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Prof. Ms. Guilherme Pimpão Cavalcante ROTEIRO AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA Guarapuava 2022 1 Apresentação A bioquímica é a ciência que estuda as biomoléculas, isto é, moléculas envolvidas com a formação e manutenção da menor unidade viva – a célula. Sendo assim, torna-se essencial a compreensão ase estruturas e funções de biomoléculas importantes para o metabolismo dos seres vivos. As principais biomoléculas existentes são os carboidratos, lipídeos, aminoácidos, proteínas e os ácidos nucleicos. Estas juntamente com outras moléculas regulatórias como vitaminas e minerais atuam nos mecanismos de geração de energia, síntese e divisão celular. Com base em suas propriedades químicas alguns experimentos podem ser feitos de forma a caracterizar as biomoléculas e ajudar a compreender suas ações na célula. A Bioquímica permite observar como a versatilidade das biomoléculas são determinantes para a formação da célula. Assim, esta apostila tem como objetivo facilitar o acompanhamento da parte prática da disciplina de Bioquímica e Biofísica Veterinária da Faculdade Guarapuava. 2 Introdução Laboratórios são lugares de trabalho que necessariamente não são perigosos, desde que certas precauções sejam tomadas. Acidentes em laboratório ocorrem frequentemente em virtude da pressa excessiva na obtenção dos resultados. Todo aquele que trabalha em laboratório deve ter responsabilidade e deve evitar atitudes que possam acarretar acidentes e possíveis danos para si e para os demais. Deve prestar atenção a sua volta e se prevenir contra perigos que possam surgir do trabalho de outros, assim como do seu próprio. O usuário de laboratório deve, portanto, adotar SEMPRE uma atitude atenciosa, cuidadosa e metódica no que faz. Deve, particularmente, concentrar-se no trabalho que faz e não permitir qualquer distração enquanto trabalha. Da mesma forma não deve distrair os demais enquanto desenvolvem trabalhos no laboratório. REGRAS BÁSICAS DE SEGURANÇA 1. Use óculos protetores de olhos, sempre que estiver no laboratório. 2. Use sempre jalecos, de algodão com mangas compridas. 3. Não fume, não coma ou beba no laboratório. 4. Não jogue material insolúvel nas pias. Use um frasco de resíduo apropriado. 5. Não jogue resíduo solventes nas pias. Resíduos de reações devem ser antes inativados, depois armazenados em frascos adequados. 6. Em caso de acidente, mantenha a calma, desligue os aparelhos próximos, inicie o combate ao fogo, isole os inflamáveis, chame os bombeiros. 7. Ao sair do laboratório, o último desliga tudo, e verifica se tudo está em ordem. 8. Nunca jogue no lixo restos de reações. 9. Se atingir os olhos, abrir bem as pálpebras e lavar com bastante água. 10. Durante as atividades práticas não será permitido ao professor, alunos ou funcionários a permanência em laboratório sem o uso do jaleco ou trajando bermudas, shorts ou sapatos “abertos”, por exemplo chinelos. 11. As aulas práticas deverão ter o acompanhamento contínuo do professor durante todo o seu desenvolvimento. Toda a vidraria utilizada em uma análise química deve estar perfeitamente limpa antes do uso, pois a presença de substâncias contaminantes pode induzir erros no resultado final da análise. Após o devido uso, as vidrarias devem ser lavadas com auxílio de escovas e solução de detergente, enxaguados com água corrente (torneira) e secando em local protegido da poeira. AO FINAL DA AULA TODAS AS VIDRARIAS DEVEM ESTAR LIMPAS E ORGANIZADAS SOBRE A BANCADA! 3 4 5 Materiais básicos de laboratório 1. Tubo de ensaio: Usado em reações químicas, principalmente testes de reação. 2. Béquer (ou Becker): Usado para aquecimento de líquidos, reações de precipitação, etc. 3. Erlenmeyer: Usado para titulações e aquecimento de líquidos. 4. Balão de Fundo Chato: Usado para aquecimento e armazenamento de líquidos. 5. Balão de Fundo Redondo: Usado para aquecimento de líquidos e reações com desprendimento de gases. 6. Balão de Destilação: Usado em destilações. Possui saída lateral para a condensação dos vapores. 7. Proveta ou Cilindro Graduado: Usado para medidas aproximadas de volumes de líquidos. 8. Pipeta Volumétrica: Para medir volumes fixos de líquidos. 9. Pipeta Cilíndrica: Usada para medir volumes variáveis de líquidos. 10. Funil de Vidro: Usado em transferências de líquidos e em filtrações. O funil com colo longo e estrias é chamado de funil analítico. 11. Frasco de Reagentes: Usado para armazenamento de soluções. 12. Bico de Bunsen: Usado para aquecimento de laboratório. 13. Tripé de Ferro: Usado para sustentar a tela de amianto. 14. Tela de Amianto: Usada para distribuir uniformemente o calor em aquecimentos. 