aula 03 - Enzimas imobilizadas

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Enzimas Imobilizadas
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Utilização de enzimas na indústria:
Proteases e 
Lipases
Amilases
Celulases e 
amilases
Β-galactosidase,
Amilases,
Pectinases;
Papaína.
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Portanto, a principal vantagem da 
imobilização é a possibilidade de reutilizar a 
enzima!
A imobilização consiste em confinar a 
enzima em um suporte que permite a 
sua separação ao final do processo 
catalítico.
Enzimas são caras!
Como tornar 
esse processo 
viável ??
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A descoberta da imobilização
1916: Nelson e Griffin.
Demonstraram a viabilidade de se adsorver invertase (uso na 
hidrólise da sacarose) em carvão ativado, sem perda apreciável da 
atividade enzimática.
Biocatalisadores
Imobilizados 
Enzimas
Células
microbianas
vegetais
animais
1954: Pesquisadores alemães demonstraram que polímeros sintéticos poderiam ser
usados para imobilizar enzimas diversas como pepsina, diástase, ribonuclease e
carboxipeptidase.
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Classificação:
Kennedy e Roig (1995) consideraram a classificação da seguinte forma:
➢A natureza da interação responsável pela imobilização;
➢Tipo de suporte utilizado.
Assim:
a) Ligação em suportes – modificação da enzima, para torná-las imóveis no meio de
reação e cross-linking (ligação cruzada intermolecular ou reticulação);
b) Enzimas solúveis sem derivatização – utilizadas em reatores equipados com
membranas semipermeáveis de ultrafiltração e fibras ocas que retêm a enzima no interior
do reator.
c) Enzimas solúveis com derivatização – Mobilidade restringida pela ligação com outra
macromolécula, mas o complexo solúvel em água permanece.
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➢Necessidade da presença, ou não, de cofatores para a
melhor atuação da enzima.
a) Enzima sem cofator.
b) Enzima com grupo prostético.
c) Enzima com coenzima (moléculas orgânicas).
d) Sistema multienzimático com dissociação de coenzima
Outra forma de classificação
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Vantagens da aplicação de enzimas imobilizadas
- Separação facilitada da enzima ao final do processo;
- Reutilização;
- Possibilidade de aumento da estabilidade: faixas mais amplas de pH e temperatura 
(porém existem casos onde a imobilização diminui a estabilidade);
- Possibilidade de operar em sistema contínuo;
- Maior controle e uniformidade do processo;
- Menor interferência de ativadores e inibidores.
- Pode alterar as propriedades catalíticas da enzima:
✓maior estabilidade ao pH e à temperatura; 
✓reduzir os efeitos de inibição pelo substrato e produto.
- Facilitar a interrupção da reação quando se atinge um determinado grau de conversão.
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Desvantagens da aplicação de enzimas imobilizadas
- Custo adicional do suporte, reagentes e da operação de imobilização;
- Perdas de atividade durante a imobilização;
- Técnica pouco adequada a substratos insolúveis ou de alta massa molar;
- Maiores riscos de contaminação na operação contínua de reatores;
- Restrições difusionais e impedimento estérico (organização espacial).
- Podem ocorrer alterações de orientação e acesso do substrato ao sítio ativo:
➢ Reduzindo a atividade da enzima;
➢ Redução aparente da especificidade ao substrato.
- O custo da imobilização deve ser compensado pela longa vida do biocatalisador.
- O suporte deve manter suas propriedades físicas.
Efeitos da Imobilização 
sobre as enzimas
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Efeito sobre a Atividade x Temperatura
Em muitos casos a imobilização aumenta a faixa 
ótima de temperatura para atividades altas.
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Tmáx livre Tmáx imobilizada
Neste caso, a imobilização 
aumentou a atividade relativa 
para maiores temperaturas, o 
que pode estar relacionado ao 
efeito protetor do suporte contra 
o desdobramento da enzima.
