Estudo Dirigido Imobilização de enzimas

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Enzimologia
Estudo Dirigido: Imobilização de enzimas
1.
 A enzima fica retida no interior (poros) ou na superfície de um material que é utilizado como suporte. O complexo enzima–suporte mantém as características físicas do suporte e, ao mesmo tempo, retém a atividade biológica da enzima na forma solúvel. 
	O termo “enzima imobilizada” inclui: A modificação das enzimas de forma a torná-las insolúveis em água; A utilização de enzimas na forma solúvel em reatores equipados com membranas de ultrafiltração, que emitem o escoamento dos produtos da reação, mas retêm a enzima no interior do reator; A restrição da mobilidade da enzima pela ligação a outra molécula, que torna o sistema insolúvel no meio de reação. O sistema imobilizado permite a condução de reações em reatores contínuos, com fácil separação de catalisador–produto, e o aumento da produtividade do processo (massa de substrato/massa de biocatalisador).
2. 
A classificação se dá pelo tipo de interação responsável pela imobilização, que pode ser conseguida por meios químicos (com formação de, no mínimo, uma ligação covalente entre os resíduos terminais de uma enzima e um grupo funcional do suporte, ou entre duas ou mais moléculas de enzima) ou por meios físicos, que não envolvem ligações químicas, porém somente forças físicas (adsorção, interações eletrostáticas e outras) como também, a encapsulação ou microencapsulação em matrizes poliméricas; e a natureza dos suportes – que podem ser porosos ou não-porosos, orgânicos ou inorgânicos.
3.
 Existem basicamente duas formas de reter uma enzima no interior dos biorreatores: imobilização de enzima no interior de um suporte (encapsulação e retenção por meio de membranas); e, a imobilização na superfície de um suporte (ligação covalente e não-covalente). Para os vários métodos disponíveis no que respeita à estabilização de enzimas imobilizadas, devem ser consideradas a estabilidade no armazenamento e a estabilidade operacional. A estabilidade no armazenamento, ou tempo de meia-vida, refere-se à capacidade de uma enzima manter a sua capacidade catalítica durante o período entre a produção e o seu uso. A estabilidade operacional descreve a manutenção da atividade catalítica da enzima durante a reação. 
4. 
A interação entre esses dois componentes proporciona um derivado imobilizado com propriedades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas específicas. Dentre os vários parâmetros que devem ser considerados os mais importantes incluem pH, temperatura, força iônica, pressão, agitação, liberação de cofatores e do substrato com a remoção dos produtos. Estes fatores influem no desempenho do suporte, na conformação da enzima, na velocidade de transferência de massa e de reação intrínseca, e, portanto, afetam o comportamento da enzima imobilizada.
5. 
Um suporte criteriosamente selecionado pode aumentar o tempo de meia-vida da enzima imobilizada, de outro uma escolha errada pode afetar adversamente não só o tempo de meia-vida, mas o desempenho global do sistema. Na seleção de um suporte para uma determinada aplicação, devem ser analisadas suas propriedades físicas e químicas, bem como as relativas à possibilidade de regeneração do material.
	Características morfológicas: possibilitar a imobilização de quantidades significativas de enzima, alta porosidade e poros de pequeno diâmetro, mas que permitam o fácil acesso da enzima e do substrato.
	Características químicas: grupos químicos que possam ser ativados ou modificados de modo a permitir a ligação da enzima em condições que não a desnaturem.
	Natureza hidrofílica: a água do meio se particiona entre a matriz de imobilização, a enzima e o meio de reação, afetando o seu microambiente. São desejáveis suportes com características hidrofílicas de modo a se obter uma boa difusividade do substrato, além de permitir a estabilização da enzima. Suportes hidrofóbicos diminuem a estabilidade e a atividade da enzima imobilizada por um mecanismo semelhante à desnaturação das enzimas em solventes orgânicos. 
	Insolubilidade: prevenir a liberação da enzima do suporte, evitar a contaminação do produto, pelo suporte dissolvido e pela enzima. 
	Estabilização química, mecânica e térmica: estratégias de estabilização enzimática, características físicas e químicas podem ser controladas diretamente na reação de catálise. Este controle baseia-se em múltiplas interações iônicas ou armadilhas físicas e na imobilização covalente de enzimas a outras proteínas ou superfícies sólidas, através de formação de ligações covalentes (intra e interenzimáticas), polimerização enzimática, ligação covalente com outras proteínas, imobilização em superfícies sólidas, estabilização da nanoconcavidade enzimática usando a mutagênese dirigida com alterações em locais específicos, aumento da lipofilia do centro ativo e/ou remoção de grupos reativos.
	Estabilidade ao escoamento: pequenas variações de pressão, boas características de escoamento do fluido intersticial. Uma estrutura rígida de poros (matriz rígida) protege a enzima de situações de escoamento turbulento.
	Resistência ao ataque microbiológico: resistência à degradação por microrganismos, de modo a evitar a liberação da enzima para a solução.
	Regenerabilidade: regeneração e o reciclo da matriz.
	Os suportes inorgânicos são mais apropriados para uso industrial por apresentarem elevada resistência mecânica, boa estabilidade térmica, resistência a solventes orgânicos e ao ataque por microrganismos. Eles são de fácil regeneração por pirólise e apresentam boa rigidez da matriz, sendo estáveis em uma ampla faixa de pressões, temperaturas e pH. Entretanto, a maioria das enzimas imobilizadas comercializadas é obtida com matrizes orgânicas devido, provavelmente, à variedade de grupos funcionais reativos que podem ser introduzidos nesses suportes.
6. 