15. Cadinho de Porcelana: Usado para aquecimentos à seco (calcinações) no bico de Bunsen e Mufla. 16. Triângulo de Porcelana: Usado para sustentar cadinhos de porcelana em aquecimentos diretos. 17. Estante para Tubos de Ensaio: Suporte de tubos de ensaio. 18. Funil de Decantação: Usado para separação de líquidos imiscíveis. 19. Funil de Decantação: Usado para separação de líquidos imiscíveis. 20. Pinça de Madeira: Usada para segurar tubos de ensaio durante aquecimentos diretos. 21. Almofariz e Pistilo: Usados para triturar e pulverizar sólidos. 22. Cuba de Vidro: Usada para banhos de gelo e fins diversos. 23. Vidro de Relógio: Usado para cobrir béqueres em evaporações, pesagens e fins diversos. 24. Cápsula de Porcelana: Usada para evaporar líquidos em soluções. 25. Placa de Petri: Usada para fins diversos. 26. Dessecador: Usado para resfriar substâncias em ausência de umidade. 27. Pesa-Filtros: Usado para pesagem de sólidos. 28. Lima Triangular: Usada para cortes de vidro. 29. Bureta: Usada para medidas precisas de líquidos. Usada em análises volumétricas. 30. Frasco Lavador: Usado para lavagens, remoção de precipitados e outros fins. 31. Pisseta: Usada para os mesmos fins do frasco lavador. 32. Balão Volumétrico: Usado para preparar e diluir soluções. 33. Picnômetro: Usado para determinar a densidade de líquidos. 34. Suporte Universal: Usado para sustentação de peças. 35. Anel para Funil: Preso à haste do suporte universal, sustenta o funil de filtração. 36. Mufa: Preso à haste do suporte universal, sustenta a garra metálica. 37. Garra Metálica: Usada para sustentação de peças, tais como condensador, funil de decantação e outros fins. 38 e 39. Kitassato e Funil de Buchner: Usados em conjunto para filtrações a vácuo. 40. Trompa de Vácuo: Usada em conjunto com o kitassato e o funil de Buchner. 6 Como fazer um bom relatório? Como escrever um bom relatório? O relatório deve descrever o que foi realizado durante o procedimento experimental. Descrição realizada com auxílio de referências bibliográficas. Qual é a estrutura de um relatório experimental? 1. Capa Deve conter o nome da instituição, título do experimento, o nome completo dos autores, o local e a data na qual o experimento foi realizado. 2. Sumário (opcional, pois depende do tamanho relatório experimental) Dependendo do tamanho, um índice auxilia a encontrar o local exato de cada item do relatório. Deve conter toda a estrutura do relatório. 3. Resumo Deve enunciar, brevemente (no máximo 250 palavras), os tópicos teóricos e o problema estudado, os processos envolvidos e os principais resultados obtidos. Não deve ser generalizada e sim, apresentar frases curtas e diretas. 4. Objetivos Todos os objetivos e metas a atingir devem ser esclarecidos neste item. 5. Introdução (ou Referencial Teórico) Deve trazer o embasamento teórico relacionado ao conteúdo estudado e começar abordando o assunto de forma mais ampla, dando uma perspectiva geral do problema em estudo. À medida que for progredindo, a introdução deve ir focando assuntos mais específicos do experimento, até abordara área tratada no relatório. 6. Materiais e métodos Deve conter basicamente dois itens: A) O relato do roteiro para realizar o experimento, ou seja, o passo a passo, tudo o que foi feito durante o experimento B) A descrição dos materiais, equipamentos e reagentes utilizados para realizar o experimento com suas devidas especificações. 7 7. Resultados e discussão Devem ser apresentados os resultados coletados durante o procedimento experimental. O uso de esquemas, tabelas, gráficos e figuras são sempre recomendados, pois facilitam a compreensão dos dados expostos permitindo uma rápida interação e interpretação dos resultados. Uma profunda discussão dos resultados é fundamental para que o autor demonstre a relevância do trabalho e consequentemente verifique o seu real aproveitamento. É na discussão que o autor tem a oportunidade de mostrar o sucesso do experimento ou, no caso do experimento não ter funcionado como esperado, pode-se explicar os motivos que levaram a isso. 8. Conclusões Devem conter os principais resultados do experimento e analisar se o objetivos propostos no início foram alcançados em sua plenitude ou parcialmente. 9. Referências bibliográficas A referência bibliográfica é constituída pelos principais livros e artigos consultados. 