Exemplo: Influência da temperatura na atividade 
hidrolítica da lipase livre e imobilizada em celulignina
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Efeito sobre a estabilidade x Temperatura
16:57 13
Efeito sobre a estabilidade x Temperatura
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A imobilização também pode deslocar a faixa de pH ótimo 
da enzima para pHs mais básicos e/ou ácidos.
Deslocamento da faixa 
ótima de pH
Efeito sobre a Atividade x pH
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Exemplo: Influência do pH na atividade hidrolítica
da lipase livre e imobilizada em celulignina
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A difusão do substrato do 
meio para o sítio ativo assim 
como a difusão do produto do 
sítio ativo para o meio pode 
ser dificultada devido à 
presença do suporte. 
Alteração de Km e Vmáx
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Geralmente, a presença do suporte próximo à enzima diminui 
a sua atividade catalítica assim diminui a sua afinidade pelo 
substrato.
vmax Km.
Efeito sobre os parâmetros cinéticos
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Métodos de Imobilização
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-Envolve ligações entre os aminoácidos da enzima e grupos funcionais presentes
no suporte de imobilização;
-É o método de imobilização mais utilizado;
-Geralmente confere maior resistência da enzima ao pH e à temperatura;
-Melhor fixação da enzima ao suporte (menor dessorção);
-Inconveniente: alteração da estrutura conformacional da enzima → menor
atividade.
-Tipos de suportes utilizados: vidro, silica, celulose, nylon, poliestireno, etc.
Ligações Químicas
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Ligação a Suportes Insolúveis
Tipo de ligações: enzimas e um suporte sólido;
➢ É o principal método de imobilização;
➢ Pode ser dividido em cinco categorias de acordo com o tipo de interação enzima-
suporte (adsorção física, ligação iônica, ligação metálica, ligação covalente e ligações
cruzadas e co-cruzadas).
Adsorção física:
A ligação de enzimas ao suporte é realizada por forças de ligação relativamente
fracas. As principais ligações entre as moléculas de proteínas e o adsorvente são:
pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e forças de Van der Walls.
Como não ocorre reação química, existe pouca mudança conformacional da enzima 
e não há destruição do seu centro ativo, assim obtém-se um derivado semelhante à 
enzima solúvel. 
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Ligação Iônica:
➢Método: baseado na ligação iônica entre a enzima- suporte. Pode ocorrer a
imobilização por adsorção juntamente com a iônica.
➢Apesar de ser mais forte a ligação, as condições são brandas, em comparação com
os métodos que envolvem as ligações covalentes e as mudanças de conformação
produzidas são pequenas, implicando em uma atividade elevada em comparação à
solúvel.
Ligação Metálica:
➢Método: baseia-se em imobilizar enzimas empregando compostos de metais de
transição ou óxidos metálicos precipitados a partir de seus sais;
➢Forma quelatos (composto químico) pela ativação da superfície do suporte por meio
do metal ou por seu óxido.
➢Embora o tipo de ligação seja parcialmente covalente, observa-se o desprendimento
da enzima do suporte em operações de longa duração.
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Processo da ligação metálica
Secagem de uma mistura do
suporte com a solução do sal
do metal de transição
Os íons dos metais complexam o suporte e a
enzima por meio dos radicais hidroxi e amino
(grupos nucleofílicos).
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Ligação Covalente:
➢Método de imobilização → consiste na formação de ligação covalente
entre moléculas da enzima e o material do suporte.
➢As condições de reação requeridas para a formação dessa ligação
geralmente não são brandas;
➢Em alguns casos, a ligação altera a estrutura conformacional da enzima e
o centro ativo da mesma, resultando em diminuição da atividade e mudança
de especificidade de substrato;
Estrutura da enzima inalterada perante agentes
desnaturantes como calor, solventes orgânicos, pH
extremos.
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Ligação Cruzada/Reticulação:
➢Método de imobilização→ Formação de ligações covalentes entre as moléculas
da enzima.
➢Reagentes multifuncionais.
➢Ausência de um suporte sólido.
Agregados enzimáticos tridimensionais 
insolúveis no meio aquoso.
