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Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Capitulo 8 – Controlo da Expressão Génica As células têm a capacidade de “seleccionar” os genes que serão expressos, sem alterar a sequência de nucleótidos do seu DNA. Note-se que todas as células possuem o mesmo conjunto de genes. Como já foi dito, as células têm a capacidade de seleccionar os genes que serão expressos sem no entanto, alterar o seu DNA. Mas como sabemos isto? Se o DNA fosse alterado irreversivelmente durante o desenvolvimento dos cromossomas nas células diferenciadas estas seriam incapazes de dar origem a um novo organismo. Comprovou- se após ter sido removido o material genético de uma célula da pele de um sapo adulto e injectado num ovo, tendo-se constatado que o embrião se desenvolveu normalmente. Esta experiência mostrou que o DNA de células especializadas possuem toda a informação necessária para dar origem a um novo organismo. Diferentes tipos de células produzem diferentes tipos de proteínas: Após ter sido realizada electroforese às proteínas de células do fígado, coração e cérebro concluiu-se que determinadas proteínas são características de determinados tecidos. No entanto, descobriu-se também que existem proteínas comuns a todas estas células, nomeadamente a RNA polimerase, enzimas de reparação do DNA, proteínas ribossomais, enzimas envolvidas na glicólise e outros processos básicos de metabolismo. Cada célula diferenciada produz proteínas específicas que irão determinar a sua função, forma, tamanho. Muitas proteínas são produzidas em poucas quantidades nas células não sendo detectadas por electroforese. Um outro método mais rigoroso designa-se “mass spectrometry” e é usado para detectar proteínas raras e fornecer informações acerca das suas ligações covalentes (por fosforilação, por exemplo). A expressão génica pode ainda ser estudada pela monitorização de mRNAs que codificam proteínas. Estima-se que nas células diferenciadas sejam expressos cerca de 5000-15000 genes de um conjunto de 25000. Cada tipo de célula produz proteínas especializadas que dotam a célula de diferentes capacidades. A célula pode alterar a sua expressão génica de acordo com estímulos externos: Muitas células podem alterar a sua expressão génica de acordo com os estímulos externos, um exemplo são as células do fígado. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Quando as células do fígado estão expostas a hormonas glucocorticóides, a expressão de determinadas proteínas aumenta drasticamente. Isto ocorre quando o indivíduo está sujeito a longos períodos de exercício intenso, nestas situações estas hormonas induzem o fígado a produzir glicose a partir de aminoácidos e de outras pequenas moléculas. O leque de proteínas cuja produção é induzida pelos glucocorticóides inclui a tirosina aminotransferase que é utilizada na conversão de tirosina em glicose. Quando as hormonas glucocorticóides deixam de estar presente a produção de proteínas volta aos valores normais. Outros tipos de células reagem de forma diferente à presença de glucocorticóides, nomeadamente as “fat cells” (células gordas) que reduzem drasticamente a produção da enzima tirosina aminotransferase na presença desta hormona. Há ainda outras células que não têm qualquer resposta à presença deste composto. Estes exemplos ilustram a diversidade de respostas por parte de diferentes tipos de células face ao mesmo estímulo externo. A expressão génica pode ser regulada em várias etapas: Desde a molécula de DNA até a formação de proteínas existem diversas maneiras de controlar a expressão génica. A célula controla a produção de proteínas determinando quando e com que frequência determinado gene é transcrito (1); controla também o splicing e a forma como o RNA é processado (2); selecciona os mRNAs que são exportados do núcleo para o citosol (3); Degrada determinadas moléculas de mRNA (4); selecciona quais os mRNAs que serão traduzidos pelos ribossomas (5); activando ou desactivando proteínas que foram produzidas (6). Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Controlo ao nível da transcrição: O promotor de um gene atrai a RNA polimerase e orienta correctamente a enzima de modo a formar a sequência correcta de RNA. Os promotores das bactérias e dos eucariotas possuem um “initiation site”, onde a transcrição tem início; possuem também uma sequência de aproximadamente 50 nucleótidos que se estende para além do initiation site e que contém sequências necessárias à ligação da RNA polimerase ao promotor. Junto do promotor, existe também um “Regulatory DNA sequences” que é usado para “ligar” ou “desligar” o gene. As “Regulatory DNA sequences” das células eucariotas possuem cerca de 10.000 pares de nucleótidos. Estes comandam a frequência com que o gene será expresso de acordo com os estímulos (sinais) da célula. Isoladamente as “Regulatory DNA sequences” não possuem qualquer efeito, necessitam de proteínas designadas “transcription regulators”, pois apenas em conjunto têm a capacidade de controlar a expressão génica. Diferentes proteínas irão reconhecer diferentes sequências de DNA onde se irão ligar através de pontes de hidrogénio, que isoladamente são fracas mas que em conjunto são bastante resistentes. As interacções entre DNA e proteínas são das mais especificas e das mais fortes ligações conhecidas na biologia. Embora, cada proteina reconheça determinada sequencia onde se irá ligar, muitas proteínas responsáveis pela regulação génica reconhece o DNA através de características estruturais especificas, nomeadamente o homeodominio, o zinco e a cadeia de leucina que estão presentes nestes locais em particular. A regulação da transcrição permite à célula responder aos estímulos externos: O DNA da E.Coli codifica cerca de 4300 proteínas sendo que a sua expressão génica depende do alimento disponível no meio. Por exemplo, na E.Coli, cinco genes codificam enzimas para a produção do triptofano sendo que estas são transcritas num único mRNA, recorrendo apenas a um promotor. Quando o triptofano está presente no meio, estas proteínas deixam de ser necessárias e a sua síntese é inibida. Este mecanismo designa-se operão. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala O operão é constituído por um promotor que é uma sequência de 15 nucleótidos que será reconhecida pela proteína “transcription regulator”. Quando esta se liga ao promotor bloqueia o acesso da RNA polimerase ao operador, não ocorrendo transcrição. Neste operão a proteína “transcription regulator” é designada por tryptophan repressor. O tryptophan repressor é uma proteína alostérica. Quando o triptofano se liga a esta proteína, esta muda a sua configuração e liga-se ao operador. Se não houver triptofano no meio este não se liga ao tryptophan repressor consequentemente este não muda a sua estrutura tridimensional não se ligando ao operador, permitindo a transcrição dos genes. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Os repressores bloqueiam a expressão génica enquanto que os activadores a promovem: O tryptophan repressor, tal como o nome sugere, é uma proteína repressora. Na sua forma activa inibe a transcrição. Outras bactérias possuem outras proteínas “transciption regulators” que fazem exactamente o oposto. Essas proteínas designam-se activator (activadores). Estas proteínas actuam sobre o promotor promovendo a ligação da RNA polimerase. À semelhança do “tryptophan repressor”, as proteínas activadoras têm de interagir com uma segunda molécula para se poder ligar ao DNA. Por exemplo a proteína activadora CAP têm de se ligar ao AMP cíclico antes de seligar ao DNA. Portanto, em determinadas bactérias, dependendo da concentração de AMP intracelular os genes são ou não transcritos. Um activator e um repressor controlam o operão da Lactose: Muitas vezes a actividade de um único promotor é controlada por dois diferentes “transcription regulators”. O operão da Lactose na E.Coli é controlado por uma proteína activadora CAP e por um Lac repressor. Este operão codifica enzimas responsáveis pela digestão da lactose. Na ausência da glicose, a CAP activa os genes permitindo que a célula utilize recursos alternativos de carbono, incluindo a lactose. No entanto, na ausência de lactose iria ser um desperdício estar a produzir enzimas para a degradar. Daí que exista um repressor que actua na ausência de lactose. Sendo assim, apenas na ausência de glicose E na presença de lactose, estes genes são transcritos. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Os Transcription Regulators dos eucariotas controlam a expressão génica à distância: Os eucariotas utilizam também transcription regulators que regulam a sua expressão genica. As zonas especificas de DNA onde se ligam os activadores designam-se enhancers. No entanto, o que intrigou os cientistas foi o facto destes enhancers actuarem à distancia. Muitos modelos de “acção à distância” foram propostos desde então. O modelo mais aceite diz que a porção de DNA existente entre o enhancer e o promotor forma uma alça permitindo assim uma maior proximidade entre ambos (ver imagem). Deste modo a proteína activadora que se liga ao enhancer