8 Sumário Apresentação 1 Introdução 2 Experimento 01. Escalas de pH e solução tampão 9 Experimento 02. Proteínas 14 Experimento 03. Enzimas 17 Experimento 04. Carboidratos 20 Experimento 05. Ácidos nucleicos 23 Experimento 06. Lipídeos 26 9 Experimento 01 Escalas de pH e solução tampão Assim como o suco de limão é ácido, a água pura é neutra e a soda cáustica ou bicarbonato de sódio são alcalinos (básicos), também os solos podem apresentar-se com uma dessas características. O termo pH define a acidez ou a alcalinidade relativa de uma solução. A escala de pH cobre uma amplitude de 0 a 14 (Figura 1). Um valor de pH igual a 7,0 é neutro, ou seja, as atividades dos íons H+ E OH- em solução são iguais. Valores abaixo de 7,0 são ácidos (predomina o H+) e acima de 7,0 são básicos (predomina o OH- na solução do solo). Na maioria dos solos o pH da solução do solo (fase líquida do solo) varia entre os valores de pH 4, e 9,0 (LOPES, 1989). Figura 1. Escala de pH (Fonte: Neta, 2002). LOPES (1989), explica que o pH do solo simplesmente mede a atividade do íon hidrogênio e é expresso em termos logarítmicos. O significado prático da relação logarítmica é que cada unidade de mudança no pH do solo significa uma mudança de dez vezes no grau de acidez ou de alcalinidade. Isto quer dizer que um solo com pH 6,0, tem um grau de acidez 10 vezes maior do que um solo com pH 7,0, ou seja, 10 vezes mais H+ ativo. As soluções tampões são soluções que resistem a mudanças de pH quando a elas são adicionados ácidos ou bases ou quando uma diluição ocorre. Essa resistência é resultado do equilíbrio entre as espécies participantes do tampão. Um tampão é constituído de uma mistura de um ácido fraco e sua base conjugada ou de uma base fraca e seu ácido conjugado. Os tampões têm um papel importante em processos químicos e bioquímicos, nos quais é essencial a manutenção do pH. Assim, muitos processos industriais e fisiológicos requerem um pH fixo para que determinada função seja desempenhada. Por exemplo, o sistema tampão H2CO3/HCO3– é importante fisiologicamente, uma vez que controla o transporte de CO2 no sangue e o pH do mesmo (Fiorucci et al., 2001). Objetivos 1) Observar pH ácidos, básicos e neutros; 2) Discutir a importância das soluções tampão em sistemas biológicos. 10 Materiais Determinação da escala de pH Preparação do indicador ácido-base a) Vinagre de álcool incolor (750 mL); a) Cabeça de repolho roxo; b) Fermento em pó (químico) (250 g); b) Faca de cozinha (01); c) Sabão em pó (1 kg); c) Béquer 500 mL (12); d) Água sanitária (1000 mL); d) Caixa com fósforos (01); e) Soda caustica (100 g); e) Peneira de plástico (06); f) Copos descartáveis (de 200 mL); f) Garrafa plástica (água mineral) vazia (06). g) Seringa de 20 mL sem agulha (06); h) Seringa de 5 mL sem agulha (06); i) Colher de sopa e de chá (06 de cada); Preparação solução tampão a) Béquer 500 mL (18); b) Soda caustica; Efeito da adição de ácido e base em soluções tampão; a) Béquer 100 mL (36); b) Solução HCl 0,1 mol/L (ou concentrada); c) Soda caustiva (NaOH); d) Proveta 100 mL (6); Procedimento Observações: sempre que utilizar a seringa de 20 mL, lave-a bem para evitar contaminações e alterações no resultado final do experimento. Preparação do indicador ácido-base a) Pegar duas ou três folhas de repolho roxo e cortar com a faca de cozinha (as mais externas); b) Colocar as folhas em um béquer de 500 mL, cobrir com água e levar ao fogo (bico de Bunsen); c) Deixar ferver por alguns minutos (2 ou 3) e desligar; d) Deixar esfriar completamente; e) Retirar as folhar cozidas manualmente e com o auxílio da peneira; f) Guardar o líquido do repolho cozido na garrafa plástica; g) Se necessário, conservar em geladeira. Determinação da escala de pH a) Pegar 20 mL de vinagre com o auxílio da seringa de 20 mL e colocar em um copo; Coletar 5 mL do indicador de repolho roxo com o auxílio da seringa de 5 mL e misturar com o vinagre. Observar e anotar a cor formada na Tabela 1 (disponível na apostila); b) Pegar 100 mL de água com auxílio da seringa (20 mL) e colocar em um copo plástico. Misturar com 10 mL de vinagre coletado com a seringa de 20 mL (lavada e limpa). Coletar 5 mL do indicador com o auxílio da seringa de 5 mL e misturar com a solução diluída. Observar e anotar a cor formada; c) Pegar 100 mL de água com auxílio da seringa (20 mL) e colocar em um copo plástico. Misturar com 5 mL de indicador coletado com o auxílio da seringa de 5 mL. Observar e anotar a cor formada; 11 d) Pegar 100 mL de água com auxílio da seringa (20 mL) e colocar em um copo plástico. Pegar uma colher de chá de fermento em pó e misturar com a água. Coletar 5 mL de indicador com o auxílio da seringa de 5 mL e colocar na solução. Observar e anotar a cor formada; e) Pegar 100 mL de água e misturar com 10 mL de água sanitária, coletado com o auxílio da seringa de 20 mL (sempre limpo e lavado). Colocar 5 mL do indicador coletado com o auxílio da seringa de 5 mL. Observar e anotar a cor formada. f) Pegar 100 mL de água com auxílio da seringa (20 mL) e colocar em um copo plástico. Pegar uma colher de chá de sabão em pó e misturar com a água. Colocar 5 mL de indicador