Medicina Laboratorial - Diagnóstico Laboratorial em Imunologia

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Diagnóstico Laboratorial em Imunologia 
IMUNOENSAIOS 
As técnicas imunológicas detectam a reação entre o 
antígeno e o anticorpo e, de acordo com esse principio, 
qualquer substância que se comporte como um antígeno 
pode ser identificada por esses ensaios. O objetivo de um 
imunoensaio, portanto, é que ele consiga determinar com 
precisão a concentração do analito. 
OBS: reações cruzadas podem afetar a especificidade de 
um imunoensaio, pois correlaciona-se com o grau que 
outros analitos reagem de forma cruzada no 
imunoensaio, interferindo em sua especificidade. 
QUALIDADE LABORATORIAL NO CONTEXTO DE 
IMUNOENSAIOS 
Um laboratório de análises clínicas precisa trabalhar em 
condições adequadas, com reagentes de qualidade, 
técnicas de diagnóstico precisos, profissionais qualificados, 
equipamentos vistoriados em termos de calibração, além 
de realizar o controle de qualidade interno e externo. 
DIAGNÓSTICO INDIRETO E DIRETO 
Diagnóstico indireto 
Os imunoensaios podem demonstrar a presença de 
anticorpos específicos no soro, sendo esse tipo de teste 
chamado de indireto ou de diagnóstico presuntivo, 
porque nem sempre a presença de anticorpos na 
circulação indica presença de infecção. 
Diagnóstico direto 
A identificação de presença de antígenos do agente 
infeccioso ou do próprio microrganismo é chamado de 
método diagnóstico direto, porque há limitações: pode 
haver poucos microrganismos circulantes ou 
mecanismos de camuflagem de vírus provocando 
resultado falso negativo e podem ocorrer reações 
cruzadas quando o anticorpo reconhece uma parte do 
antígeno (determinante antigênico ou epítopo). 
 
 
SOROLOGIA: APLICAÇÕES 
• Definição específica da doença (exemplo: hepatite B 
ou C); 
• Diferenciação da fase da doença; 
• Seleção de doadores de sangue e de 
doadores/receptores para transplante de órgãos; 
• Diagnóstico de doença congênita; 
• Avaliação de prognóstico de doenças; 
• Avaliação da eficácia terapêutica e/ou agravamento 
de uma determinada doença; 
• Avaliação da imunidade específica naturalmente 
adquirida ou artificialmente induzida; 
• Investigações epidemiológicas; 
• Triagem sorológica de doadores de sangue para 
bancos de sangue e hemocentros: além da tipagem 
sanguínea ABO e Rh, são feitos exames 
confirmatórios para vírus da imunodeficiência 
humana (HIV), vírus de hepatite B (HBV) e hepatite 
C (HCV), sífilis e doença de Chagas para produção 
de hemoderivados; 
• Diagnosticar doenças do sistema imunológico: 
autoimune (por exemplo, artrite reumatoide, 
diabetes tipo I, hepatite autoimune, doenças 
hemolíticas), doenças malignas (por exemplo, 
linfomas, leucemias), imunodeficiências adquiridas 
(como a AIDS, por intoxicação com fármacos ou 
radiação) ou congênitas e hipersensibilidade (alergias 
e dermatites, por exemplo); 
• Auxiliar no diagnóstico, prognóstico e prevenção de 
doenças infeccionas através da detecção de 
anticorpos séricos contra vírus (hepatite, influenza), 
bactérias (como a E.coli) e parasitas (por exemplo, 
teste sorológico rápido de doença de Chagas, malária 
e leishmaniose); 
• Detectar substâncias como drogas ilícitas e licitas, 
fármacos ou hormônios como o hCG (gonadotrofina 
coriônica no teste de gravidez), entre vários outros; 
• Identificar proteínas celulares (marcadores 
antigênicos celulares) e marcadores tumorais. 
TIPOS DE IMUNOENSAIOS 
• ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay); 
Beatriz Loureiro 
• Imunohistoquímica; 
• Imunofluorescênica; 
• Western blotting; 
• Citometria de fluxo. 