O método se baseia na diferença de tamanho entre as moléculas do catalisador e do soluto. Pode ocorrer de duas formas: formação de uma estrutura porosa na presença da enzima, envolvendo-a em uma estrutura tridimensional, ou a retenção do biocatalisador por uma membrana porosa. 
	Vantagens: A enzima tem sua mobilidade mantida, pois não são envolvidas ligações físicas ou químicas entre a enzima e o suporte. Grande área superficial de contato e possibilidade de imobilização de mais de uma enzima em uma única etapa. 
	Desvantagem: Somente substratos de baixo peso molecular podem ser empregados com este tipo de enzima imobilizada. Este método inclui a encapsulação em gel e em fibras e a microencapsulação.
	O método de encapsulação em gel envolve a retenção da enzima no interior de uma matriz polimérica insolúvel no meio de reação (hidrogel). A preparação de enzimas imobilizadas no interior de fibras pode ser realizada pela dissolução de um polímero capaz de precipitar na forma de filamentos. No interior do polímero são retidas microgotas contendo a enzima.
7. 
A enzima pode ser permanentemente fixada na superfície de um suporte por meio de interações como a adsorção física, a ligação iônica, as ligações covalentes e a ligação a um metal (quelação). 
	Adsorção física: Consiste em colocar em contato a solução da enzima em água com o suporte (superfície adsorvente), em determinadas condições de pH, temperatura e agitação.
Após a imobilização o suporte é lavado para remoção das moléculas de enzima que não foram adsorvidas. Atração da enzima pela superfície do suporte por meio das forças de Van der Waals, que são fracas, o que permite a desadsorção da enzima durante a utilização. Não é específico e algumas vezes pode provocar a inativação parcial ou total da enzima.
	Ligação iônica: Baseia-se na atração da enzima pelo suporte sólido que contém íons residuais. As interações íon–íon são mais fortes do que as forças de Van der Waals, porém mais fracas que a ligação covalente. A preparação do derivado imobilizado é feita da mesma forma que no processo de adsorção física, isto é, coloca-se em contato a solução enzimática com o suporte. Também, neste caso, pode ocorrer aliberação da enzima pelo suporte, o que contamina o produto final e reduz a atividade específica do biocatalisador.
	Ativação da superfície do suporte com metais de transição: ligação com metais ou quelação, formando um quelato entre a enzima e a superfície ativa do suporte. Embora a preparação de enzimas imobilizadas por este método seja bastante simples, estando envolvidas somente duas etapas (ativação do	suporte e imobilização da enzima), a estabilidade operacional obtida, quando se trabalha com substratos de alta massa molecular, é baixa, devido aos metais envolvidos.
	Ligação covalente: baseia-se na formação de uma ligação forte entre a enzima e o suporte. A seleção das condições de imobilização é mais difícil do que nos outros métodos. O método é mais complexo e utiliza condições menos brandas do que os demais. Como a ligação formada é forte, a enzima imobilizada obtida por este método é estável, isto é, não se solta do suporte em presença do substrato ou de soluções de alta concentração iônica.
8. 
Formação de várias ligações covalentes entre a enzima e vários grupos ativos do suporte. A interação se dá entre grupamentos amino da enzima e grupos aldeído alifáticos pequenos do suporte.
	Vantagens: aumento da atividade e da estabilidade em comparação a enzimas imobilizadas unipontualmente.
9. 
Pequenas variações no meio reacional, tais como temperatura, pH e força iônica, podem induzir modificações estruturais na enzima, desativando-a. Esta desnaturação decorre da exposição da parte hidrofóbica da enzima à água, o que promove um aumento do nível de hidratação da enzima. A remoção da água da superfície da enzima por aditivos hidrofílicos (como polióis e polissacarídeos) permite a manutenção da estabilidade da enzima em meio aquoso. 
	Desvantagens: aumento das limitações difusionais à transferência de massa de substratos e produtos, uma vez que se introduz mais uma fase (orgânica) além da fase aquosa (e de uma fase sólida se a enzima estiver imobilizada); toxicidade do solvente orgânico para a enzima; possibilidade de mudanças conformacionais na enzima.
10.
 Perda da atividade durante o processo de imobilização: Binômio que se busca: termoestabilidade – atividade específica elevada. Utilizar concentrações elevadas das enzimas em relação ao suporte. Proteger os sítios ativos das enzimas.
	Efeitos difusionais (transferência de massa): Limitações de acesso aos substratos, acúmulo de produtos pode afetar a cinética da reação. 
	Características físicas do biocatalisador e do fluido: Normalmente as enzimas imobilizadas devem ser utilizadas quando o substrato é solúvel. Quando as enzimas estão retidas no interior de matrizes porosas, os poros devem facilitar o livre acesso do substrato e reter ao mesmo tempo a molécula de enzima no seu interior.
	Estabilidade do biocatalisador: Alguns processamentos podem diminuir a meia-vida do biocatalisador. Os substratos utilizados nas reações enzimáticas contêm substâncias em suspensão, lipídios, que podem se adsorver ao suporte e bloquear os poros, diminuindo a acessibilidade do substrato à enzima e promovendo uma redução aparente do tempo demeia-vida da enzima imobilizada. Deve-se purificar os substratos antes de alimentar o biorreator.
	
11. 
Uso das enzimas imobilizadas nos campos industrial, analítico, médico, química fina, entre outros. Dentre as aplicações de enzimas imobilizadas em larga escala, e que são consideradas um sucesso, pode-se citar: a produção de xaropes de glicose e frutose a partir de amido de milho; a produção de acrilamida empregando células imobilizadas; a produção de aspartame com a termolisina imobilizada; e a hidrólise da lactose presente no soro de queijo.