coletado com o auxílio da seringa de 5 mL. Observar e anotar a cor formada. g) Pegar 100 mL de água com auxílio da seringa de 20 mL e misturar com 1 colher de soda cáustica (com cuidado!). Colocar 5 mL do indicador coletado com auxílio da seringa de 5 mL. Observar e anotar a cor formada. Preparação da solução tampão a) Colocar 500 mL de vinagre 4% em um béquer. b) Adicionar lentamente 6,7 g de NaOH. c) Em seguida, realizar as respectivas diluições. OBS: A preparação da solução tampão está descrita abaixo. Efeito da adição de ácido e base em soluções tampão a) Adicionar em três béqueres 50 mL de água e 50 mL da solução indicadora (repolho roxo); nomear béquer 1a, béquer 2a e béquer 3a. b) Adicionar lentamente 10 gotas de HCl 0,1 mol/L ao béquer 1a. c) Adicionar lentamente 10 gotas de NaOH 0,1 mol/L ao béquer 2a. d) Comparar os três béqueres e observar a alteração de cores. e) Adicionar em três béqueres 50 mL da solução tampão previamente preparada e 50 mL da solução indicadora (repolho roxo); nomear béquer 1b, béquer 2b e béquer 3c. f) Adicionar lentamente 10 gotas de HCl 0,1 mol/L ao béquer 1b.g) Adicionar lentamente 10 gotas de NaOH 0,1 mol/L ao béquer 2b. h) Comparar os três béqueres e observar a alteração de cores. OBS: Realizar os itens E, F, G e H para outra concentração da solução tampão. 12 Resultados e discussão Preencher a Tabela 1 com os resultados obtidos de cada solução e concluir se a solução é ácida, básica ou neutra. Tabela 1. Cores observadas na escala de pH SOLUÇÃO COR OBSERVADA pH MEDIDO pH TEÓRICO CONCLUSÃO VINAGRE PURO - 2,7 VINAGRE DILUÍDO - 3,3 ÁGUA - 7,5 FERMENTO EM PÓ - 7,8 ÁGUA SANITÁRIA - 10,2 SABÃO EM PÓ - 10,5 SODA CÁUSTICA - 13,2 Questões 1) Conforme a tabela acima, foi possível observar tendência nas cores das soluções? As soluções ácidas adquiriram qual coloração? E as básicas? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 2) Como a concentração da solução tampão afeta sua capacidade tamponante? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 13 3) Qual a importância das soluções tampão em sistemas biológicos? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 4) Quais são os dois principais tipos de tampão excretados pela saliva de ruminantes? Qual é a importância desses tampões na digestão de ruminantes? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 5) Quais os benefícios da utilização de tamponantes na nutrição e formulação de dietas para vacas leiteiras? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ Relatório Entregar um relatório por grupo referente ao experimento 01. Data de entrega: combinar com o professor Guilherme Pimpão Cavalcante. DICAS do Pimpão! - Tire fotos para colocar no relatório do grupo; - Comente devidamente cada uma delas! Nunca coloque nenhuma foto, tabela ou figura sem comentá-la! 14 Experimento 02 Proteínas Todas as proteínas existentes nos seres vivos, desde os vírus até os seres humanos, são constituídas por combinações de apenas vinte aminoácidos. Esses blocos constituintes da vida se unem entre si, como contas de um colar, para formar longas cadeias e moléculas complexas que configuram a estrutura de todos os organismos vivos. O aminoácido é um composto orgânico que apresenta, em sua molécula, um grupo ácido (-COOH) e um grupo amino (-NH2), além de um radical -R, que vai ser responsável pela diferenciação entre os diversos tipos de aminoácidos existentes. As proteínas podem ser caracterizadas e diferenciadas por propriedades específicas como a carga elétrica, massa molar, solubilidade e afinidade por certos compostos de caráter sintético ou natural. Além disso podem também ser caracterizadas por reações de precipitação e/ou coloração. Todas as reações desenvolvidas baseiam-se na presença de ligações peptídicas e também na presença de diferentes aminoácidos, evidenciadas pela afinidade específica que essas moléculas possuem a certos compostos. Objetivos 1) Compreender as propriedades das proteínas e como estas influenciam a solubilidade; 2) Entender o fenômeno de desnaturação proteica; 3) Identificar a presença de proteínas em soluções. Materiais Solubilidade de proteínas a) Solução cloreto de sódio 1 mol/L (100 mL); b) Solução de sulfato de amônio 70% (p/v) (100 mL); c) Tubo de ensaio (10); d) Béquer 250 mL (12); Desnaturação proteica e) Suporte para tubos de ensaio (06); a) Tubo de ensaio (12); f) Conta gotas 4-5 mL (06). b) Álcool etílico absoluto (1000 mL); c) Caixa com fósforos (01); Identificação de proteínas d) Pinça de madeira (06); a) Tubo de ensaio (18); e) Suporte para tubos de ensaio (06). b) Suporte para tubos de ensaio (06); c) Leite integral de caixinha (1 litro); d) Solução de HCl 1 mol/L (250 mL); e) Conta gotas 4-5 mL (06); f) Funil para