ASPECTOS GERAIS DAS TÉCNICAS DE 
SOROLOGIA 
 
IMUNOENSAIOS 
Imunoensaios de precipitação: consistem no teste mais 
simples pelo qual antígenos e anticorpos reagem entre 
si sem a necessidade de utilizar indicadores para a 
detecção. O complexo antígeno- anticorpo resultante 
pode ser visualizado qualitativamente como um 
precipitado a olho nu ou quantitativamente utilizando um 
detector. 
Imunoensaio de aglutinação de partículas: as grandes 
partículas apresentam padrões de aglutinação significativa 
que podem ser visualizadas a olho nu. As reações de 
aglutinação são muito empregadas no diagnóstico clínico 
laboratorial de doenças induzidas por vírus, bactérias, 
protozoários, parasitas e fungos, doenças autoimunes, 
assim como na identificação de hormônios, na 
classificação dos grupos sanguíneos, entre outras 
utilizações. Comparadas com a precipitação, os testes de 
aglutinação, embora sejam considerados como 
determinações semi-quantitativas, apresentam maior 
sensibilidade e necessitam de uma quantidade de 
anticorpos 500 vezes menor, visto que as partículas 
conseguem amplificar a reação. Exemplos: testes para 
identificação bacteriana e de protozoários, teste de 
aglutinação de látex para detecção de fator reumatoide 
IgM. 
Imunoensaios de inibição da aglutinação: é o método 
utilizado para a detecção de hCG (gonadotrofina 
coriônica humana) no teste de gravidez. Por meio de 
testes de inibição da hemaglutinação direta ou indireta 
pode-se detectar a presença de anticorpos virais 
(rubéola, sarampo, influenza) ou antígenos haptenos 
(molécula pequena que gera resposta imunológica 
somente quando acoplada a proteínas) na hepatite e na 
hemofilia. 
TESTES COMO MARCADORES RADIOATIVOS 
Como desvantagens, podemos destacar o elevado custo 
do teste, a meia-vida dos reagentes e o risco operacional. 
Apesar dessas desvantagens, que são inerentes à 
utilização de radioisótopos, essa técnica ainda é muito 
utilizada na pesquisa, embora na prática laboratorial venha 
sendo substituída por ensaios que não utilizam 
substâncias radioativas. O radioimunoensaio tem ampla 
utilização nas áreas de toxicologia, imunologia, 
endocrinologia, imunologia, dentre outras. Desta forma, 
pode ser usado na dosagem de substâncias ilícitas, na 
pesquisa de alergênios e anticorpos relacionados à 
alergia, na presença de antígenos e anticorpos em 
infecções virais e bacterianas, na quantificação de 
hormônios (como a insulina) e fármacos etc. 
TESTES SOROLÓGICOS 
Os testes têm progredido e estão cada vez mais 
refinados e com execução simples. Porém, com o intuito 
de manter a qualidade dos resultados, é necessário que 
haja um controle bem rigoroso. Assim, as metodologias 
devem ser padronizadas, com atenção em relação a: 
1. Concentração do antígeno; 
2. Especificidade dos anticorpos; 
3. Título dos conjugados; 
4. Tempo; 
5. Temperatura; 
6. Diluentes. 
ENSAIO ELISA 
O ensaio imunoenzimático ELISA é muito utilizado em 
exames laboratoriais de analises clínicas de diversos tipos: 
bioquímicos (dosagem de ferritina, de hormônios como 
o cortisol, de proteínas, de marcadores tumorais como o 
PSA-antígeno prostático especifico, de vitamina D, etc.), 
de microbiologia (sorotipagem de diversos 
microrganismos) e de imunologia para o 
imunodiagnóstico de infecções (por detecção de 
anticorpos ou antígenos de vírus, bactérias, fungos e 
Beatriz Loureiro 
parasitas), para dosagem de citocinas e proteínas 
inflamatórias de fase aguda, assim como para diagnóstico 
de hipersensibilidade, alergias, doenças autoimunes, etc. 
