguns componentes são comuns a todos os espectrofotômetros. A
luz, fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma
(monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes
monocromáticas).
Componentes do Espectrofotômetro
• O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em
uma cubeta.
• Parte da luz é absorvida e parte é transmitida.
• A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector (célula
fotelétrica) porque o sinal elétrico de saída do detector depende da
intensidade da luz que incidiu sobre ele.
• O sinal elétrico é lido como uma absorbância e é proporcional à
concentração da substância absorvente existente na cubeta.
Componentes do Espectrofotômetro
(a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora (e) cubeta contendo solução, 
(f) detector, (g) leitor.
Componentes do Espectrofotômetro
• Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de deutério e uma
lâmpada de tungstênio. A lâmpada de deutério emite radiação UV e a
de tungstênio emite luz visível.
Componentes do Espectrofotômetro
• Colimador: é um dispositivo, construído a partir de um material que
absorve radiação, usado para direcionar e suavizar feixes de radiação.
Componentes do Espectrofotômetro
• Prisma: transformam a luz incidida em vários comprimentos de onda,
permitindo a seleção do feixe de luz (monocromática) de acordo com
seu comprimento de onda.
Componentes do Espectrofotômetro
• Fenda seletora: seleciona o feixe de luz (monocromática) que irá
incidir sobre a amostra. A seleção do feixe de luz ocorre mediante o
uso de filtros de comprimento de onda.
Componentes do Espectrofotômetro
• Cubeta: é um pequeno recipiente utilizado para conter o material a
ser analisado. As cubetas podem ser quadradas, retangulares ou
redondas e são constituídas de vidro, sílica (quartzo) ou plásticas.
Observações sobre a CUBETA
• É preciso ter cuidado ao manusear as
cubetas, mesmo uma ligeira impressão
digital pode interferir nos resultados.
• É muito importante não tocar na superfície
óptica da cubeta, pois óleos de sua pele,
partículas de tecidos de limpeza, poeira e
outros contaminantes podem afetar as
leituras.
Observações sobre a CUBETA
• A utilização e limpeza corretas são a base de qualquer análise
espectrofotométrica, ajudando a evitar erros de medição.
• As cubetas não devem ser secas por aquecimento em uma estufa ou
chama porque isso pode provocar danos físicos e/ou mudar o
caminho óptico.
Componentes do Espectrofotômetro
• Detector: permite uma medida relativa da intensidade da luz
transmitida pela amostra.
Componentes do Espectrofotômetro
• Leitor: vai receber as informações do detector e mostrá-las em
valores numéricos de absorbância e transmitância.
O que é absorbância?
• Exprime a fração da energia luminosa que é absorvida por uma
determinada espessura/concentração de um material. Ou seja, a
capacidade de absorver a luz.
• A absorbância de uma solução está relacionada com a transmitância.
• Quando a absorbância de uma solução aumenta, a transmitância
diminui.
O que é transmitância?
• Exprime a fração da energia luminosa que consegue atravessar uma
determinada espessura de um material ou solução, sem ser
absorvida.
• Ou seja, a capacidade de transmitir a luz.
Absorbância X Transmitância
• Transmitância e absorbância tendem a ser grandezas
complementares.
• Assim, sua soma (para a mesma energia e comprimento de onda
incidente) é aproximadamente igual a 1 ou 100%.
• Se 90% da luz é absorvida, então 10% é transmitida.
Absorbância X Transmitância
I0 I
Padrão BRANCO em Espectrofotometria
• Utilizado antes do processamentos das amostras para “zerar” o
espectrofotômetro.
• Quando um feixe de luz monocromática atravessauma cubeta de
espectrofotômetro, parte da luz sofre refração, reflexão, absorção
pelos reagentes e outras interações indesejáveis.
Padrão BRANCO em Espectrofotometria
• Para eliminar tais interferências, deve-se zerar o aparelho com uma
solução que é denominada “branco”.
• O branco deve conter todos os constituintes do sistema, exceto a
amostra a ser estudada.