filtrar (06); g) Papel filtro (06); h) Reagente ou solução de Biureto (100 mL); i) Fitas medição de pH 0-14; 15 j) Béquer 100 mL (06); k) Bastão de vidro (06). Procedimento Identificação de proteínas a) Adicionar 5 mL de leite com auxílio do conta-gotas ao tubo de ensaio (nomear Tubo 1). b) Adicionar 5 mL de água ao Tubo 1 com auxílio do conta-gotas. c) Adicionar continuamente porções de 0,5 mL de HCl até o pH do tubo atingir valor 4,0 (com auxílio do conta-gotas). O pH deve ser medido com auxílio das fitas de medição de pH. Observar formação de precipitado. d) Separar o sobrenadante do precipitado por meio da filtração. O precipitado deve permanecer no Tubo 1. O sobrenadante deve ser adicionado a outro tubo de ensaio (nomear Tubo 2). e) Adicionar 5 mL de água a outro tubo de ensaio (nomear Tubo 3). f) Aos três tubos (Tubo 1, 2 e 3) adicionar 5 mL do reagente de Biureto. Observar coloração. Solubilidade de proteínas a) Quebrar o ovo separando o seu conteúdo em dois béqueres (clara em um e a gema em outro). Cuidado para não romper a membrana que envolve a gema. Descartar a gema. b) Peneirar a clara do ovo para retirar a porção lipídica. Descartar a camada lipídica que ficou na peneira de plástico. c) Adicionar 2 mL da clara filtrada ao tubo de ensaio (nomear Tubo 1). d) Adicionar 4 mL de água ao Tubo 1. Verificar se a solução ficou turva. Observar e anotar o resultado. e) Adicionar, ao Tubo 1, continuamente porções de 0,5 mL de solução de cloreto de sódio (NaCl, 1 mol/L) até solubilização completa. Observar e anotar o resultado. f) Adicionar ao Tubo 1, 5 mL de solução de sulfato de amônio (70% p/v). Observar e anotar o resultado. Desnaturação proteica a) Quebrar o ovo separando o seu conteúdo em dois béqueres (clara em um e a gema em outro). Cuidado para não romper a membrana que envolve a gema. Descartar a gema. b) Peneirar a clara do ovo para retirar a porção lipídica. Descartar a camada lipídica que ficou na peneira de plástico. c) Adicionar 2 mL da clara filtrada ao tubo de ensaio (nomear Tubo 1). d) Adicionar 4 mL de água com auxílio do conta-gotas. Observar e anotar resultado. e) Adicionar 2 mL da clara filtrada em outro tubo de ensaio (nomear Tubo 2). f) Aquecer Tubo 2 em bico de Bunsen com auxílio da pinça de madeira. Observar e anotar o resultado.16 Resultados e discussão Observar, anotar e discutir os resultados obtidos. Se necessário organize-os em tabelas. Questões 1) Explicar o que é o reagente de Biureto utilizado no procedimento de identificação de proteínas. Como ele interage com as proteínas? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 2) O que é ponto isoelétrico de uma proteína? E o que é precipitação isoelétrica? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 3) Explique o fenômeno de desnaturação proteica. O que aconteceu quando a proteína foi aquecida? E quando foi adicionado álcool etílico? Por que? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ Relatório Entregar um relatório por grupo referente ao experimento 02. Data de entrega: combinar com o professor Guilherme Pimpão Cavalcante. DICAS do Pimpão! - Tire fotos para colocar no relatório do grupo; - Comente devidamente cada uma delas! Nunca coloque nenhuma foto, tabela ou figura sem comentá-la! 17 Experimento 03 Enzimas Enzimas são moléculas orgânicas de natureza proteica e agem nas reações químicas das células como catalisadoras, ou seja, aceleram a velocidade dos processos sem alterá-los. Geralmente são os catalisadores mais eficazes, por sua alta especificidade. Sua estrutura quaternária é quem determinará sua função, a que substrato ela se acoplará para acelerar determinada reação. Nosso corpo é mantido vivo por uma série de reações químicas em cadeia, que chamamos de vias metabólicas, nas quais o produto de uma reação serve como reagente posteriormente. Todas as fases de uma via metabólica são mediadas por enzimas. Cada enzima é única para uma determinada reação. Para seu funcionamento eficaz, deve ter sua estrutura tridimensional conservada (terciária e quaternária). Ela possui uma região específica de ligação ao substrato chamada de sítio ativo, a conformação desta região forma um encaixe perfeito e único entre determinada enzima e um substrato, normalmente por ligações covalentes transitórias. Ao terminar a reação ela se solta do substrato e continua perfeita, em sua forma, para novas atividades. Como toda proteína, ela pode se desnaturar em algumas condições, como em altas temperaturas, variação extrema de pH, perdendo assim sua função. Como toda proteína, elas precisam de uma temperatura e pH ideal para serem ativas nas reações. Objetivos 1) Compreender a importância da estrutura tridimensional das enzimas; 2) Entender a influência das enzimas nas reações bioquímicas; 3) Avaliar a relação entre a temperatura e presença de ácidos na estrutura das enzimas. Materiais Atividade enzimática em extratos de frutas Hidrólise enzimática do amido a) Tubo de ensaio (24); a) Solução amido 25% (25g/100mL H2O); b) Suporte para tubos de ensaio (06); b) Solução de Lugol; c) Béquer 500 mL (09); c) Gelo triturado ou potável (3 kg); d) Gelo triturado ou potável (3 kg); d) Tubo de ensaio (18); e) Béquer 50 mL ou volume similar (18); e) Solução de HCl 1 mol/L (100 mL); f) Conta-gotas de plástico 4-5 mL (06); f) Conta-gotas de plástico (06). g) Bastão de vidro (06); h) Solução de gelatina de mercado (1000 mL). 