É uma técnica eficiente de identificação de proteínas e 
de antígenos e anticorpos por meio de marcador 
colorimétrico, fluorescente ou radioativo que é 
disponibilizado na forma de kits comerciais para 
diferentes aplicações. O ensaio é realizado em uma placa 
de micro titulação composta por diversos poços, onde 
são depositados os reagentes. 
 
Vantagens 
Elevada sensibilidade, pois detecta substâncias na ordem 
de nanograma, apresenta menor risco de falsos 
negativos (elevada especificidade), menor risco de falsos 
positivos, permite o teste de várias amostras 
simultaneamente, teste relativamente simples e de custo 
relativamente baixo. 
Desvantagens 
Necessidade de profissional especializado, susceptível a 
erros de pipetagem e outros erros na metodologia, 
causando alterações nos reagentes. 
Quantificações e doenças 
 O ensaio imunoenzimático do tipo ELISA pode ser 
utilizado para a realizaçãode testes de bioquímica, 
imunologia, dosagem hormonal e microbiologia. Na área 
de análises clínicas esse ensaio pode ser utilizado para a 
realização de diversos tipos de exames de rotina, por 
exemplo, HIV, HBsAg (hepatite B), PSA (Antígeno 
Prostático Específico), ferritina e etc. 
 
IMUNOENSAIOS 
• Proteína C reativa; 
• Antiestreptolisina O (ASO); 
• Fator reumatoide; 
• VDRL. 
PROTEÍNA C REATIVA (PCR) 
A proteína C reativa foi a primeira de uma série de 
proteínas reconhecidas como reagentes de fase aguda, 
que têm as suas concentrações plasmáticas alteradas em 
decorrência de estímulos inflamatórios diversos, tais 
como: infecções, doenças inflamatórias, processos 
necróticos e câncer. 
Outras proteínas de fase aguda: proteínas do 
complemento, imunoglobulinas, fibrinogênio, fator VIII da 
coagulação, ferritina, lipoproteínas, haptoglobina, amilóide 
“A” sérico (biomarcador), ceruloplasmina, ceruloplasmina, 
α1- antitripsina e α1-glicoproteína ácida. 
Os valores se elevam precocemente e retornam 
rapidamente aos níveis fisiológicos com a resolução da 
situação clínica. Desta forma, os valores da PCR começam 
a se elevar entre quatro a dez horas após o início da 
injúria ou estímulo, atingindo valores até 1000 vezes 
superiores aos níveis basais em cerca de 48 horas, 
retornando rapidamente aos valores iniciais com a 
melhora no quadro clínico. 
Recomendações para o uso da PCR 
 
 
Beatriz Loureiro 
ANTIESTREPTOLISINA O 
O exame de antiestreptolisina O (ASLO) é o teste 
laboratorial mais utilizado para determinar uma infecção 
prévia por Streptococcus pyogenes e seu estado 
evolutivo. Por outro lado, outros testes laboratoriais, tais 
como a velocidade de hemossedimentação (VHS) e a 
proteína C reativa, podem sinalizar um processo 
inflamatório recente. 
As bactérias do tipo estreptococos beta hemolíticos do 
grupo A produzem dois tipos de estreptolisinas (toxinas): 
estreptolisina O e a estreptolisina S. A estreptolisina O é 
fortemente antigênica, induzindo a produção de 
anticorpos correspondente, ou seja, antiestreptolisina O 
(ASLO). 
Dessa forma, a determinação do título de ASLO 
apresenta um papel fundamental também no diagnóstico 
da febre reumática, com 80% de resultados positivos. 
Também temos resultados positivos em 85% dos casos 
de faringites e 50% dos casos de glomerulonefrite difusa 
aguda. 
A infecção estreptocócica é mais frequente na 
população com idade entre 5 e 15 anos, entretanto possa 
ser detectada em qualquer fase da vida. Idade entre 5 e 
15 anos, também é a faixa etária de maior incidência da 
febre reumática. Isso ocorre porque corresponde a uma 
faixa etária de maior susceptibilidade às infecções do 
trato respiratório superior. 