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Muitas vezes é necessário preparar a superfície do suporte para permitir ou
facilitar a ligação da enzima. Isto pode ser feito utilizando agentes funcionais,
que fazem a ponte de ligação E-Suporte.
Ex.: glutaraldeído: ligação química entre o grupo aldeído (-COH) e o grupo
amino (-NH2).
Reticulação
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• A molécula de glutaraldeído reage com o suporte e a enzima.
• Os materiais inorgânicos mais comumente utilizados na
imobilização de enzimassão: cerâmica, vidro, sílica e metais.
Glutaraldeído
Simplicidade dos 
métodos de ativação
Preparações enzimáticas 
ativas e estáveis
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É uma molécula que tem pelo
menos duas extremidades
reativas que se ligam a grupos
específicos de aminoácidos.
Ligação Cruzada/Reticulação:
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Cristalização
Cristais de enzima 
reticulados 
Cristais de enzimas
Ligação Cruzada/Reticulação:
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Agregação
Agentes precipitantes: sais, 
ácidos, solventes orgânicos 
e polímeros não iônicos.
Agregados enzimáticos 
reticulados
Agregados enzimáticos
Ligação Cruzada/Reticulação:
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Secagem por 
atomização
Enzima atomizada
Enzimas atomizadas 
reticuladas
Ligação Cruzada/Reticulação:
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Enzima solubilizadas 
reticuladas
Reticulação direta
Ligação Cruzada/Reticulação:
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Retenção Física
-Processo simples que envolve apenas interações fracas (interações iônicas,
ligações de hidrogênio, forças de Van der Waals) entre a enzima e o suporte.
-Apresenta como vantagem pouca alteração da estrutura conformacional da
enzima, o que faz com que a enzima imobilizada mantenha boa atividade
catalítica.
-Inconveniente: fácil dessorção da enzima
-Tipos de suporte utilizados: géis, quitosana, alginato, resinas de troca iônica, etc.
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Imobilização de enzimas por oclusão e membranas:
➢Método de imobilização → é baseado em retenção das enzimas nos espaços
intersticiais, podendo ser feito em géis, fibras e por microencapsulação em membranas.
O importante é reter as enzimas e permitir que as moléculas de substratos e produtos
de pesos moleculares adequados possam se difundir através e dentro da rede
polimérica;
➢Este método pode ser aplicado para qualquer tipo de enzima ou mesmo células, pois
não há nenhuma ligação entre a enzima e a estrutura do suporte;
➢É um processo muito simples e as enzimas não sofrem modificações químicas.
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Critérios para avaliação de um sistema enzima-suporte
➢ Estabilidade de fixação - a enzima deve estar bem fixa ao suporte.
➢ Estabilidade enzimática - a enzima não deve sofrer modificações,
como desnaturação.
➢ Resistência mecânica - a enzima deve resistir a várias condições
desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do reator.
➢ Capacidade de carga - o suporte deve fixar um número elevado de
unidades enzimáticas por unidade de área.
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Tipos de suportes
Requisitos:
• Elevada área superficial;
• Permeabilidade;
• Estabilidade química e mecânica;
• Custo;
• Morfologia e composição;
• Natureza hidrofílica ou hidrofóbica;
• Alta densidade de grupos reativos presentes em sua superfície.
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➢ Podem ser orgânicos, inorgânicos, porosos, não porosos e de estrutura em gel;
➢ Os materiais porosos tem como vantagem uma elevada área superficial interna 
disponível para a imobilização de enzimas;
Diâmetro dos poros devem ser suficientemente grandes para acomodar a enzima e permitir o acesso do 
substrato;
➢ Suporte não poroso
- Acomodação das moléculas de enzima apenas na sua superfície externa, o que 
facilita a interação.
No entanto, a pequena área superficial exibida por esses suportes é sua mais notória desvantagem.
- Ex:Vidro,sílica e aço
Tipos de suportes
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➢ Os materiais orgânicos, em especial os polímeros, podem ser naturais ou 
sintéticos;
➢ Os polímeros sintéticos:
- Várias formas e estruturas;
- Origina um suporte de acordo com as características desejadas.