18 Procedimento Atividade enzimática de extratos a) Em quatro tubos diferentes, adicionar 4 mL de solução de gelatina em cada um (nomear Tubo 1, Tubo 2, Tubo 3 e Tubo 4). Adição feita com auxílio de conta-gotas de plástico. b) Adicionar 2mL de água ao Tubo 1. c) Adicionar 2 mL de extrato de mamão ao Tubo 2. d) Adicionar 2 mL de extrato de abacaxi ao Tubo 3. e) Adicionar 2 mL de extrato da fruta escolhida ao Tubo 4. f) Colocar todos os tubos de ensaio em um béquer de 500 mL contendo gelo. g) Aguardar até a gelatina do Tubo 1 endurecer. h) Retirar todos os outros tubos de ensaio e colocar em suporte para realizar análise. Observe e anote os resultados obtidos. Hidrólise enzimática do amido a) Adicionar quantidade suficiente de saliva em três tubos de ensaio diferentes (nomear Tubo 1, Tubo 2 e Tubo 3). Se necessário, jogar água nas paredes do tubo. Utilizar a menor quantidade de água possível. b) Adicionar 5 mL de solução de amido ao Tubo 1. Aguardar 20 minutos. c) Adicionar 5 mL de solução de amido e 5 mL da solução de HCl ao Tubo 2. Aguardar 20 minutos. d) Adicionar 5 mL da solução de amido ao Tubo 3 e colocar imediatamente em um béquer contendo gelo. Aguardar 20 minutos. e) Adicionar 5 gotas de solução de Lugol em cada tubo de ensaio. Observar e anotar o resultado. Resultados e discussão Observar, anotar e discutir os resultados obtidos. Tirar fotos de cada etapa para colocar no relatório. Questões 1) Explique como as enzimas presentes nos extratos influenciaram o endurecimento da gelatina. _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 2) Explique por que ocorreu o desaparecimento gradativo da cor azul do Lugol. _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 19 3) Explique como a temperatura influenciou a atividade enzimática da amilase (saliva). _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 4) Explique como o ácido clorídrico (HCl) influenciou a atividade enzimática da amilase (saliva). _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 20 Experimento 04 Carboidratos Os carboidratos (hidratos de carbono) são as biomoléculas mais abundantes na natureza. Muitas vezes sãochamados de açúcares ou sacarídeos e são definidos pela sua composição química característica: carbono, hidrogênio e oxigênio, embora algumas vezes possam apresentar nitrogênio, fósforo ou enxofre em suas moléculas. Duas principais funções são relacionadas aos carboidratos. A primeira é a energética, em que as moléculas são convertidas em energia para os trabalhos celulares, armazenada em nosso organismo sob a forma de ATP. O carboidrato pode ser armazenado para posterior utilização. Nas plantas este processo ocorre nos amiloplastos e a forma armazenada é o amido. Já nos animais armazena-se o glicogênio no fígado e nos músculos. Outra função importante dos carboidratos é a estrutural, em que polímeros insolúveis funcionam como elementos estruturais e de proteção nas paredes celulares bacterianas e vegetais e nos tecidos conjuntivos de animais. O amido, polissacarídeo de extrema importância em alimentos, é produzido em grande quantidade nas folhas dos vegetais como forma de armazenamento dos produtos da fotossíntese, e é constituído por dois outros polissacarídeos estruturalmente diferentes: amilose e amilopectina. O amido é formado pela combinação da amilose com a amilopectina. Sabe-se também que a amilose forma um complexo azul com o iodo, enquanto a amilopectina forma um complexo vermelho. Objetivos 1) Identificar a aldeídos em alimentos; 2) Compreender os polissacarídeos presentes no amido (amilose e amilopectina). 