FATOR REUMATOIDE 
No soro a imunoglobulina mais frequentemente dosada 
para a determinação do fator reumatoide é a IgM, no 
entanto in vivo o fator reumatoide pode ser das classes 
IgA e IgG. O fator reumatoide é um teste que apresenta 
sensibilidade, porém tem pouca especificidade (em torno 
de 70%), mesmo assim é um ensaio de suma 
importância para o diagnóstico e prognóstico da artrite 
reumatóide. O fator reumatóide pode ser dosado no soro 
de pacientes antes do aparecimento dos sintomas, mas 
nessa fase inicial, o teste tem uma sensibilidade baixa (em 
torno de 40%). 
Resultados negativos para o fator reumatóide não 
excluem o diagnóstico da artrite reumatóide e resultados 
positivos também devem ser interpretados em conjunto 
com outros ensaios e com a sintomatologia clínica, visto 
que diversos outros processos, reumatológicos ou não, 
podem dar resultados positivos para o fator reumatóide. 
Desta forma, algumas patologias como a hanseníase, 
algumas parasitoses (malária, esquistossomose, filariose) e 
a hepatite podem apresentar resultados positivos para o 
fator reumatóide, mas com baixos títulos. E mais: o fator 
reumatóide pode ser dosado no soro de pacientes com 
doenças autoimunes, infecciosas, neoplasias e 
hiperglobulinemias. 
Diagnóstico 
O diagnostico da AR é dado por diversos achados, e não 
há um único exame que faça o diagnóstico preciso de 
100%. Por isso são necessários resultados de exames 
laboratoriais e a presença de sinais e sintoma clínicos que 
levem a um diagnóstico o mais precoce possível para 
diminuir os danos causados pela doença, principalmente 
as deformações articulares periféricas. 
VDRL: SÍFILIS 
O diagnóstico da sífilis baseia-se na avaliação clínica e nos 
testes sorológicos. Na maioria das vezes o diagnóstico 
sorológico é o mais utilizado, visto que, de acordo com a 
evolução da doença, em sua maior parte, o paciente 
procura atendimento médico após a fase inicial da doença 
(caracterizada pelo surgimento de úlcera). Desta maneira, 
a única forma de identificar a forma latente da sífilis 
adquirida é o diagnóstico sorológico laboratorial, sendo 
dois testes os mais utilizados: testes antigênicos não 
treponêmicos ou testes lipídicos (VDRL – veneral disease 
research laboratory e RPR – rapid plasm reagin); testes 
treponêmicos ou pesquisa de anticorpos verdadeiros. 
O treponema tem uma fração lipídica em sua 
constituição antigênica que é semelhante ao fosfolipídio 
cardiolipina, desta forma os testes denominados como 
não treponêmicos ou lipídicos reagem com a cardiolipina, 
detectando os anticorpos do tipo reaginas. A cardiolipina 
forma um antígeno sorologicamente ativo, capaz de 
detectar anticorpos humorais presentes no soro de 
pacientes com a sífilis ativa (cerca de uma a quatro 
semanas após o aparecimento da lesão primária). 
As determinações quantitativas do VDRL, expressas em 
títulos, em geral se elevam até o estágio secundário. Os 
valores dos títulos tendem a diminuir, podendo ocorrer o 
desaparecimento da reatividade mesmo sem o 
tratamento da doença. Isso ocorre a partir do primeiro 
Beatriz Loureiro 
ano do aparecimento da doença em sua fase inicial. Com 
o tratamento da doença, o VDRL tende a apresentar 
valores negativos entre 9 e 12 meses, entretanto a 
reatividade em baixos títulos pode perdurar por toda a 
vida (títulos menores ou iguais a 1:8). Essa reatividade 
residual é denominada como memória sorológica, 
podendo significar em termos de título, uma infecção 
muito recente ou muito antiga, com ou sem tratamento. 