➢ Polímeros naturais:
- Baixo custo;
- Não causa danos ao meio ambiente.
Tipos de suportes
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Eficiência da Imobilização
A eficiência de imobilização(η):
η=AEi/AEs
Em que:
- AEi = atividade da enzima imobilizada;
- AEs =atividade da enzima em solução;
- η=eficiência de imobilização, geralmente é menor que 1.
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Aplicação de Enzimas Imobilizadas
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Vidro
Silica
Fibra de casca de coco
Tipos de suportes
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Exemplo: Hidrólise da lactose por β-galactosidase
imobilizada em resina de troca iônica (Duolite A-568).
Foram realizados diversos experimento para a otimização deste processo
Enzima β-galactosidase de 
Aspergillus oryzae
Fonte: Dissertação de Mestrado de Carla Zanella Guidini
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Comparação da Estabilidade da Enzima 
Imobilizada com e sem ligação cruzada
Sem ligação cruzada
Com ligação cruzada
ou
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Comparação da Estabilidade da Enzima 
Imobilizada com e sem ligação cruzada
Sem ligação cruzada Com ligação cruzada
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Comparação da Estabilidade da Enzima 
Imobilizada com e sem ligação cruzada
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S
S
v
+
=
07,12
.71,0
Definição dos parâmetro Km Vmáx para a enzima imobilizada 
Fonte: Dissertação de 
Mestrado de Carla 
Zanella Guidini
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Estudo da inibição para a enzima imobilizada
max ( )
( )
1 ( )
P
m
I
v S
r v
I
K S
K
= =
 
+ + 
 
Fonte: Dissertação de Mestrado 
de Carla Zanella Guidini
Modelos de 
inibição
Vm Ki
α β e (V-Vmodelo)
2 R2
I = Galactose (UI) (g/L)
Competitiva 0,77 4,94 - - 0,0436 98%
Não 
Competitiva
0,76 20,66 - - 0,1229 93%
Acompetitiva 0,73 17,09 - - 0,1882 89%
Mista Linear 1
-
7318316
23421 - 0,3911 76%
Parcialmente 
Não 
Competitiva
1 1848874 -
-
43066
0,1446 92%
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Estabilidade da enzima Invertase Livre e Imobilizada em 
Duolite A-568 em Relação ao pH 
Fonte: Dissertação de Mestrado 
de Líbia Diniz Santos Marquez
Enzima 
Imobilizada Enzima Livre
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Estudo da inibição para a enzima invertase imobilizada em 
Duolite A-568 (resina de troca iônica)
Fonte: Dissertação de Mestrado 
de Líbia Diniz Santos Marquez
Inibição pelo 
substrato
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REATORES ENZIMÁTICOS
➢A princípio, era disponível apenas de enzima na forma livre e solúvel, o único tipo de
reator utilizável era o de batelada;
➢Contudo, como advento das enzimas imobilizadas, surgiu a possibilidade de se utilizar
outros tipos de reatores.
Batelada
Em processos onde, terminada a reação, a enzima
imobilizada pode ser separada da mistura final com
relativa facilidade
Exemplo: filtração e decantação.
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Contínuo
➢Entrada e saída contínua de fluido.
➢Eventualmente uma certa quantidade de enzima pode
ser arrastada no efluente, devendo-se, por isso,
acoplar na saída um sistema que permita recuperá-la.
Exemplo: filtração, decantação.
Leito Fixo
A enzima imobilizada é empacotada, permanecendo 
estacionária, enquanto a solução de substrato é bombeada
através dela.
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Leito Fluidizado
➢A enzima imobilizada nesse caso encontra-se em suspensão no interior do reator, 
sendo a solução de substrato bombeada através dela.
➢A velocidade de fluxo da solução de substrato é tal, que impede a deposição das 
partículas no fundo do reator, e é fraca o suficiente para evitar que as mesmas sejam 
arrastadas no efluente.
Obrigado!
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	Efeitos da Imobilização sobre as enzimas
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