pode entrar em contacto com as proteínas adjacentes ao promotor (RNA polimerase e outros factores de transcrição). Existe ainda outro complexo de proteínas que favorece a ligação entre os transcription regulators e o enhancer, este complexo designa-se mediator. Nestes casos os activadores promovem a montagem de todo este complexo proteico essencial para que ocorra a transcrição enquanto que os repressores terão o efeito oposto. Os nucleossomas dificultam o inicio da transcrição: O material genético das células eucariotas está “empacotado” nos nucleossomas. Então como é que os transcription regulators e a RNA polimerase pode ter acesso ao DNA? Os Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala nucleossomas podem inibir a transcrição se estiverem posicionados sobre um promotor uma vez que bloqueiam o acesso das proteínas e enzimas responsáveis pela transcrição. No entanto, a estrutura da cromatina pode ser alterada por complexos enzimáticos que alteram as histonas. Muitos repressores atraem histonas desacetilases que removem o grupo acetil das histonas inibindo assim a transcrição. Por outro lado, a acetilação das histonas promove a transcrição. Embora alguns repressores actuem apenas sobre um gene, existe ainda outro grupo de repressores que actua sobre grandes porções de cromatina, como é o caso da heterocromatina e de um dos cromossomas X das mulheres. Mecanismos moleculares podem originar células especializadas: As células são capazes de “ligar” e “desligar” determinados genes de acordo com os estímulos/sinais do seu meio envolvente. As células dos organismos multicelulares têm uma capacidade extraordinária de desenvolver vários tipos de células diferenciadas, sendo que a memória da célula (cell memory) é um pré- requisito para o desenvolvimento de tecidos especializados e pela manutenção da estabilidade das células diferenciadas. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Os genes eucariotas são regulados por conjuntos de proteínas: O termo “combinatorial control” refere-se à forma como a transcrição de um determinado gene é regulado por um conjunto de proteínas. Estas proteínas podem ser inibidores e activadores e vão determinar o nível de expressão de um determinado gene. A expressão de diferentes genes pode ser comandada por uma única proteína: Quando uma célula eucariota recebe um sinal para que se divida. Um conjunto de genes que ao momento não eram expressos, são activados. Ao contrário dos procariotas, nos eucariotas cada gene é transcrito e regulado individualmente. Então, como é que os eucariotas coordenam a sua expressão genica? Embora o controlo da expressão génica resulte da combinação de várias proteínas (combinatorial control), o efeito de um único regulador de transcrição pode ser decisivo para ligar ou desligar determinado gene uma vez que completa a combinação de proteínas necessária para activar ou reprimir a expressão desse mesmo gene. Note-se que, um regulador de transcrição pode fazer parte de diferentes combinações e deste modo activar ou reprimir a expressão de um conjunto de genes. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Um exemplo ilustrativo deste tipo de regulação nos humanos está presente na proteína receptora do glucocorticóide (regulador de transcrição). Para que este se ligue ao sítios de regulação do DNA, este regulador de transcrição tem de fazer parte de um complexo do qual faz parte a hormona glucocorticóide. Em resposta aos glucocorticóides, as células do fígado aumentam a expressão de diferentes genes, em que um deles codifica a enzima tirosina aminotransferase. Estes genes são todos regulados pela ligação da hormona glucocorticóide, que faz parte do complexo que regula a transcrição dos diferentes genes. Quando esta hormona deixa de estar presente a expressão de todos estes genes desce para o nível normal. Através deste exemplo podemos ver que apenas um regulador de transcrição pode estar envolvido no controlo de diferentes genes. Combinatorial Control pode ser responsável pelos diferentes tipos de células: Descobriu-se o efeito de um único regulador de transcrição na diferenciação de tecidos através do estudo do desenvolvimento de células musculares. O músculo-esquelético mamário é bastante distinto do restante músculo-esquelético. É constituído por células grandes que resultam da fusão de muitas células precursoras de células musculares, designadas mioblastos. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Este músculo apresenta características específicas ao nível da actina e miosina, dos receptores de proteínas e nas proteínas dos canais iónicos que fazem com que estas células sejam sensíveis à estimulação do nervo. Neste tipo de tecido, todos os genes responsáveis por estas características estão activos. Através de estudos de células musculares diferenciadas foram identificadas “key transcription regulators” que se expressavam apenas em potenciais células musculares e que coordenavam a expressão deste tipo de genes. Estes “key transcription regulators” podem converter células não musculares em células musculares. Por exemplo, quando um dos reguladores pertencentes à “key transcription regulators”, nomeadamente o MyoD, é artificialmente expresso em culturas de fibroblastos estes começam a comportar-se com mioblastos e fundem-se para formar células que se assemelham às musculares. Isto acontece porque os fibroblastos derivam do mesmo folheto embrionário que as células musculares, daí que tenham acumulado reguladores de transcrição que fazem parte da conjunto de reguladores que coordenam a expressão de genes responsáveis pelas características musculares. Nos fibroblastos não esta presente o regulador que falta ao conjunto de reguladores, o MyoD, daí que este tenha sido adicionado. Daí que os fibroblastos não se diferenciem em células musculares naturalmente. Muitas outras células não se conseguem diferenciar em células musculares porque não acumularam reguladores de transcrição específicos para tal durante o seu desenvolvimentoembrionário. Os padrões de expressão génica podem ser transmitidos às células filhas: As células altamente especializadas não se dividem, nomeadamente os neurónios e as células musculares. No entanto, muitas outras células se dividem tais como os fibroblastos, células do músculo liso e as células do fígado, que se dividem muitas vezes na vida de um indivíduo. Todos estes tipos de células originam células-filhas idênticas a elas próprias. Esta preservação de características significa que existe uma memória celular. As células têm diversas maneiras de “lembrar” às suas células-filhas que tipo de célula é suposto formarem. Uma maneira simples é através da “positive feedback loop”, onde a “key transcription regulator” activa a transcrição dos genes característicos daquele tipo de célula, tornando-a diferenciada. Uma outra maneira de manter o mesmo tipo de célula após a divisão esta relacionada com a estrutura da cromatina que pode permitir ou não a expressão de determinados genes; uma terceira maneira de transmitir informação acerca da expressão é através da metilação de DNA. Este processo modifica as ligações covalentes das citosinas, atraindo proteínas que impedem a transcrição. Os padrões de metilação são passados à descendência através de uma enzima que copia os padrões de metilação para as cadeias de DNA das células-filhas, imediatamente após a replicação. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Porque cada um destes mecanismos (positive feedback loop, condensação de cromatina e metilação de DNA) transmitem a informação as células filhas sem alterar a sequência nucleotídica de DNA, são consideradas formas de “epigenetic inheritance”. Fig. Feedback Loop – Cell Memory A formação de um órgão pode ser conseguida através de um simples regulador de transcrição: Com já vimos anteriormente, um único regulador de transcrição pode fazer parte de diferentes combinações de proteínas (combinator control) e consequentemente “ligar” ou “desligar” diversos genes podendo converter um tipo de célula noutro tipo. Após o estudo da Drosophila chegou-se à conclusão que era possível fazer surgir olhos nas patas com apenas um regulador de transcrição (Ey) que fazia parte do controlo de diferentes genes. Alguns dos genes controlados por Ey irão actuar como reguladores e controlar a expressão de outros genes, provocando uma cascata de regulações e expressões de genes que irão levar à formação de um olho. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Controlos Pós-Transcrição: Até agora vimos os reguladores de expressão génica. No entanto, existem outras formas de regulação após a transcrição que actuam após a RNA polimerase se ter ligado ao promotor do gene e a síntese de RNA ter começado. Esta regulação é crucial para determinados genes. Os mecanismos de regulação estudados até então envolvem a participação de proteínas reguladoras. No entanto, os cientistas descobriram recentemente que determinados mRNAs podem regular a sua própria transcrição e tradução. Este mecanismo de auto-regulação contem ribowitches que são curtas sequencias de RNA que modificam a sua conformação quando se ligam a pequenas moléculas