Métodos em Genética Molecular

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Métodos em Genética Molecular
Objetivo: estudar variações genéticas entre indivíduos
Diagnóstico
Aconselhamento/Consulta genético
Compreensão da patogênese
Tratamento
Extração de DNA
Pode ser feita em qualquer célula (viva ou morta) nucleada (ou seja, não é possível 
fazer a extração de DNA pelas hemácias)
Etapas:
Obtenção do Tecido → define a técnica que será usada
Ruptura de células → ação mecânica (centrifugação, picotagem)
Digestão de proteínas (proteinases) e RNA (RNAases)
Precipitação do DNA (solução salina, álcool gelado)
Como?
Kits caseiros vendidos por empresas privadas
Salting out → aglutinação das moléculas de DNA
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Eletroforese de DNA 
Analisar a presença de DNA e separar em fragmanetos
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água 
fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina
Um gel de agarose é preparado e submete-se o DNA (que está em pequenos 
poços) a uma corrente elétrica, e ele se deslocando do polo negativo para positivo, 
por ser levemnete negativamente carregado
O teste serve para avaliar a qualidade da extração do DNA
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RFLP (Restriction Fragments Lenght Polymorphisms)
Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição
Etapas
Digestão do DNA por enzimas de restrição (atuam em lugares específicos do DNA)
Ex: enzima Eco RI → atua no sítio de restrição
Sempre corta o RNA onde tem uma sequÊncia 5’ GAATC 3’ - corta entre G 
e o A
Os fragmentos também podem ter mutação, ou seja, em um indíviduo corta e no 
outro em que ocorreu a mutação, a enzima não reconhece e não corta naquela região, 
portanto os indivíduos terão tamanhos diferentes de fragmentos de restrição.
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Isso é visto na eletrosforese, onde ocorre a separação dos fragmentos de restrição. 
Os fragmentos menores deslocam-se mais rápido no gel, ocorrendo uma separação de 
fragmentos por tamanho.
Cada indivíduo possui fragmentos de restrição em número e tamanhos diferentes, o 
que permite utilizar esta técnica para identificação de pessoas ou evidências
Para teste de paternidade, a criança terá fragmentos do pai e da mãe, sendo 
excluídos os que a mãe tem e que a criança tem, pois então herdou do pai
Fragmento informativo: criança tem e a mãe não
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STR (Pequenas repetições in tandem)
Análise mais usada que RFLP
Microsatélites - 2 a 6 pares de base
O indivíduo pode ter 10 repetições de uma mesma sequência. Isso faz com que o 
fragmento tenha um tamanho diferente de um indíviduo que tem mais repetições 
desses microssatélites
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Hoje são 20 regiões de microssatélites utilizadas para fazer essa análise de vínculo 
biológico
DNA fingerprint
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Antes dessas técnicas mais específicas, as que eram usada para teste de 
paternidade eram: tipagem sanguínea e expressão de HLA (usado para 
transplantes)
Clonagem Molecular
Isolamento de um gene
Construção de ‘’bibliotecas’’ genômicas → várias cópias da mesma região do DNA
A sequência retirada é inserida em hospedeiros (bactérias, leveduras, 
cromossomos artificiais desse organismos) → o organismo acaba gerando cópias 
do gene de interesse
Vetores (moléculas de DNA) que recebem o fragmento de DNA a ser clonado 
(plasmídios, bacteriófagos, BACs, YACs)
O hospedeiro/vetor escolhido depende do tamanho do gene
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
Polimerase = enzima responsável por fazer a duplicação do DNA
É um processo de replicação de um fragmento de DNA in vitro
O fragmento é determinado por primers (já prontos, sem necessidade da primase), 
os quais definem onde deve iniciar a replicação
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Além dos primers, para que a replicação ocorra são utilizados ciclos de 
temperatura para separar as fitas de dupla-hélice e para uni-las novemente → não 
há necessidade para as enzimas normalmente presentes no processo
Desnaturação: quebra das pontes
Anelamento: ligação do primer
Duplicação: união das pontes
A DNApolimerase natural seria degradada caso fosse submetida às 
temperaturas altas, por isso foi usada DNApolimerase termoestáveis (de 
organismos que ficam em beiras de vulcões, etc.)