3) Avaliar a relação entre a temperatura e presença de ácidos na estrutura das enzimas. Materiais Identificação de aldeídos em alimentos a) Reativo de Fehling (100 mL); b) Espátulas (06); Reação com o iodo c) Caixa com fósforos (01); a) Solução amido 25% (25g/100mL H2O); d) Bastão de vidro (06); b) Solução glicose 10% (10g/100mL H2O); e) Béquer 50 mL ou volume similar (18); c) Reagente de Lugol; d) Solução de NaOH 1 mol/L (500 mL); Respiração celular e) Solução de HCl 1 mol/L (100 mL); a) Garrafas de água mineral 500 mL (06); f) Tubo de ensaio (18); b) Pacote com bexigas (um com 100 unidades); g) Conta-gotas 4-5 mL (06); c) Fermente biológico (100 g); d) Açúcar mercado (1 kg); 21 Procedimento Identificação de aldeídos em alimentos a) Retirar a casca e cortar a banana em pedaços pequenos. b) Adicionar a banana cortada em um béquer e moer com o auxílio da espátula. Adicione uma pequena quantidade de água para melhor dissolução. c) Adicione 5 mL do reativo de Fehling ao béquer. d) Aquecer em bico de Bunsen até alteração da cor. Observar e anotar os resultados obtidos. e) Repetir o procedimento para outras frutas. Reação com o iodo a) Colocar 2 mL de água em um tubo de ensaio (nomear Tubo 1). b) Colocar 2 mL da solução de amido em outro tubo de ensaio (nomear Tubo 2). c) Colocar 2 mL da solução de glicose em outro tudo de ensaio (nomear Tubo 3). d) Em cada um dos tubos, adicionar 4 gotas de Lugol. Observar e anotar os resultados obtidos. e) Ao tubo que contém amido e Lugol (Tubo 2), adicionar 5 gotas de solução de NaOH. Observar e anotar os resultados obtidos. f) Ao mesmo tubo de ensaio, adicione 5 gotas de HCl. Observar e anotar os resultados obtidos. Respiração celular a) Colocar 50 mL de água e 10 g de açúcar em uma garrafa plástica (nomear Garrafa 1). b) Colocar 50 mL de água em outra garrafa plástica (nomear Garrafa 2). c) Adicionar a Garrafa 1, 10 g de fermento biológico. d) Colocar uma bexiga em cada tampa da garrafa, impedindo a saída de gás. Aguardar 15 minutos. Observar e anotar os resultados obtidos. Resultados e discussão Observar, anotar e discutir os resultados obtidos. Tirar fotos de cada etapa para colocar no relatório. Questões 1) Explique o que ocorreu no experimento de identificação de aldeídos em alimentos. Algum alimento indicou a presença de aldeído? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 22 2) Explique o que aconteceu na reação do iodo com o amido. E com o açúcar, houve diferença? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 3) Na respiração celular, qual foi o gás formado? Explique a importância dos carboidratos para este processo. _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ Relatório Entregar um relatório por grupo referente aos experimentos 03 e 04. Data de entrega: combinar com o professor Guilherme Pimpão Cavalcante. DICAS do Pimpão! - Tire fotos para colocar no relatório do grupo; - Comente devidamente cada uma delas! Nunca coloque nenhuma foto, tabela ou figura sem comentá-la! 23 Experimento 05 Ácidos nucleicos Os ácidos nucleicos são substâncias orgânicas ácidas descobertas inicialmente no núcleo celular. Essas moléculas podem ser de dois tipos: DNA ou RNA. DNA é a sigla usada para indicar o ácido desoxirribonucleico; RNA, por sua vez, é a sigla de ácido ribonucleico. Os ácidos nucleicos são formados por nucleotídeos, que são compostos por um ácido fosfórico, um açúcar e uma base nitrogenada (observe esquema a seguir). Esses nucleotídeos estão unidos um ao outro por ligações fosfodiéster estabelecidas entre um açúcar e um fosfato. O DNA e o RNA diferenciam-se graças ao açúcar e às bases nitrogenadas encontradas em seus nucleotídeos. O ácido fosfórico, por sua vez, é igual nos dois ácidos nucleicos existentes. O açúcar presente nos ácidos nucleicos é uma pentose, que pode ser uma desoxirribose ou uma ribose. A desoxirribose é a pentose presente no DNA, que, por isso, recebe o nome de ácido desoxirribonucleico. O RNA contém a ribose e, por isso, é denominado de ácido ribonucleico. Outra diferença entre ácidos nucleicos são as bases nitrogenadas, que podem ser de cinco tipos diferentes: adenina, guanina, citosina, timina e uracila. A timina é uma base exclusiva do DNA, enquanto a uracila aparece apenas no RNA. As outras três bases (adenina, citosina e guanina) ocorrem em ambos os ácidos nucleicos. Objetivos 1) Identificar e extrair o DNA da banana e do morango. Materiais Extração do DNA da banana e do morango a) Pacote plástico pequeno (18); b) Sal de cozinha (1 kg); c) Detergente (100 mL); d) Bastão de vidro (06); e) Béquer 250 mL ou volume similar (18); f) Peneira de plástico (06); g) Tubo de ensaio grande (12); h) Álcool etílico (250 mL) (gelado); j) Conta-gotas 4-5 mL (06); 24 Procedimento Extração do DNA da banana e do morango a) Colocar a banana no saco plástico, fechar e moer com o auxílio das mãos. Colocar a banana moída em um béquer (nomear Béquer Banana). b) Adicionar 150 mL de água em outro béquer (nomear Béquer 1). c) Adicionar 1 colher de chá de sal de cozinha ao Béquer 1. d) Adicionar 1 colher de sopa de detergente ao Béquer 1. e) Misturar lentamente a solução do Béquer 1 cuidando paranão formar espuma. f) Adicionar 1/3 da solução do Béquer 1 (aproximadamente 