• A cada conjunto de determinações, bem como após alterar o
comprimento de onda, o aparelho deve ser sempre zerado e
calibrado com o tubo que contém o branco.
Cálculo da Absorbância - Espectrofotômetro
• Para o espectrofotômetro fornecer os valores de
absorbância, leva-se em consideração I0 e I.
• Usa-se o log da razão entre I0 e I.
Cálculo da Transmitância - Espectrofotômetro
• Para o espectrofotômetro fornecer os valores de
transmitância, leva-se em consideração I0 e I.
• Faz-se a razão entre I0 e I.
Cálculo da Absorbância a partir da 
Transmitância
A = 2 - log T
Calcule a absorbância de uma amostra, sabendo que ela transmite 90% da 
luz incidente.
a. 0,125
b. 1,880
c. 0,046
d. 0,98
e. 0,10
Cálculo da Absorbância a partir da 
Transmitância
A = 2 - log T
Calcule a absorbância de uma amostra, sabendo que ela transmite 90% da 
luz incidente.
a. 0,125
b. 1,880
c. 0,046
d. 0,98
e. 0,10
Cálculo da Transmitância a partir da 
Absorbância
T = 10-A
Calcule a transmitância de uma amostra, sabendo que ela teve uma 
absorbância de 0,912.
a. 12,25%
b. 24,60%
c. 10%
d. 49,18%
e. 16,77%
Cálculo da Transmitância a partir da 
Absorbância
T = 10-A
Calcule a transmitância de uma amostra, sabendo que ela teve uma 
absorbância de 0,912.
a. 12,25%
b. 24,60%
c. 10%
d. 49,18%
e. 16,77%
Análise Bioquímica usando Espectrofotômetro
• Existem vários kits comerciais para
realização das análises bioquímicas
laboratoriais.
• Basicamente serão necessários para esse
tipo de análise:
• Reagentes (do kit)
• Padrão (do kit = soro com valor do analito
pré-estabelecido)
• Amostra (paciente = valor desconhecido do
analito→ precisa ser dosado/determinado)
Análise Bioquímica usando Espectrofotômetro
• A maioria dos ensaios são feitos usando:
1° - Tubo branco ou “B” – contém todos os reagentes, mas nenhum
padrão ou amostra; serve para zerar/calibrar o espectrofotômetro.
2° - Tubo padrão ou “P” – contém reagentes + soro padrão com valor
pré-estabelecido pelo fabricante do kit.
3° - Tubo amostra ou “A” / Tubo teste ou “T”– contém reagentes +
soro do paciente (valor do analito a ser determinado).
Análise Bioquímica usando Espectrofotômetro
B P A
R R R
P A
Análise Bioquímica usando Espectrofotômetro
• Depois do preparo das reações geralmente é necessário que se
aguarde um período de incubação para que a reação colorimétrica
ocorra (pode ser em temperatura ambiente ou não).
• Finalizado esse tempo, os tubos são levados ao espectrofotômetro
para que haja a medição da absorbância.
• A seguinte ordem precisa ser respeitada: branco, padrão, amostra.
Análise Bioquímica usando Espectrofotômetro
• Os valores devem ser anotados e calculados seguindo as instruções
da bula de cada kit.
• Na bula são disponibilizadas todas as informações, incluindo a
fórmula para determinação da concentração do analito e os
respectivos valores de referência para interpretação dos resultados.
Bula – Glicose (Labtest)
Exemplo – Dosagem de Glicose
Paciente J. F. S., 33 anos, suspeita de 
diabetes.
Ateste = 0,362
Apadrão = 0,340
Qual é o valor da glicemia desse 
paciente? Interprete o resultado.
Exemplo – Dosagem de Glicose
Calculando...
Glicose (mg/dL) = 
0,362
0,340
x 100
Glicose (mg/dL) = 106,5mg/dL
Qual é o valor da glicemia desse 
paciente? 106,5mg/dL
Interprete o resultado. Acima do valor 
de referência (pré-diabetes).
Obrigada!