O processo ocorre em um equipamento chamado termociclador que faz essa 
alteração de temperaturas
Também são adicionados a DNApolimerase e os nucleotídeos - DNTPs (com as 
bases A, T, C, G)
Solução tampão: íons de magnésio que facilita ou dificulta a ligação dos primers 
com o DNA alfa
A especificade depende da concentração desses íons e da temperatura
Permite a análise de DNA até mesmo de uma única célula
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A vantagem desse método é que pode ter uma quantidade inicial de tecido baixa 
e com a PCR é possível amplificar essa molécula em uma quantidade suficiente 
para ser analisada
Tempos e temperaturas podem variar de acordo com o tamanho do primer, laboratório
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Hibridação de Sondas
Consiste em usar segmentos de DNA fita simples, ou RNA, conhecidos ou não 
como sonda e buscar complementar uma região específica do DNA (de interesse 
do pesquisador). São utilizados para localizar esta sequência no DNA de um 
indivíduo
Se ocorrer a hibridação então o indivíduo tem o gene
As sondas podem ser marcadas com isótopos radioativos, fluorocromos ou outros 
corantes para evidenciar se ocorreu ou não a hibridação entre e sonda e DNA alvo
Southern Blotting
Uma das primeiras técnicas
Usada mais para estudo do DNA mesmo
Diagnóstico de Leishmaniose
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Faz a eletroforese → em cima do gel coloca-se uma membrana → coloca-se, ainda 
papeis toalhas e um peso em cima → promove por capilaridade a passagem dos 
fragmentos de DNA que estão no gel para essa membrana → pega a membrana e faz 
a marcação (sonda) → espera um tempo para ocorrer a debridação → lava a 
membrana algumas vezes → excesso de sonda vai ser descartado → fica só com as 
sondas que estarão ligadas na membrana propriamente
Variações:
RNA = Northern Blotting
Proteínas = Western Blotting
Hibridização in situ com fluorescência (FISH)
Analisar números de cromossomos
Existem sondas para cromossomos específicos → por exemplo: cromossomo 21, 
vemos no microscópio e o paciente tem 2
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CGH Hibridização Genômica Comparativa
Nessa técnica ocorre a hibridização de genomas inteiros
Muito utilizado para diagnóstico de câncer
3 genomas serão utilizados: de indíviduo em que queremos o diagnóstico, de um 
indíviduo que sabemos que não tem o tumor e de um indivíduo que sabemos que 
tem o tumor
Consiste em promover a hibridação entre moléculas de DNA de tecido normal e de 
tecido alterado e comparar a expressão de genes nos dois tipos de tecido
Foi desenvolvida através da aplicação de sondas (fragmentos de DNA) sobre 
metáfases, sendo que a visualização permitia verificar diretamente sobre os 
cromossomos as regiões com perda ou ganho de expressão
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Tecnologia aCGH
Tecnologia de microarranjos
Com aplicações de sondas sobre DNA extraído, disposto em pequenos pontos 
(spots) em uma lâmina
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Sequenciamento de DNA
É o método mais espécifico, pois vemos letra por letra
Determinação da sequência de um fragmento de DNA para comparação com 
sequências padrões
Pode ser utilizado para identificação de pessoas ou evidências, diagnóstico de 
infecções, genes mutantes para doenças genéticas
Comparando a hibridização de sondas: as sondas às vezes são específicas para 
determinadas mutações, sendo necessário vários testes em alguns casos, já no 
sequenciamento é necessário apenas 1
Reação
Fragmento de DNA (fita simples)
1 primer
DNA polimerase
dNTPs
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ddNTPs → interrompe a formação da fita (forma-se fragmentos de DNA de 
diversos comprimentos)
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Sequência não confiável, não deve haver sobreposição
Sequência confiável, sem sobreposições
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Alinhamento = comparação das mesmas regiões de indivíduos diferentes