Algumas situações patológicas, tais como determinadas 
infecções virais e bacterianas, algumas parasitoses, 
doenças autoimunes e outras situações fisiológicas, como 
idade avançada, gravidez e uso de algumas substâncias 
químicas, podem levar a resultados falso-positivos para 
sífilis, uma vez que podem liberar antígenos lipídicos, 
levando à síntese de reaginas. Esses resultados falso-
positivos ressaltam a não-especificidade das reações não 
treponêmicas. 
Diagnóstico 
Os testes treponêmicos, que utilizam antígenos de T. 
pallidum através de reações imunológicas de elevada 
especificidade e sensibilidade, são ideais para a exclusão 
dos resultados falso-positivos verificados pelos testes 
não-treponêmicos. A desvantagem dos testes 
treponêmicos é o elevado custo: por utilizarem 
procedimentos mais complexos, têm um alto custo, por 
isso mesmo não estão ainda disponíveis como testes de 
rotina. 
HEPATITES VIRAIS: DIAGNÓSTICO 
O diagnostico diferencial é importante, pois outros vírus 
(herpes e febre amarela) podem causar hepatites agudas, 
havendo ainda as hepatites agudas e crônicas não virais 
(medicamentoso, autoimune, hemocromatose, do 
alcoolismo ou por produtos tóxicos). 
É importante conhecer que, juntamente com os sinais 
clínicos de inflamação dos hepatócitos, a viremia se eleva 
até o seu valor máximo (que pode ser variável) e depois 
decai. A concentração de antígeno do vírus de hepatite 
diminui a medida que aumenta a concentração de 
anticorpo IgM e somente vários meses depois ocorre 
aumento do anticorpo IgG. O grande problema é que a 
maioria das hepatites virais são assintomáticas na fase de 
transmissão da doença. 
 
Diagnóstico Laboratorial: Hepatite C 
O diagnóstico laboratorialda hepatite C é feito por 
detecção do anti-HCV que é encontrado tardiamente (3 
meses após a infecção), sendo que na fase mais aguda 
só é possível identificar a infecção pelo RNA viral por 
método de biologia molecular (reação em cadeia da 
polimerase, PCR). Todos os profissionais de saúde que 
mantém RNA-HCV positivo na 12a semana após acidente 
com material contaminado devem ser avaliados sobre a 
necessidade de ser tratado com medicamentos antivirais 
para prevenir evolução para forma crônica. Para escolha 
adequada do tratamento e de sua duração em pacientes 
com diagnóstico positivo para hepatite C, a Sociedade 
Brasileira de Hepatologia recomenda que seja feita a 
confirmação da etiologia pelo HCV por realização de 
biópsia hepática, além da quantificação da carga viral 
(antígeno do HCV e anticorpo IgG anti-HCV) através de 
teste sorológico por enzima imunoensaio (ELISA) e 
acompanhamento constante do ALT (alanina 
aminotransferase) que é o marcador de lesão 
hepatocelular. 
Diagnóstico Laboratorial: Hepatite B 
O antígeno HBsAg (antígeno de superfície do vírus de 
hepatite B) é o primeiro marcador sorológico detectável, 
aparecendo entre a 2a e 10a semana após exposição ao 
vírus, antes da elevação de ALT (alanina 
aminotransferase) e das manifestações clinicas. O 
anticorpo contra esse antígeno (anti-HBsAg) em geral 
persiste na maioria das pessoas por toda a vida, 
mostrando imunização. 
Se a infecção pelo vírus HBV persiste, a resposta imune 
inicial é substituída pela produção de anticorpo anti-HBc 
IgM, que é um marcador de fase aguda direcionado 
contra os antígenos HBcAg (antígeno do nucleocapsídeo 
do vírus denominado) que aparece 30 dias após a 
infecção e permanece por mais 6 meses 
aproximadamente. 
Logo depois ou ao mesmo tempo, passa a ser produzido 
o anticorpo anti-HBeAg (contra o antígeno HBeAg que 
é uma partícula “e” do vírus). Essa fase pode durar 
semanas ou anos. A permanência do antígeno HBeAg no 
3o mês após infecção indica evolução para a fase 
crônica, sendo produzidos anticorpos IgG contra os 
antígenos HBc e HBs. 