designadas metabolitos. Cada ribowitch reconhece uma determinada molécula que será responsável pela sua mudança de conformação que será determinante para a regulação da expressão genica. Este método de regulação é particularmente comum na bactéria. As zonas do DNA que não são transcritas controlam a transcrição de genes: Quando uma molécula de mRNA está a ser sintetizada, uma das maneiras mais comuns de regular a quantidade de proteína que resultará desse mRNA é através do controlo ao nível da tradução. Embora os detalhes da iniciação da tradução difiram entre os eucariotas e as bactérias, ambos usam as mesmas estratégias básicas de regulação nesta etapa. O mRNA da bactéria contem uma pequena sequência de ligação ao ribossoma localizada a poucos nucleótidos de distância do codão AUG, onde a tradução se inicia. Esta pequena sequência irá ligar-se ao ribossoma, posicionando correctamente o codão AUG. Sendo que esta interacção é necessária para uma eficiente tradução, constitui uma etapa ideal para controlo. Nesta etapa, ao expor ou bloquear a sequência reconhecida pelo ribossoma, a bactéria pode promover ou inibir a tradução do mRNA. Nos eucariotas, o mRNA possui uma extremidade 5’ que não é transcrita e que ajuda a orientar o ribossoma na direcção do codão AUG, onde começa a tradução. Nas células eucariotas, os repressores podem inibir a tradução ligando-se à região do mRNA a esta sequência específica impedindo assim que o ribossoma encontre o codão de iniciação, controlando assim a tradução do mRNA. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala RNAs reguladores controlam a expressão de centenas de genes: Para além de o RNA ser um intermediário de informação genética, também podem ter um papel fundamental em reacções de catálise particularmente na síntese de proteínas. As recentes descobertas revelaram que o RNA possui um papel fulcral na regulação da expressão génica. Foi encontrado um RNA nas plantas e em animais, designado microRNA (miRNA). Sabe-se que os humanos produzem mais de 400 miRNAs diferentes que regulam cerca de um terço dos genes que codificam proteínas. Tal como o tRNA e o rRNA, o precursor do miRNA sofre um tipo especial de processamento tornando-se então em miRNA maturo que irá associar-se com proteínas especializadas, constituindo-se assim o RNA-induced silencing complex (RISC). O RISC irá percorrer o citoplasma procurando mRNA que lhe sejam complementares. Uma vez encontrado o mRNA complementar, este será destruído imediatamente por uma nuclease ou então a sua tradução será bloqueada enviando-o para uma região do citoplasma onde haja nucleases para o degradar. Após degradar esse mRNA, o miRNA irá procurar outros para degradar, impedindo assim a síntese da proteína que esse mesmo mRNA codifica. De facto, os miRNA são bastante úteis como reguladores da tradução, primeiro porque um único miRNA pode regular uma grande quantidade de mRNA desde que apresentem a sequência que lhe é complementar. Segundo, porque os genes que codificam os miRNA são muito mais pequenos em comparação com os genes que codificam os reguladores de transcrição, tanto que devido ao seu reduzido tamanho foram descobertos muito mais tarde. O RNA Interference destrói duplas cadeias de RNA estranho: Muitas das proteínas que processam o miRNA também fazem parte dos mecanismos de defesa das células: elas determinam a destruição de moléculas de RNA estranhas, especialmente as que são constituídas por dupla cadeia. Muitos vírus e também transposões genéticos produzem duplas cadeias de RNA que por serem potencialmente perigosos são destruídos pelo RNA Interference (RNAi). A presença de cadeias de RNA estranhas atrai o RNAi que contem nucleases, designadas Dicer. A Dicer quebra as duplas cadeias de RNA transformando-as em pequenos fragmentos chamados small interfering RNAs (siRNAs). Estes pequenos fragmentos serão integrados nos RISC (complexos que contêm miRNAs). O RISC descarta uma das cadeias de RNA e usa a outra para procurar as restantes cadeias complementares. Desta forma, as moléculas de RNA estranho são rapidamente degradadas e o organismo é defendido contra os ataques de vírus, por exemplo. Biologia Molecular e Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala Após vários estudos chegou-se à conclusão de que o RNAi permite “desligar” determinados genes o que poderá ser muito útil no tratamento de doenças, uma vez que muitas delas resultam de uma inapropriada expressão génica. Biologia Moleculare Celular – Resumos Alberts 2009/2010 Nádia Mourinho Bala
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