50 mL) no béquer que contém a banana moída (Béquer Banana). Aguardar por 30 minutos. g) Peneirar a mistura separando a banana da solução sobrenadante. Descartar a banana. h) Colocar a solução sobrenadante em um tubo de ensaio (até altura de 5 cm). j) Adicionar álcool etílico deixando-o escorrer pela parede do tubo (cerca de 10 cm). Observar e anotar os resultados obtidos. h) Repetir o procedimento para três morangos. Resultados e discussão Observar, anotar e discutir os resultados obtidos. Tirar fotos de cada etapa para colocar no relatório. Questões 1) Cite três diferenças entre a estrutura do RNA e do DNA. _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 2) Os ácidos nucleicos são macromoléculas formadas por nucleotídeos. Explique quais os grupamentos que compõem os nucleotídeos. _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 25 3) Explique a importância de cada etapa no processo de extração de DNA da banana/morango. _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 26 Experimento 06 Lipídeos Os vegetais apresentam cores bem variadas. Os materiais que dão colorido aos vegetais são chamados de pigmentos. A clorofila, que apresenta cor verde, é um dos pigmentos mais comuns nos vegetais. Mas nem sempre percebemos a presença desse pigmento ao olharmos um vegetal. Nas folhas roxas de alguns vegetais, por exemplo, também existem pigmentos verdes. É comum ouvirmos que quanto mais colorida é a nossa alimentação, mais saudável ela se torna. Os nutrientes em si - proteínas, carboidratos, gorduras, vitaminas e sais minerais - não possuem cor. Mas os pigmentos naturais que dão cor aos alimentos, mesmo não tendo propriedades nutritivas, são grandes aliados no combate e na prevenção de doenças. Um bom exemplo são os carotenóides, responsáveis pelo colorido de várias frutas, verduras e legumes. O betacaroteno encontrado principalmente em vegetais amarelos, alaranjados e verde-escuros, pode se transformar em vitamina A, caso o organismo precise, fortalecendo o sistema imunológico e ajudando na prevenção do câncer (principalmente de pulmão) e da cegueira noturna, além de deixar a pele saudável. Os pigmentos de tonalidade vermelha escura, roxa e azulada presentes em alimentos como jabuticabas, uvas, repolho roxo e beterraba, por exemplo, são da família dos flavonóides, que contém a antocianina, de propriedade antioxidante. Por outro lado, a vitamina C presente em uma grande variedade de frutas, não pode ser identificada por nenhuma cor. As pessoas extraem pigmentos dos vegetais. Eles podem ser usados como corantes para colorir outros materiais e até mesmo a nossa pele ou o nosso cabelo. Você também pode extrair pigmentos dos vegetais. Para separar os pigmentos que dão cor aos vegetais, vamos usar uma das técnicas de cromatografia em papel. As diferentes cores observadas na tira de papel, após o experimento, indicam a presença de pigmentos variados tanto na flor como nas folhas. Os pigmentos deslocam-se para a outra borda do papel por capilaridade. Objetivos 1) Identificar diferentes pigmentos existentes em plantas. 2) Extrair os pigmentos. Materiais Extração de pigmentos e separação por cromatografia em papel a) Flor colorida, folhas de beterraba/repolho roxo, folhas verdes. b) Álcool etílico (500 mL); c) Papel filtro (12); d) Copos plásticos 200 mL (30); 27 Procedimento Extração de pigmentos e separação por cromatografia em papel a) Colocar as folhas ou flor no copo de plástico. b) Com auxílio de um socador, triturar as folhas. c) Colocar álcool etílico até cobrir. Aguardar 20 minutos. d) Retirar as folhas ou flores trituradas, deixando nos copos apenas a solução alcoólica. e) Mergulhar uma das pontas de cada tira de papel na solução alcoólica. Aguardar 2 horas. f) Retirar da mistura e colocar para secar. Resultados e discussão Observar, anotar e discutir os resultados obtidos. Tirar fotos de cada etapa para colocar no relatório. Questões 1) Quais as características químicas e estruturais dos lipídios e como eles se classificam? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 2) Quais as funções biológicas desempenhadas pelos lipídios na célula? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 2) O que foi observado durante o experimento de extração e separação de pigmentos por meio da cromatografia em papel? _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 28 Relatório Entregar um relatório por grupo referente aos experimentos 05 e 06. Data de entrega: combinar com o professor Guilherme Pimpão Cavalcante. DICAS do Pimpão! - Tire fotos para colocar no relatório do grupo; - Comente devidamente cada uma delas! Nunca coloque nenhuma foto, tabela ou figura sem comentá-la!
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