Beatriz Loureiro 
Os testes imunológicos para diagnóstico de hepatite B 
detectam os antígenos HBsAg, HBcAg e HBeAg e os 
anticorpos produzidos contra esses diferentes antígenos 
virais: Anti-HBsAg, anti-HBcAg e anti-HBeAg. Na hepatite 
aguda os anticorpos são imunoglobulinas IgM e na fase 
crônica são imunoglobulinas IgG. 
 
CASO CLÍNICO 
Clarisse, que trabalha como agente de saúde, tem 22 
anos e está grávida de 4 meses. Ela deu entrada no 
hospital com quadro de icterícia, mialgia, abdome 
doloroso a palpação no lado direito e hepatomegalia. 
Notem que estes são sintomas de hepatite aguda. As 
suas fezes estão esbranquiçadas e a urina escura. Vejam 
que temos aqui a hipocolia fecal – fezes esbranquiçadas 
por falta de urobilinogênio/bile e colúria – urina escura. 
O aumento no tamanho do fígado (hepatomegalia) com 
dor, indica que está se desenvolvendo um processo 
inflamatório no fígado, ou seja, a hepatite. 
Foram realizados exames para hepatite B devido ao 
exame positivo de seu parceiro um mês atrás. Os 
resultados dos exames de disfunção hepática foram 
compatíveis com hepatite aguda apresentando valores 
de ALT e AST elevados, com predominância de ALT, 
além de elevação significativa de fosfatase alcalina e gama 
GT. 
Causas da urina escura, icterícia, elevação de fosfatase 
alcalina e gama GT? 
Os resultados dos exames sorológicos foram: 
• HBsAg: positivo. 
• Anti-HBc: positivo. 
• HBeAg: negativo. 
• Anti-HBe: positivo. 
• Anti-HBc IgM: positivo. 
• Anti-HAV IgM: negativo (Hepatite A). 
• Anti-HCV: negativo. 
Interpretação do resultado? O anti-HBe positivo indica 
que a paciente está no período de convalescença com 
chance de resolução espontânea, sem a necessidade de 
medicamentos que apresentam muitos efeitos colaterais. 
Como seria o resultado da resolução da hepatite aguda? 
A resolução da hepatite aguda é diagnosticada pela 
negativação do HBsAg e aparecimento de anti-HBs total 
positivo. 
Sr. Eduardo é aposentado, tem 60 anos de idade, 
trabalhava como barbeiro no interior de Minas Gerais e 
está com problemas de saúde há algum tempo, e 
atualmente seu quadro vem piorando a cada dia, pois 
está com tontura, enjoo, vômitos, febre, dor abdominal, 
pele e olhos amarelados, urina escura e fezes muito 
claras. Foi internado no hospital porque vomitou sangue, 
a barriga está inchando e ele sente dores abdominais. 
Devido a suspeita de hepatite crônica foram solicitados 
exames de marcadores de função hepática, testes para 
infecção por vírus de hepatite B e C e HIV. Os exames 
revelaram hepatite crônica por HCV (vírus de hepatite C) 
sem coinfecção por HIV, e foi então solicitado biopsia 
hepática para estadiamento da hepatite crônica e definir 
o tratamento. 
Explique quais como foram os testes laboratoriais 
realizados. 
Os exames de função hepática para diagnóstico de 
hepatite são: enzimas ALT/AST e fosfatase alcalina e 
gama GT para colestase. 
Os exames essenciais para pesquisa de infecção viral são 
imunológicos: HBs-Ag, HBc-Ag, HBe-Ag, anti-HBs, anti-
HBc, anti-HBe para a hepatite B e anti-HCV para a 
hepatite C. 
Existem testes sorológicos para HIV (anti-HIV 1 e anti-HIV 
2) utilizando o imunoensaio enzimático ELISA e em caso 
de positividade em um dos testes, a confirmação é feita 
por imunofluorescência indireta (IFI) ou Western blot. 
Beatriz Loureiro